基于宏基因組技術(shù)的聚磷菌研究進展

徐 媛 ， 陳禹保*

(1.北京市計算中心，北京 100094；2.北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100094)

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基于宏基因組技術(shù)的聚磷菌研究進展

徐 媛1，2， 陳禹保1，2*

(1.北京市計算中心，北京 100094；2.北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100094)

聚磷菌是一類非常重要的工程菌，廣泛應(yīng)用于污水處理廠生物除磷過程。聚磷菌可以吸收超過自身所能利用的數(shù)倍的磷，在體內(nèi)合成聚磷化合物從而達到生物除磷的目的。在過去的幾年里，宏基因組學以及測序技術(shù)的發(fā)展大大推動了對聚磷菌物種組成及其磷代謝過程的認識。本文主要對宏基因組技術(shù)進行介紹并對近幾年基于宏基因組技術(shù)深入研究聚磷菌的文章進行綜述，以期對這類重要的微生物的生理功能、代謝途徑和物種多樣性進行全面的了解。

聚磷菌；宏基因組；代謝途徑

聚磷菌是一類特殊微生物的統(tǒng)稱，廣泛存在于活性污泥中，是一類非常重要的工程菌。在好氧/厭氧交替的條件下可以吸收遠遠超過其自身所能利用的磷，并以聚磷物的形式存在于細胞內(nèi)，達到生物除磷的目的。通過對厭氧裝置和好氧裝置中的化學元素進行測定[1]，人們對活性污泥中微生物除磷代謝過程有了初步的認識。在厭氧階段，聚磷菌吸收污水中的小分子有機物(主要是揮發(fā)性脂肪酸，VFA)，將其轉(zhuǎn)化為聚羥基烷酸(PHA)儲存在細胞內(nèi)，同時釋放出磷，這個過程所需的能量來自于分子內(nèi)聚磷和糖原的水解。好氧階段，聚磷菌氧化其積累的大量PHA，釋放能量，吸收超過自身所需的磷，并在體內(nèi)合成聚磷和糖原，最后通過排放剩余污泥達到除磷的效果。盡管聚磷菌用于污水除磷已經(jīng)有幾十年的歷史，但是應(yīng)用聚磷菌進行污水去磷的系統(tǒng)還是不穩(wěn)定，人們在應(yīng)用的過程中還是會遇到一些不能預知和不能解決的問題。了解哪類微生物參與了污水除磷過程以及它們是如何工作的，可以為研制更好的除磷裝置提供理論基礎(chǔ)，也可以更有效地解決除磷過程中遇到的問題。聚磷菌的分離培養(yǎng)非常困難，至今為止還沒有一株純培養(yǎng)物，限制了人們對其生理過程的認識。宏基因組技術(shù)的發(fā)展，促進了人們對這類特殊微生物的認識。宏基因組技術(shù)主要以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以測序分析為研究手段，研究環(huán)境中微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)和功能活性等。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學已經(jīng)成為微生物研究領(lǐng)域一項非常普遍的研究方法。目前有兩種主要的研究策略，基于單一基因的靶向測序研究策略和基于全基因組的研究策略，前者只關(guān)注單一基因，目前應(yīng)用最多的是16S rDNA基因，此基因進行高通量測序，可以對微生物種群結(jié)構(gòu)進行分析，但是對其功能的分析仍欠缺。后者可以同時進行物種多樣性和功能多樣性的分析。本文主要就近年來基于宏基因組技術(shù)對聚磷微生物及其除磷過程的研究進行綜述，以對其研究進展做全面了解。

1 基因組信息

Martín等[2]通過對強化生物除磷工藝(EBPR)污泥中的聚磷菌進行富集培養(yǎng)，分別得到了以乙酸和丙酸為碳源的聚磷菌的富集物，來自美國威斯康辛州的污泥富集物含有80%的聚磷菌，來自澳大利亞昆士蘭的污泥富集物含有60%的聚磷菌，對兩個富集物進行宏基因組測序，得到聚磷菌的基因組草圖。盡管這兩個活性污泥的培養(yǎng)方式和來源都不同，但是主要的聚磷菌菌株共同擁有95%的基因。通過后續(xù)的測序、拼接和注釋，得到了威斯康辛富集物中聚磷菌的全基因組，命名為Candidatus Accumulibacter clade IIA str. UW-1。這株菌含有1個5.06 Mbp染色體和3個質(zhì)粒，整個菌株基因組大小為5.31 Mbp，含有4 735個基因，3 000多個基因具有明確的功能注釋信息，可以完成對整個代謝通路的重建。Flowers等[3]通過宏基因組測序得到了另一株聚磷菌的基因組草圖，并把這株聚磷菌命名為Candidatus Accumulibacter Clade IA str. UW-2。盡管這兩株菌的16S rRNA序列有98%的一致性，但是全基因組信息卻有很大的差異，平均核苷酸同源性(ANI)只有78.3%。與UW-1不同的是，UW-2缺少氮固定和碳固定的基因，但是它們擁有共同的反硝化基因和聚磷代謝途徑。Skennerton等[4]通過宏基因組深度測序的方法得到了8個不同聚磷菌的基因組信息，其中7個聚磷菌在之前并沒有被測序過。通過比較基因組學的研究發(fā)現(xiàn)，這些聚磷菌除了擁有共同的碳代謝和磷代謝外，每個聚磷菌還擁有大約700個特有的基因，主要區(qū)別在于硝酸鹽還原和反硝化過程等，作者認為這些代謝差異導致了聚磷菌的生態(tài)位分化并且為優(yōu)化脫氮除磷過程提供了新的機會。通過這些基因組信息，研究人員對聚磷菌的代謝途徑進行了深入研究。

1.1 碳代謝途徑

乙酸是研究EBPR系統(tǒng)的主要碳源，通過基因預測發(fā)現(xiàn)乙酸通透酶(ActP)通過質(zhì)子泵或者鈉離子泵在細胞膜上轉(zhuǎn)運乙酸。乙酸轉(zhuǎn)運到細胞膜內(nèi)后通過acs 或者AckA/pta 對其進行活化，acs 和AckA/pta 分別執(zhí)行高親和性和低親和性的乙酸激活，都可以與Actp形成基因簇。通過對蛋白組進行分析，發(fā)現(xiàn)acs是主要的基因激活途徑[5]。厭氧條件下，乙酸輔酶A利用糖原降解過程中提供的還原力NAD(P)H轉(zhuǎn)化為PHAs。聚磷菌的糖原降解途徑是EMP還是ED途徑一直存在爭論，通過對基因組信息的分析，發(fā)現(xiàn)聚磷菌缺少編碼ED途徑的基因，解決了這一問題。在轉(zhuǎn)錄水平對基因進行表達分析，也再一次證明了這個過程[6]。

好氧微生物通過TCA循環(huán)進行糖代謝產(chǎn)生能量，由基因組信息發(fā)現(xiàn)聚磷菌也具有TCA代謝過程，那么它們在厭氧條件下是否執(zhí)行TCA循環(huán)以及它們是如何做到的？Burow等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶SDH在厭氧條件下表達，并且當SDH被抑制后乙酸吸收和PHA產(chǎn)生的速率都會下降，暗示了在厭氧條件下TCA循環(huán)參與了NAD(P)H的產(chǎn)生。Zhou等[8]通過碳代謝通路測定實驗，發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下TCA循環(huán)依賴于糖原的濃度，說明完整的TCA循環(huán)參與了厭氧代謝過程中。

1.2 多聚磷酸鹽代謝途徑

基因分析發(fā)現(xiàn)2個磷酸鹽透性酶參與了低親和性的磷代謝系統(tǒng)(Pit)，3個非常保守的基因簇參與了高親和性的磷代謝系統(tǒng)(Pst)[2]。冗余的磷代謝系統(tǒng)保證了聚磷菌在高磷和低磷環(huán)境下都能高效地吸收磷。聚磷菌通過聚磷激酶ppk1以ATP為底物合成聚磷化合物，基因組分析發(fā)現(xiàn)，ppk1可以與外聚磷酸酶基因(ppx)和3′，5′二磷酸合成酶(RelA)形成ppx-ppk1-relA基因簇，共同調(diào)控聚磷化合物的合成。轉(zhuǎn)磷酸酶(PAP)可以轉(zhuǎn)移聚磷化合物的磷酸集團，使AMP磷酸化生成ADP，并進一步生成ATP。

1.3 硝酸鹽還原途徑

研究發(fā)現(xiàn)，聚磷菌在有硝酸鹽的情況下可以硝酸鹽為電子受體，而不需要氧氣，以反硝化過程釋放的能量進行聚磷。 但是，對得到的聚磷菌基因組進行分析，并沒有發(fā)現(xiàn)反硝化基因[2]。通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)了兩類形態(tài)不同的聚磷菌[9-10]，一類是以乙酸為底物富集的球形聚磷菌，它們不能以硝酸鹽做為電子受體；一類是以丙酸為底物富集的桿狀聚磷菌，它們可以硝酸鹽和亞硝酸鹽做為電子受體。Guisasola等[11]發(fā)現(xiàn)，以亞硝酸鹽為電子受體的污泥中主要以球狀聚磷菌為主，不能還原硝酸鹽。研究發(fā)現(xiàn)它們依賴于周圍的微生物為其提供亞硝酸鹽。Clade IIA屬于球狀聚磷菌，不能還原硝酸鹽，印證了基因組信息的發(fā)現(xiàn)。

1.4 聚磷菌的分子標簽基因

微生物生態(tài)學領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的分子標簽基因是16S rRNA基因，但是對于聚磷菌的研究發(fā)現(xiàn)，16S rRNA基因的靈敏度并不夠區(qū)分不同類型的聚磷菌[12]。16S～23S基因區(qū)間序列[12]、ppk1基因[12]、nirS基因[13]和phaC基因[14]都曾被用作分析標簽來研究環(huán)境中聚磷菌的多樣性分布。ppk1基因最終以穩(wěn)定性和高靈敏性得到了認可并廣泛應(yīng)用于科研工作中。ppk1基因在聚磷菌中只有一個拷貝，它的進化速度比16S rRNA基因快4倍，可以做為一個很好的分子標簽來區(qū)分聚磷菌[15]。通過對ppk1基因進行研究，McMahon 等[16]發(fā)現(xiàn)聚磷菌可以分為兩種類型(類型I和類型II)，并且ppk1基因的高分辨性可以使每個類型的聚磷菌分為多個亞型(類型IA～IE，類型IIA～IIF)，說明聚磷菌的多樣性遠遠大于之前發(fā)現(xiàn)的。通過16S rRNA基因和ppk1基因比較建樹分析，發(fā)現(xiàn)它們對聚磷菌的分類具有高度的一致性[12]。通過ppk1基因?qū)哿拙M行分類，可以解決很多以前未能解決的問題。例如，得到全基因組測序信息的聚磷菌UW-2[2]，它缺少硝酸鹽還原酶，屬于clade IIA。通過一系列的研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境中clade IA 的聚磷菌確實可以利用硝酸鹽進行聚磷，而clade IIA的聚磷菌不可以利用硝酸鹽。

2 聚磷菌的分布及影響因素

聚磷菌最初是在乙酸富集的生物反應(yīng)器活性污泥中被發(fā)現(xiàn)[17]，這個環(huán)境中有著豐富的碳源和磷源。之后在活性污泥系統(tǒng)中，聚磷菌被多次發(fā)現(xiàn)且其含量可達到40%～80%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)貧乏的淡水環(huán)境(湖泊、小河)中也有聚磷菌的分布。通過對Accumulibacter clade II A 基因組注釋分析，發(fā)現(xiàn)聚磷菌有兩套聚磷機制[2]：一個是低親和性的聚磷途徑，一個是高親和性的聚磷途徑。它們分別在高磷和低磷的環(huán)境中發(fā)揮作用，解釋了為什么在營養(yǎng)貧乏的環(huán)境中也有聚磷菌存在。這個發(fā)現(xiàn)促使研究人員通過標簽基因ppk1在自然的淡水環(huán)境中尋找更多的聚磷微生物[18]。研究發(fā)現(xiàn)聚磷菌在環(huán)境中的分布非常廣泛，具有豐富的多樣性，不同環(huán)境中的聚磷菌群落結(jié)構(gòu)不同，且可分為兩種類型，11個亞型(圖1)[19]。

自從聚磷菌被發(fā)現(xiàn)后，大量的研究關(guān)注于環(huán)境因子對聚磷菌群落結(jié)構(gòu)的影響以及它們對活性污泥系統(tǒng)除磷功能的影響。對5個不同的除磷系統(tǒng)進行研究后發(fā)現(xiàn)聚磷菌可以占到整個生物細胞的9%～24%，且80%的聚磷菌具有很強的聚磷功能[20]。另外一項研究發(fā)現(xiàn)，聚磷菌占到環(huán)境中細菌的5%～20%，且與環(huán)境中的COD含量和磷的比率有著很好的正相關(guān)關(guān)系[21]。但是，也在一些環(huán)境中發(fā)現(xiàn)聚磷菌并不是主要的除磷微生物[22]，盡管在一些環(huán)境中它的含量并不低[23]。說明在研究聚磷微生物的貢獻時需要考慮結(jié)合多種方法(如轉(zhuǎn)錄組、化學測定等)，不能僅僅依靠數(shù)量來確定。

基因組水平的分析可以更好地解釋聚磷菌對環(huán)境的適應(yīng)性。He 等[6]根據(jù)聚磷菌基因組信息設(shè)計了關(guān)鍵基因的芯片，研究了實驗室聚磷菌富集物在不同條件下聚磷菌基因的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)進入好氧階段初期，參與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白運輸?shù)幕蝻@著上調(diào)，說明聚磷菌從厭氧階段進入好氧階段初期進行了快速的繁殖。同時發(fā)現(xiàn)在好氧初期，參與TCA循環(huán)和合成ATP酶的基因都顯著上調(diào)，驗證了聚磷菌在有氧條件下通過TCA循環(huán)氧化細胞內(nèi)的有機化合物提供ATP供細胞生長。He等[19]根據(jù)Accumulibacter clade IIA的全基因組信息設(shè)計引物，在轉(zhuǎn)錄水平研究了參與乙酸代謝途徑的酶以及聚磷酶在不同環(huán)境因子下的表達差異，闡明了碳源代謝與聚磷過程在不同環(huán)境因子下的相互關(guān)系。

圖1 聚磷菌的系統(tǒng)發(fā)育樹[19]Fig.1 The phylogenetic tree of Accumulibacter[19]

3 展 望

宏基因組測序及對聚磷菌全基因組的組裝促進了對聚磷菌的生理、物種及功能多樣性的認識和研究，解決了很多以前不能解決的問題，同時也提出了更多新的研究視角。上述對于聚磷菌的研究建立在僅有的幾個單一環(huán)境下富集培養(yǎng)的聚磷菌的參考基因組之上，而Albertsen 等[24]對EBPR體系進行宏基因組測序，發(fā)現(xiàn)拼接的很多聚磷菌的重疊群(contig)和參考菌株的相似性很小，說明環(huán)境中的聚磷菌是由多個菌株構(gòu)成的，通過分子標簽ppk1基因的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。僅以1株參考菌株對環(huán)境中的聚磷菌進行研究是不夠的，將造成研究的偏差。首先，聚磷菌生活的環(huán)境具有非常豐富的多樣性，不同環(huán)境下聚磷菌代表菌株的基因信息、代謝途徑并不完全相同，僅用現(xiàn)有的基因信息進行研究，會造成重要信息的流失。其次，聚磷菌也有多態(tài)性，其代表菌株很有可能不止一種，研究這些聚磷菌代謝的多樣性以及它們對除磷的貢獻也有非常重要的研究與應(yīng)用價值。但是，通過分離培養(yǎng)或者富集培養(yǎng)得到新的代表菌株困難重重，需要在復雜的環(huán)境中，不通過富集培養(yǎng)直接從宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組以及宏代謝組的角度，更加深入地研究聚磷菌，擴展對環(huán)境中聚磷微生物的認識。

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Advances in Accumulibacter Research Based on Macrogenomics Technique

XU Yuan1,2， CHEN Yu-bao1,2

(1.BeijingComputingCtr,Beijing100094; 2.BeijingEngin.Technol.Res.Ctr.ofGeneSequencing&GeneFunctionAnalysis,Beijing100094)

Accumulibacter is a number of important engineering bacteria broadly applied in sewage treatment plant for disposing inorganic phosphate (Pi). These bacteria can assimilate many folds of phosphate in excess of their own need and synthesize polyphosphate intracellularly and accordingly to remove phosphorus biologically. In the past few years, the development of macrogenomics and sequencing technology vastly motivate the understanding of the specific components of Accumulibacter and their phosphate metabolism processes. In this paper, technology of macrogenomics were introduced, articles reported recently based on intensive study on Accumulibacter macrogenomic technology were summarized so as to comprehensively understand the physiological functions, metabolic pathways, specific diversity of this number of the important microbes.

Accumulibacter; macrogenomics; metabolic pathway

北京市科學技術(shù)研究院創(chuàng)新團隊項目(IG201406C1)

徐媛 女，博士后。研究方向為微生物生態(tài)學、宏基因組學。E-mail：xuyuan@bcc.ac.cn

* 通訊作者。男，副研究員。研究方向為生物信息與生物技術(shù)經(jīng)濟。Tel：010-59341760，E-mail：chenyb@bcc.ac.cn

2015-05-07；

2015-07-27

Q93-33

A

1005-7021(2016)02-0104-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.018