高效反硝化聚磷菌的篩選及其脫氮除磷條件和性能研究

袁野 周佳 屈建航 張博源 羅宇 李海峰

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450000）

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，食品加工廢水已經(jīng)成為污水處理的重要對象，如屠宰及肉類加工廢水［1］、豆制品廢水［2］、餐廚廢水［3］、檸檬酸生產(chǎn)廢水［4］等，該類廢水的主要特征為高氮高磷、生化需氧量高、懸浮物多。其中氮和磷是引起水體富營養(yǎng)化的限制性因素［5］。

食品加工廢水的處理多采用生物法以無氧/好氧階段交替完成［6］，處理過程依賴于不同功能的微生物，如硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和聚磷生物（polyphosphate accumulating organisms，PAOs）的共同作用，往往需要額外添加碳源來提高氮和磷的去除效率，增加運(yùn)行成本［7］。反硝化聚磷菌（denitrifying phosphate accumulating organisms，DPAOs）是一種具有獨(dú)特代謝特性的反硝化細(xì)菌［8］，在消耗可用碳源時細(xì)胞產(chǎn)生并儲存聚β-羥基丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB），當(dāng)外部碳源耗盡時，PHB可作為碳源使用，而在缺氧條件下，細(xì)胞利用亞硝酸鹽/硝酸鹽作為電子受體積累磷酸鹽［9］，從而減少氧氣需求、污泥產(chǎn)生以及和不同功能菌間的碳源競爭，有效緩解廢水處理工藝的壓力，提升氮磷去除效果。

目前報道的反硝化聚磷菌，種類逐步多樣化，如篩選自缺氧池中的陶厄氏菌（Thauera）［10］、好氧生物反應(yīng)器活性污泥的大腸桿菌（Escherichia coli）［11］、馴化后活性污泥中的戴爾福特菌（Delftia tsuruhatensis）［12］、污染沉積物中的斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）［13］，以及產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、腸桿菌屬（Enterobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和芽胞桿菌屬（Bacillus）等［14］。高效反硝化聚磷菌株的篩選是脫氮除磷深入研究和應(yīng)用開發(fā)的菌物基礎(chǔ)，但當(dāng)前的菌種能力仍有非常大的提升和挖掘空間［15］。另一方面，反硝化聚磷菌應(yīng)用于強(qiáng)化生物脫氮除磷，尤其是針對高氮高磷類廢水，研究仍相對薄弱。

本研究擬從二沉池活性污泥中篩選出高效反硝化聚磷菌，通過單因素等實(shí)驗確定其最佳工藝條件，并將其應(yīng)用于不同類型食品模擬廢水的處理，以期為實(shí)際廢水的處理提供菌物參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 活性污泥樣品取自河南省某污水處理廠二沉池，采用取樣器收集泥水充分混合液，4℃帶回實(shí)驗室使用。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱，博訊實(shí)業(yè)有限公司；SIGMA3-30K高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma Laborzentrifugen公司；C1000 Touch PCR儀，美國Bio-Rad；721型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［16］（g/L）：蛋白胨10.00，牛肉膏3.00，氯化鈉5.00，pH 7.20。

R2A培養(yǎng)基［17］（g/L）：酵母浸出物0.50，胰蛋白胨0.50，酪氨酸0.50，葡萄糖0.50，可溶性淀粉0.50，K2HPO40.30，MgSO4·7H2O 0.05，丙酮酸鈉0.30，瓊脂15.00，pH 7.20-7.40。

1% BTB-反硝化培養(yǎng)基［14］（g/L）：乙酸鈉 3.01，KNO32.00，MgSO4·7H2O 0.20，瓊脂13.50，1%-BTB 4.00 mL，pH 7.20-7.40。

富氮富磷培養(yǎng)基［16］（g/L）：乙酸鈉 3.32，MgSO4·7H2O 0.10，CaCl20.03，K2HPO40.06，NH4Cl 0.31，KNO30.29，NaCl 0.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

微量元素［16］（g/L）：乙二胺四乙酸二鈉63.70，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.00，CuSO4·5H2O 1.60，MnCl2·4H2O 5.10，CaCl25.50，ZnSO4·7H2O 2.20，鉬酸鈉1.10，CoCl2·6H2O 1.60，pH 7.20-7.40。

1.1.4 模擬廢水 屠宰及肉類加工廢水［1］（g/L）：乙酸鈉 3.34，尿素0.05，K2HPO40.08，NH4Cl 0.38，KNO30.22，NaCl 0.07，CaCl20.05，MgSO4·7H2O 0.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

檸檬酸廢水［4］（g/L）：乙酸鈉1.28，NH4Cl 0.12，KNO30.15，K2HPO40.03，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

豆制品廢水［2］（g/L）：乙酸鈉 3.85，NH4Cl 0.38，KNO30.36，K2HPO40.08，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

餐廚廢水［3］（g/L）：花生油0.05，洗滌劑0.05，乙酸鈉1.28，NaCl 0.15，NaHCO30.03，NH4Cl 0.29，KNO30.22，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O 0.01，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

1.2 方法

1.2.1 反硝化聚磷菌的篩選 10 g泥樣于裝有玻璃珠的90 mL無菌水中，充分振蕩30 min后靜置，取1 mL十倍梯度稀釋涂布于R2A培養(yǎng)基，設(shè)置平行。28℃培養(yǎng)3-4 d，挑取單菌落三區(qū)劃線法純化，點(diǎn)接于1% BTB-反硝化培養(yǎng)基，顯藍(lán)菌株為初篩菌。

初篩菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，無菌水洗滌，重懸調(diào)OD600為1.0。以8%（V/V）接種于富氮富磷培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，定時取樣，離心取上清，分別用鉬酸銨分光光度法測定總磷（TP）含量（《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 11893-89》），用紫外分光光度法測定硝酸鹽氮（NO3--N）含量（《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ/T 346-2007》），用納氏試劑分光光度法測定氨氮（NH4+-N）含量（《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ 535-2009）》，完成復(fù)篩。

1.2.2 菌種鑒定 對篩選的高效反硝化聚磷菌，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定［18］。堿裂解法提取菌體DNA，以E.coli27F和1492R為引物PCR擴(kuò)增16S rRNA基因［19］，瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行核苷酸序列測定，NCBI數(shù)據(jù)庫比對并下載相似度高的序列，MEGA 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［20］。

1.2.3 生長曲線和脫氮除磷曲線測定 以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基接種菌株D4，150 r/min、28℃培養(yǎng)48 h，離心后無菌水洗滌并重懸（OD600=1.0），以8%（V/V）的接種量接種于富氮富磷培養(yǎng)基，150 r/min、28℃培養(yǎng)，每6 h測OD600及上清液中TP、NO3--N及NH4+-N含量，繪制生長曲線和脫氮除磷曲線。

1.2.4 脫氮除磷條件單因素試驗 以富氮富磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別考察碳源（葡萄糖、檸檬酸鈉、淀粉、丁二酸鈉、乙酸鈉）、乙酸鈉濃度（0.76、1.51、2.26、3.32、4.53 g/L）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，滅菌后用HCl和NaOH調(diào)節(jié)）、接種量（2%、5%、8%、10%、15%）、溫度（20、28、34、37、42℃）和初始磷含量（10、15、20、30、40 mg/L）等單因素水平對菌株脫氮除磷能力的影響。接入菌體為無菌水洗滌后重懸液（OD600為1.0）。28℃（除溫度梯度實(shí)驗外）培養(yǎng)48 h，取樣離心，測上清液TP、NO3--N及NH4+-N含量。

依據(jù)單因素實(shí)驗及顯著性分析結(jié)果，使用Expert Design 11.0對顯著影響D4脫氮除磷效率的溫度、pH和初始磷含量進(jìn)行編碼，以總磷去除量為響應(yīng)值，設(shè)置N=17的3因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗（表1）。對總磷去除量進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)生成的響應(yīng)面圖確定最優(yōu)工藝條件，完成驗證試驗。

表1 反硝化聚磷菌三因素三水平表Table 1 Three factors and three levels of denitrifying phosphorus-accumulating bacteria

1.2.5 模擬廢水的脫氮除磷性能研究 分別以屠宰及肉類加工廢水、檸檬酸廢水、豆制品廢水、餐廚廢水為對象，研究菌株D4對食品加工廢水的脫氮除磷效果。無菌水洗滌重懸后（OD600=1.0）的D4菌液按5%（V/V）分別接種至200 mL各模擬廢水，28℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔12 h取樣，測定各模擬廢水中的TP、TN、NH4+-N含量，繪制脫氮除磷曲線。

2 結(jié)果

2.1 反硝化聚磷菌的篩選結(jié)果

通過初篩和復(fù)篩，得到一株高效反硝化聚磷菌株D4，在富氮富磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，菌株D4的總磷去除量為7.33 mg/L，硝氮去除量為33.93 mg/L，氨氮去除量為58.65 mg/L。

2.2 菌種鑒定結(jié)果

反硝化聚磷菌D4在R2A培養(yǎng)基上，呈圓形、橙紅色、表面光滑、不透明，菌體細(xì)胞為短桿狀或近球狀，革蘭氏染色陽性，吲哚、V-P實(shí)驗、硝酸鹽還原實(shí)驗陽性，甲基紅實(shí)驗陰性，不能水解淀粉和尿素，不能使明膠液化。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示（圖1），菌株D4與Gordonia hongkongensisHKU50（NR_152022.1）的親緣關(guān)系最近（同源性99.38%），結(jié)合生理生化特點(diǎn)，初步確定D4為戈登氏菌（Gordoniasp.）。

圖1 菌株D4的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA genes of strain D4

2.3 反硝化聚磷菌D4的生長曲線和脫氮除磷曲線

菌株D4生長曲線及脫氮除磷曲線如圖2所示。在富氮富磷培養(yǎng)基中，約0-12 h為生長延滯期，對氮磷元素的消耗維持在較低水平；12-36 h為對數(shù)生長期，對氮磷的去除量逐步提高；36 h后生長趨向平穩(wěn)，對氮磷的去除量也維持在相對穩(wěn)定水平。

圖2 菌株D4的生長曲線和脫氮除磷曲線Fig.2 Growth and nitrogen and phosphorus removal curves of strain D4

2.4 脫氮除磷條件單因素實(shí)驗結(jié)果

2.4.1 碳源 不同碳源對菌株D4的脫氮除磷影響結(jié)果表明（圖3），同濃度條件下，乙酸鈉為菌株D4脫氮除磷的最佳碳源，檸檬酸鈉次之。對最佳碳源乙酸鈉，設(shè)置不同濃度，結(jié)果表明，當(dāng)乙酸鈉濃度為3.32 g/L時，D4對總磷、硝氮和氨氮的去除量分別為8.94、28.82和64.32 mg/L，該條件下的除磷效果與乙酸鈉4.53 g/L時的差異性不顯著（P＞0.05）。當(dāng)乙酸鈉濃度低于3.32 mg/L時，可能由于碳源不足影響菌株的生長進(jìn)而影響了菌株的脫氮能力。因此選取3.32 g/L乙酸鈉為最佳碳源。

圖3 碳源及碳源濃度對菌株D4脫氮除磷效率的影響Fig.3 Effects of carbon sources and carbon source concentration on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of strain D4

2.4.2 接種量 接種量對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖4所示。5%接種量時，菌株對總磷、硝氮和氨氮去除量最佳，分別為8.94、31.64和62.35 mg/L。接種量低于5%時，菌株可以正常除磷，但脫氮效果受到影響，而接種量高于5%時，菌株對氨氮的去除量逐漸降低。因此選擇5%為菌株最佳接種量。

圖4 接種量對D4脫氮除磷效率的影響Fig.4 Effects of inoculum size on nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.3 初始磷含量 初始磷含量對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖5所示，15 mg/L初始磷含量條件下，菌株D4的脫氮除磷效果最佳，對總磷、硝氮和氨氮的去除量分別為12.89、32.43和62.24 mg/L。初始磷含量低于15 mg/L時，菌株的除磷能力受到限制，當(dāng)初始磷含量較高時，菌株的去除硝態(tài)氮能力降低。因此選擇15 mg/L為最適初始磷含量。

圖5 初始磷含量對D4脫氮除磷效率的影響Fig.5 Effects of initial phosphorus concentration on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.4 溫度 溫度對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖6所示。28℃培養(yǎng)時，D4對氮磷去除量最高，對總磷、硝氮、氨氮的去除量分別為7.71、28.69和57.41 mg/L，低溫不利于該菌株對磷和氨氮的去除，而溫度過高不利于該菌株對硝氮的去除。因此選取28℃為菌株D4脫氮除磷的最適溫度。

圖6 溫度對D4脫氮除磷效率的影響Fig.6 Effects of temperature on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.5 pH pH值對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖7所示。pH 7-8更有利于菌株脫氮除磷，pH 8時，菌株對總磷、硝氮、氨氮的去除量分別為7.89、32.23和58.59 mg/L，此時D4的脫氮除磷能力稍高于pH 7和pH 9時，而當(dāng)pH值低于7時，菌株除磷能力降低且?guī)缀醪痪哂忻摰芰?，可能是酸性環(huán)境不利于菌株生長，從而影響了其脫氮除磷能力。選擇pH 8為D4脫氮除磷的最適pH。

圖7 pH對D4脫氮除磷效率的影響Fig.7 Effects of pH on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.5 脫氮除磷條件的綜合優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗結(jié)果及顯著性分析（表2），設(shè)置N=17的三因素三水平Box-Behnken實(shí)驗，通過實(shí)驗擬合，得到總磷去除量（Y）對溫度（A）、pH（B）、初始磷含量（C）3個因素的二次多項回歸方程為：

表2 顯著性分析結(jié)果Table 2 Significance analysis results

Y=14.26+1.35A+0.5055B+2.60C-0.6770AB+1.31AC+0.0310BC-1.37A2-1.39B2-1.45C2

根據(jù)方差分析（表3），該模型的P＜0.01，說明此模型極顯著。模型系數(shù)R2為96.59%，表明該模型與實(shí)際情況擬合良好，具有統(tǒng)計學(xué)意義，可以用來預(yù)測反硝化聚磷菌實(shí)現(xiàn)最大氮磷去除量的實(shí)驗條件。3個因素對總磷去除量的影響順序為初始磷含量＞溫度＞pH，其中溫度和初始磷含量對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），pH對響應(yīng)值的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic model

用Design-Expert 11.0軟件對響應(yīng)面實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行繪圖（圖8）表明，隨著溫度和pH的升高，D4對總磷去除量先增加后減少，溫度和pH之間存在著較強(qiáng)的交互作用；隨著溫度和初始磷含量的升高，D4對總磷去除量先增加后減少。隨著pH和初始磷含量的升高，菌株D4對總磷去除量先增加后減少；當(dāng)溫度、pH值和初始磷含量分別為31.3℃、pH 7.9、18.61 mg/L時，響應(yīng)值最大，預(yù)測總磷去除量為16.20 mg/L。

圖8 各因素交互作用對總磷去除量的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors on total phosphorus removal

對響應(yīng)面法得到的最佳脫氮除磷條件進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，菌株D4對總磷、硝氮和氨氮的實(shí)際去除量分別為14.18、39.67 和69.71 mg/L，總磷去除量與預(yù)測值基本吻合，三者的去除量比優(yōu)化前分別提高了6.85、5.74和11.06 mg/L。

2.6 菌株D4對食品模擬廢水的脫氮除磷效果

菌株D4對不同食品模擬廢水的脫氮除磷結(jié)果表明（圖9），D4對豆制品廢水脫氮除磷效果最好，總磷、總氮和氨氮的去除量分別達(dá)到11.05、101.58和100.28 mg/L；對屠宰廠及肉類加工廢水中的總磷、總氮和氨氮的去除量次之，分別為10.40、92.73和77.70 mg/L；對檸檬酸廢水中的總磷、總氮和氨氮的去除量分別為5.48、21.33和19.95 mg/L。對餐廚廢水中的總磷、總氮和氨氮的去除量分別為3.48、31.19和22.33 mg/L。

圖9 菌株D4對不同模擬廢水中總磷（a）、總氮（b）、氨氮（c）的去除量Fig.9 Removed amount of total phosphorus (a), total nitrogen (b), ammonia nitrogen (c) in different simulated wastewater by bacterial strain D4

3 討論

當(dāng)前廢水處理所用的反硝化聚磷菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、戴爾福特菌（Delftia tsuruhatensis）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和陶厄氏菌（Thauera）等［10-14］。本研究所篩選的高效反硝化聚磷菌戈登氏菌（Gordoniasp.），有報道用于脫硫和烴類降解［21］以及污染物的生物修復(fù)等方面［22］，關(guān)于廢水脫氮除磷的研究少有報道。

不同菌株對營養(yǎng)和環(huán)境的要求有所不同。本研究結(jié)果表明，在不同碳源條件下，戈登氏菌D4的生長和脫氮除磷能力均受到影響，乙酸鈉為碳源時其脫氮除磷能力最佳，與其他脫氮除磷菌相似，如不動桿菌（Acinetobactersp.）［14］等。接種量5%最佳，過低時導(dǎo)致微生物生物量較低，使脫氮除磷能力受到限制，當(dāng)接種量過高時，則可能出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)不足難以維持微生物的生長，從而影響脫氮效率［11］。初始磷含量影響微生物的生長和除磷效率，當(dāng)初始磷含量低于15 mg/L時，體系中總磷含量低于D4的最大除磷能力，所以菌株的除磷能力受到限制，當(dāng)初始磷含量超過20 mg/L并逐漸升高時，D4的除磷能力沒有受到顯著影響，脫氮能力有所降低，這一現(xiàn)象與Xu［11］等篩選出的大腸桿菌（Escherichia coli）J16恰好相反。已有研究表明，反硝化聚磷菌可以利用NO3-、NO2-和O2作為電子受體進(jìn)行脫氮作用［23］。在厭氧條件下，胞內(nèi)多聚磷酸鹽（ploy-P）水解為PO43-釋放到環(huán)境中，在好氧或缺氧條件下以O(shè)2或NO3-、NO2-為電子受體，同時吸取環(huán)境中的PO43-合成ploy-P儲存在胞內(nèi)。在此過程中菌株受到硝酸還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶等多種酶類調(diào)節(jié)［24］，因此對外界環(huán)境因素變化較為敏感。本研究中，溫度低于28℃時，菌株的除磷能力受到影響，當(dāng)溫度超過34℃時，菌株對硝態(tài)氮的去除能力隨著溫度的升高而越低。在pH 5-8，隨著pH的升高，D4的脫氮除磷能力也逐漸升高，且pH 8時D4的脫氮除磷效果最好。目前已報道的多數(shù)反硝化聚磷菌的最適生長溫度均較為溫和（25-37℃），最適pH值為中性或弱堿性（pH 6-9）［25-26］。

脫氮除磷能力方面，當(dāng)前所報道的反硝化聚磷菌還遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求。有研究表明，一般食品加工廢水中總磷含量約為20-100 mg/L，總氮含量約為100-400 mg/L［27-28］，這些廢水在經(jīng)過濾、調(diào)節(jié)pH和生物厭氧發(fā)酵分解后，進(jìn)入生物反應(yīng)池進(jìn)行脫氮除磷，但目前報道的反硝化聚磷菌脫氮除磷能力還有待提高。聶毅磊等［29］篩選出的Achromobactersp.以琥珀酸鈉為唯一碳源，28℃培養(yǎng)30 h的除磷量為1.97 mg/L，脫氮量為2.76 mg/L，靳茹［30］篩選出的大腸桿菌以乙酸鈉為唯一碳源，30℃培養(yǎng)24 h的除磷量為8.01 mg/L，脫氮量為62.10 mg/L。王春雷［16］篩選出的反硝化聚磷菌株J3以乙酸鈉為唯一碳源，30℃培養(yǎng)7 d的除磷量為3.00 mg/L，脫氮量為30.10 mg/L。本研究中戈登氏菌D4以乙酸鈉為唯一碳源，31.3℃培養(yǎng)48 h的除磷量為14.18 mg/L，對硝態(tài)氮和氨氮的去除量分別為39.67 mg/L和69.71 mg/L，相應(yīng)去除率為84.50%、97.67%和96.22%，在廢水脫氮除磷能力上具有較大的優(yōu)勢，且對高氮高磷廢水的處理有良好效果，具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究篩選出一株高效反硝化聚磷菌株戈登氏菌（Gordoniasp.）D4，最佳脫氮除磷條件為3.32 g/L乙酸鈉為碳源、接種量5%、初始磷含量18.61 mg/L、31.3℃、pH 7.9，此條件下對總磷、硝氮、氨氮去除量分別達(dá)14.18、39.67和69.71 mg/L。該菌株對屠宰及肉類加工廢水、檸檬酸廢水、豆制品廢水及餐廚廢水等均具有良好的脫氮除磷效果。