釀酒酵母異丁醇合成途徑調(diào)控的研究進(jìn)展

成婷 苑帥 張曉元 林良才 李欣 張翠英

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南 250101）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種重要的真核模式微生物，屬于一般公認(rèn)安全的工業(yè)微生物，具有許多生理和代謝優(yōu)勢：（1）可以耐受低pH值，從而降低了被污染的風(fēng)險(xiǎn)；（2）允許長期、重復(fù)、連續(xù)發(fā)酵；（3）抗逆性強(qiáng)，具有單倍體和二倍體的生命形態(tài)，能適應(yīng)發(fā)酵過程中的惡劣條件，菌株活力好［1］。這些優(yōu)勢使釀酒酵母可以用于異丁醇的微生物合成。隨著對釀酒酵母基因組測序的完成和對其生理代謝及調(diào)控的廣泛研究，釀酒酵母逐步成為生產(chǎn)各種高級醇的微生物細(xì)胞工廠之一。

異丁醇是一種支鏈高級醇，與生物乙醇相比，具有更高的能量密度和辛烷值，這使異丁醇在作為火花點(diǎn)火式發(fā)動機(jī)和輕型發(fā)動機(jī)的燃料上有很好的前景［2］。并且異丁醇具有較低的腐蝕性和吸濕性，能與現(xiàn)有管道基礎(chǔ)設(shè)施中較好地適配。此外異丁醇還可以用作涂料樹脂的原料、除冰液、拋光添加劑等［3］。隨著化石燃料造成的環(huán)境惡化和石油價(jià)格上漲，許多研究者嘗試?yán)么x工程及合成生物學(xué)手段改造釀酒酵母生產(chǎn)新一代可持續(xù)的生物燃料和化學(xué)品，以降低現(xiàn)代工業(yè)對化石燃料的依賴并減少溫室氣體的排放［4］。相對其他微生物細(xì)胞工廠，釀酒酵母具有性狀遺傳穩(wěn)定、安全性高、對各種環(huán)境壓力耐受性高、可進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。

天然釀酒酵母自身具有成熟的異丁醇合成途徑，但只產(chǎn)生微量的異丁醇［5］。在釀酒酵母中，根據(jù)2-酮異戊酸酯（KIV）的來源不同，將異丁醇合成途徑分為從頭合成途徑（Harris）和分解代謝途徑（Enrlich）［6-7］，如圖1所示。在分解代謝途徑（位于細(xì)胞質(zhì)）中，以纈氨酸為底物合成異丁醇過程分為三步：首先，纈氨酸在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶Bat2p催化下轉(zhuǎn)氨生成2-酮異戊酸酯；然后2-酮異戊酸酯在酮酸脫羧酶催化下脫羧生成異丁醛；最后，異丁醛在醇醛脫氫酶催化下生成異丁醇［8］，同時(shí)伴隨NADH作為氧化還原輔因子被氧化為NAD+。在從頭合成途徑（位于線粒體）中，由葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成的兩個(gè)丙酮酸分子在乙酰乳酸合酶Ilv2p催化下形成2-乙酰乳酸（ALAC）；2-乙酰乳酸在乙酰羥基酸還原異構(gòu)酶Ilv5p催化下異構(gòu)為2,3-二羥基異戊酸酯（DIV），同時(shí)NADPH作為氧化還原輔因子被氧化為NADP+；2,3-二羥基異戊酸酯在二羥基脫水酶Ilv3p催化下脫水生成2-酮異戊酸酯；線粒體中的2-酮異戊酸酯可以在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶Bat1p催化下轉(zhuǎn)化為纈氨酸運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中，也可以直接運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中以合成異丁醇［9］。

圖1 釀酒酵母中異丁醇合成及競爭途徑Fig.1 Isobutanol synthesis and competitive pathway in S.cerevisiae

近年來，代謝工程改造釀酒酵母使其高產(chǎn)異丁醇成為研究熱點(diǎn)。隨著合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，研究者在理性改造釀酒酵母細(xì)胞、定向調(diào)控異丁醇生產(chǎn)上做了許多努力。本文綜述了在近年研究中應(yīng)用于促進(jìn)釀酒酵母合成異丁醇的代謝工程策略。在釀酒酵母中乙醇仍然是發(fā)酵的主產(chǎn)物，異丁醇的最大產(chǎn)量僅為2.60 g/L，遠(yuǎn)低于理論最高產(chǎn)量［10-12］。因此，本文不僅詳細(xì)介紹了目前釀酒酵母生產(chǎn)異丁醇的代謝工程策略，而且對釀酒酵母高產(chǎn)異丁醇過程中存在的瓶頸及有效對策進(jìn)行了探討，期望未來將會有更多成功的異丁醇生產(chǎn)實(shí)例。同時(shí)，釀酒酵母是飲料酒釀造過程中的主要微生物，是白酒主要風(fēng)味物質(zhì)高級醇（異丁醇、正丙醇、異戊醇和β-苯乙醇）的生產(chǎn)者。飲料酒中高級醇的積累直接影響飲料酒的風(fēng)味和品質(zhì)，含量過高會產(chǎn)生令人不愉的異雜味，危害人體健康；過低會使飲料酒味淡薄，口感較差。研究者可以在結(jié)合各種代謝策略的基礎(chǔ)上深入解析釀酒酵母中異丁醇的合成機(jī)制，這有利于科學(xué)闡明釀酒酵母高級醇合成代謝機(jī)制，為適量產(chǎn)高級醇菌株的定向選育提供理論支撐［13］。

1 增強(qiáng)異丁醇合成途徑

在釀酒酵母中，異丁醇的合成途徑分為從頭合成途徑（Harris）和分解代謝途徑（Enrlich）。在從頭合成途徑中，Chen等［14］過表達(dá)從頭合成途徑中的基因ILV2、ILV3、ILV5以及編碼細(xì)胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的基因BAT2，促進(jìn)了異丁醇合成途徑中間產(chǎn)物2-酮異戊酸酯的合成，使釀酒酵母的異丁醇產(chǎn)率提高了13倍。Kondo等［15］在釀酒酵母中過表達(dá)了α-酮酸脫羧酶（KDC）、醇脫氫酶（ADH）以增強(qiáng)內(nèi)源性Enrlich途徑的活性，并且過表達(dá)了線粒體中從頭合成途徑第一步的編碼乙酰乳酸合酶基因ILV2，敲除了一個(gè)編碼丙酮酸脫羧酶的基因PDC1，來增加丙酮酸流向異丁醇的通量，減少流向乙醇的通量。通過這些基因工程策略及發(fā)酵條件的優(yōu)化使釀酒酵母的異丁醇產(chǎn)量提高了13倍，產(chǎn)率為6.6 mg/g（異丁醇/葡萄糖）。

2 阻斷異丁醇競爭途徑

在釀酒酵母的異丁醇合成中存在多條競爭途徑，如異丁醇合成的前體物2-乙酰乳酸、2-酮異戊酸酯、異丁醛、丙酮酸等可以作為其他物質(zhì)生物合成的底物，從而分散異丁醇合成的碳流量。因此阻斷競爭途徑以減少與釀酒酵母異丁醇生物合成競爭的碳流出，對提高釀酒酵母異丁醇的生成量至關(guān)重要。

2.1 阻斷線粒體中的競爭途徑對2-乙酰乳酸、2-酮異戊酸酯和丙酮酸的消耗

異丁醇從頭合成途徑中間產(chǎn)物2-乙酰乳酸除了可以轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸酯外，還可以脫羧形成二乙?；?，二乙酰基在丁二醇脫氫酶Bdh1p和Bdh2p催化下生成乙啶，隨后氧化為2,3-丁二醇［16-17］。另一中間產(chǎn)物2-酮異戊酸酯是Enrlich途徑和從頭合成途徑都能合成的一種重要的異丁醇前體物質(zhì)，但也是亮氨酸、異戊醇和泛酸合成途徑的底物［18］。亮氨酸合成途徑中2-酮異戊酸酯在2-異丙基蘋果酸合成酶Leu4p和Leu9p的催化下轉(zhuǎn)化為2-異丙基蘋果酸（亮氨酸和異戊醇的初始底物）；泛酸合成途徑中2-酮異戊酸酯在3-甲基-2-氧丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶Ecm31p的催化下轉(zhuǎn)化為2-脫氫泛酸（泛酸的初始底物）。Wess等［19］利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除了基因BDH1和BDH2，阻斷了2,3-丁二醇的生物合成，并進(jìn)一步敲除了基因LEU4和LEU9來阻斷亮氨酸和異戊醇的生物合成，異丁醇濃度和產(chǎn)率分別提高了2.5倍和2.3倍；最后通過敲除基因ECM31來阻斷泛酸的生物合成，但異丁醇產(chǎn)量并沒有明顯升高。有趣的是，在Ida等［20］的研究中，單敲除基因ECM31的工程菌株異丁醇產(chǎn)量相比出發(fā)菌株提高了1.7倍。Funovics等［10］在工程菌株中選擇敲除基因LEU1來阻斷亮氨酸和異戊醇的生物合成，異丁醇產(chǎn)量提高了5.4%，原因是敲除該基因既可以減少2-酮異戊酸酯流向亮氨酸，又可以減少Leu1p對Fe-S輔基的利用。

丙酮酸是細(xì)胞質(zhì)中糖酵解途徑的終產(chǎn)物和線粒體中三羧酸循環(huán)的主要底物，是調(diào)控碳代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。同時(shí)，丙酮酸也是生物質(zhì)分解代謝途徑和合成代謝途徑的交叉點(diǎn)［21］。作為異丁醇從頭合成途徑中的重要前體，丙酮酸在線粒體中被部分競爭途徑消耗，從而影響了釀酒酵母合成異丁醇的能力。線粒體中的丙酮酸和2-酮丁酸（由蘇氨酸通過蘇氨酸脫氫酶Ilv1p催化生成）是異亮氨酸合成途徑的重要底物，在Ilv2p、Ilv5p、Ilv3p的催化下生成異亮氨酸。Lee等［22］敲除基因ILV1后其異丁醇濃度提高了90%，這是由于基因ILV1敲除阻斷了異亮氨酸合成途徑的第一步，從而增加丙酮酸流入異丁醇合成途徑的通量。與此同時(shí)，異亮氨酸和異丁醇合成途徑在線粒體中由Ilv2p、Ilv5p、Ilv3p催化，敲除基因ILV1阻斷異亮氨酸合成途徑可以增強(qiáng)Ilv2p、Ilv5p、Ilv3p在異丁醇合成途徑的利用率［23］。

2.2 阻斷細(xì)胞質(zhì)中的競爭途徑對丙酮酸、異丁醛的消耗

丙酮酸除了在線粒體中被消耗外，也會在細(xì)胞質(zhì)中被其他競爭途徑消耗。在釀酒酵母中，大部分的丙酮酸會用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的合成、乙醇的合成以及線粒體呼吸作用等。線粒體丙酮酸載體（MPC）負(fù)責(zé)將丙酮酸從細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)輸?shù)骄€粒體，在早期的研究中，Bricker等［21］發(fā)現(xiàn)了線粒體內(nèi)膜蛋白Mpc1p和Mpc2p形成的復(fù)合物介導(dǎo)了丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)。隨著蛋白復(fù)合物鑒定技術(shù)的發(fā)展，Tavoulari等［24］研究發(fā)現(xiàn)MPC以異二聚體的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)丙酮酸的功能，并且異二聚體Mpc1p/Mpc2p的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性和熱穩(wěn)定性均低于異二聚體Mpc1p/Mpc3p。Park等［25］在過表達(dá)線粒體中異丁醇生物合成途徑的酶之后，又進(jìn)一步過表達(dá)了線粒體丙酮酸載體Mpc1p/Mpc3p，使工程菌株的異丁醇產(chǎn)量提高了1.9倍。在該研究中，過表達(dá)Mpc1p/Mpc2p對異丁醇產(chǎn)量的提高效果低于過表達(dá)Mpc1p/Mpc3p，這與Tavoulari等的研究結(jié)論一致。

當(dāng)發(fā)酵處于厭氧、高葡萄糖濃度條件下時(shí)，由于Crabtree效應(yīng)，丙酮酸生成乙醇成為異丁醇合成途徑中最大的競爭途徑［26］。在乙醇生成途徑中，丙酮酸在酮酸脫羧酶（由基因PDC1/5/6編碼）催化下脫羧生成乙醛，乙醛在醇醛脫氫酶（由基因ADH1/2/3/4/5編碼）催化下還原為乙醇。Wess等［19］研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)敲除基因PDC1、PDC5會導(dǎo)致菌株無法生成乙醇和異丁醇，而單獨(dú)敲除也無法有效減少乙醇的生成。敲除醇醛脫氫酶基因ADH1可以干擾乙醇的形成，使乙醇產(chǎn)量大幅下降83%，但工程菌株中異丁醇的產(chǎn)量并未明顯提高，而甘油生成量顯著增加。Lane等［11］同樣敲除基因ADH1來阻斷乙醇對丙酮酸的利用，但獲得工程菌株的乙醇、甘油產(chǎn)量并未明顯變化，而異丁醇產(chǎn)量提高了13%。兩項(xiàng)研究中異丁醇和乙醇變化趨勢不同的原因可能是出發(fā)菌株不同、發(fā)酵方式不同以及氧化還原輔因子平衡的差異。

除了丙酮酸外，異丁醛作為異丁醇的前體物質(zhì)，在醛脫氫酶（基因ALD6編碼）催化作用下會將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁酸［27］，從而減少異丁醛向異丁醇轉(zhuǎn)化。Milne等［28］認(rèn)為在有氧發(fā)酵下，異丁醛會被氧化為異丁酸而不是還原為異丁醇。Ida等［20］研究發(fā)現(xiàn)，單敲除基因ALD6菌株的異丁醇產(chǎn)量相比野生型菌株提高了2.4倍；Park等［29］研究發(fā)現(xiàn)，單敲除基因ALD6菌株的異丁醇產(chǎn)量增加了1.3倍。同樣，Lee等［22］在改造后的工程菌株上繼續(xù)敲除基因ALD6之后異丁醇產(chǎn)量得到了提高。

3 平衡氧化還原輔因子

在釀酒酵母中，異丁醇生物合成途徑的糖酵解過程產(chǎn)生兩分子的NADH，而線粒體從頭合成途徑會消耗一分子的NADPH，胞質(zhì)Enrlich途徑會消耗一分子的NADH，這導(dǎo)致在整個(gè)異丁醇合成途徑中出現(xiàn)一分子NADPH短缺和一分子NADH過剩的不平衡。因此，解決氧化還原輔因子的不平衡是提高釀酒酵母異丁醇產(chǎn)量的關(guān)鍵［30］。在目前的研究中通常都會采用以下兩種策略解決該問題。第一種策略是異源表達(dá)依賴NADH的酮醛酸還原異構(gòu)酶KARI，該酶的作用與乙酰羥基酸還原異構(gòu)酶Ilv5p相似，可以將2-乙酰乳酸催化生成2,3-二羥基異戊酸酯，這樣可以消耗過剩的一分子NADH。Gambacorta等［31］采用第一種策略，異源表達(dá)大腸桿菌中編碼KARI的基因ilvC6E6并將異丁醇途徑重新定位在胞質(zhì)，但工程菌株中異丁醇產(chǎn)量沒有得到提高。原因可能是過剩的一分子NADH未能被KARI利用，而是優(yōu)先在醇醛脫氫酶催化乙醛生成乙醇過程中消耗；而第二種策略是利用向釀酒酵母中引入一個(gè)具有轉(zhuǎn)氫作用的分流反應(yīng)（NADH+NADP+→NADPH+NAD+）將一分子過剩的NADH轉(zhuǎn)換成一分子NADPH［13］，理論上看來該策略恰好解決了異丁醇合成途徑中一分子NADPH短缺和一分子NADH過剩的不平衡問題。Ida等［20］的研究中利用該策略構(gòu)建了釀酒酵母工程菌株，使異丁醇的產(chǎn)量達(dá)到了（224±5）mg/L，是出發(fā)菌株的11倍。

除了異丁醇生物合成途徑中存在氧化還原輔因子不平衡的問題外，在異丁醇合成的競爭途徑中，許多競爭代謝產(chǎn)物的合成途徑也會影響到氧化還輔因子的平衡，如甘油、乙醇、2,3-丁二醇、異丁酸。3-磷酸甘油脫氫酶依賴一分子NADH催化葡萄糖生成甘油（糖異生途徑）；乙醇生成過程中醇醛脫氫酶會消耗一分子NADH；2,3-丁二醇生成過程中丁二醇脫氫酶催化的兩步反應(yīng)消耗兩分子NADH；醛脫氫酶將異丁醛催化為異丁酸，伴隨一分子NADH生成。因此阻斷異丁醇合成的競爭途徑不僅僅是增加中間代謝產(chǎn)物流向異丁醇的通量，同時(shí)也應(yīng)該考慮到阻斷競爭途徑后對氧化還原輔因子平衡的影響。同樣，僅增強(qiáng)異丁醇合成途徑也會過度消耗氧化還原輔因子，可能會出現(xiàn)與預(yù)期相悖的結(jié)果。

4 重建異丁醇合成途徑

Enrlich途徑發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)，而從頭合成途徑部分發(fā)生在線粒體，這樣的空間隔離阻礙了異丁醇的生成，以往的研究會采用兩種不同的方法來打破這種空間隔離。第一種方法是通過在原定位于胞質(zhì)的基因5'端添加一段編碼Cox4p的DNA序列MLS（線粒體靶向序列），從而將Enrlich途徑上的酶由細(xì)胞質(zhì)定位至線粒體中；相反，第二種方法是通過去除原定位于線粒體基因上的MLS序列，使其由線粒體定位至胞質(zhì)中。研究人員利用異丁醇重定位途徑工程結(jié)合其他代謝策略都顯著提高了異丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率，如Tan等［32］利用第一種途徑定位方法，表達(dá)了靶向線粒體的α-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，工程酵母的異丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率相比野生型分別提高了35%和89%。Park等［33］則采用第二種方法通過敲除ILV2、ILV5、ILV3基因中的線粒體靶向序列MLS將Ilv2p、Ilv5p、Ilv3p蛋白重定位到細(xì)胞質(zhì)中，將異丁醇產(chǎn)量提高到71.8 mg/L。最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，僅重新定位釀酒酵母中的異丁醇合成途徑而不進(jìn)行其他代謝改造，與定位細(xì)胞質(zhì)合成途徑的菌株相比，定位線粒體合成途徑的菌株可以更有效地提高異丁醇產(chǎn)量［31］。這與Avalos等［34］的研究結(jié)果一致，定位線粒體合成途徑的菌株其異丁醇產(chǎn)量增加了260%，而定位細(xì)胞質(zhì)合成途徑的菌株異丁醇產(chǎn)量僅提高了10%。該研究進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)表明，定位細(xì)胞質(zhì)合成途徑的菌株是由于Fe-S簇（Ilv3p酶蛋白的輔基）供應(yīng)不足導(dǎo)致異丁醇產(chǎn)量不能大幅提高［31］。

在代謝工程改造釀酒酵母合成異丁醇的研究中，研究者一直致力于解除異丁醇合成途徑中的瓶頸問題，其中二羥基脫水酶Ilv3p（將2,3-二羥基異戊酸酯催化為2-酮異戊酸酯）的Fe-S輔基是定位細(xì)胞質(zhì)合成途徑菌株生產(chǎn)異丁醇的限制瓶頸。輔基Fe-S的初始組裝發(fā)生在線粒體中。Avalos等［34］和Lee等［35］發(fā)現(xiàn)通過額外添加2-酮異戊酸酯可以顯著提高異丁醇的產(chǎn)量，這是由于在細(xì)胞質(zhì)中Ilv3p催化2,3-二羥基異戊酸酯生成2-酮異戊酸酯是異丁醇合成的限速步驟，原因可能是輔基Fe-S在線粒體中形成，但需經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜過程才能運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用（圖2-a）。線粒體中的鐵硫簇機(jī)制ISC會利用Fe2+和半胱氨酸生成Fe-S簇中間體，通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Atm1p被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，F(xiàn)e-S簇中間體在胞質(zhì)中形成Fe-S簇并在Fe-S簇組裝機(jī)制CIA作用下發(fā)揮作用。在Lee等［22］研究中，敲除了使低鐵敏感轉(zhuǎn)錄激活因子失效的蛋白Grx3p的編碼基因GRX3，并過表達(dá)了胞質(zhì)中Fe-S蛋白成熟所必需的蛋白Cfd1p的編碼基因CFD1，使工程菌株的異丁醇濃度相比野生型菌株提高了60%［36-37］。Gambacorta等［31］通過敲除編碼Fra2p（轉(zhuǎn)錄激活因子Aft1/2p的抑制因子［38］）的基因FRA2使異丁醇濃度顯著提高（圖2-a）。另外，Hammera等［39］研究發(fā)現(xiàn)Bat1p失活可以促進(jìn)異丁醇合成，猜想敲除Bat1p抑制了Atm1p的活性，從而導(dǎo)致輔基Fe-S在線粒體中積累，增強(qiáng)了Ilv3p的活性。因此在結(jié)合異丁醇途徑工程基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解Ilv3p的作用機(jī)制對促進(jìn)釀酒酵母中異丁醇的合成至關(guān)重要。

圖2 釀酒酵母中異丁醇合成的分子調(diào)控機(jī)制Fig.2 Molecular regulatory mechanism of isobutanol synthesis in S.cerevisiae

5 異丁醇的調(diào)控與轉(zhuǎn)錄

傳統(tǒng)的代謝調(diào)控策略往往只將某個(gè)代謝途徑基因上調(diào)或下調(diào)，由于代謝途徑的復(fù)雜性會導(dǎo)致工程菌株達(dá)不到預(yù)期效果。因此，對整個(gè)代謝途徑進(jìn)行全局調(diào)控對構(gòu)建理想的釀酒酵母細(xì)胞工廠至關(guān)重要［40］。異丁醇生物合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白Ilv6p（圖2-b），是乙酰乳酸合酶Ilv2p的調(diào)控因子，也是其催化活性的激活劑。當(dāng)纈氨酸存在時(shí)，Ilv6p受到底物反饋抑制，對Ilv2p的激活作用減弱，從而抑制異丁醇的生成［23,41］。Chen等［14］研究中發(fā)現(xiàn)，以過表達(dá)基因ILV2、ILV3和ILV5的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)一步過表達(dá)基因ILV6后該菌株的異丁醇產(chǎn)量相比出發(fā)菌株降低了3倍。推測原因可能是過表達(dá)基因ILV6增強(qiáng)了Ilv2p對纈氨酸抑制的敏感性，使纈氨酸對Ilv2p的抑制作用大于過表達(dá)基因ILV2、ILV3和ILV5對異丁醇的促進(jìn)作用。Hammer等［39］解除了Ilv6p的纈氨酸反饋抑制，但結(jié)果表明其對異丁醇產(chǎn)量的抑制作用并未完全消除。研究推測，改造后的Ilv6p仍具有部分反饋抑制作用或者還存在其他轉(zhuǎn)錄激活因子的調(diào)節(jié)。

轉(zhuǎn)錄因子是一類與特定序列結(jié)合，保證目的基因以特定強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。轉(zhuǎn)錄因子組成的代謝調(diào)控系統(tǒng)具有全局、動態(tài)調(diào)控靶代謝途徑的能力［40］。利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可以構(gòu)建不同的調(diào)控工具，可以用來調(diào)控多基因的共表達(dá)、優(yōu)化靶標(biāo)性能、動態(tài)調(diào)控代謝通路等。在釀酒酵母中，高級醇的代謝與氨基酸和糖代謝緊密相連。與氨基酸和糖代謝調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可能會間接調(diào)控高級醇的生成。氮代謝中Gat1p 和 Gln3p 為激活因子，在低氮條件下，會激活氮分解代謝抑制NCR敏感基因的表達(dá)，增強(qiáng)對支鏈氨基酸和芳香族氨基酸的利用，將Gat1p的靶基因GAP1敲除后發(fā)現(xiàn)釀酒酵母合成異丁醇的能力顯著降低［42-43］。氨基酸饑餓響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gcn4p在缺乏纈氨酸時(shí)會激活基因BAT1、BAT2、ILV2、ILV6和ILV3的轉(zhuǎn)錄［44］；敲除編碼Gcn4p的基因GCN4會影響到細(xì)胞生長，過表達(dá)則導(dǎo)致糖酵解途徑的碳通量下降，而甘油含量上升［45］。而在糖代謝中Nrg1p是葡萄糖抑制基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，介導(dǎo)一系列應(yīng)激反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白的編碼基因NRG1的等位變異不僅影響了糖代謝，還影響了氮分解代謝抑制（NCR）和基因BAT1的表達(dá)，導(dǎo)致菌株吸收的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的轉(zhuǎn)氨基率降低［46］。這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控氨基酸和糖代謝，可能間接調(diào)控了釀酒酵母的高級醇生成。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作為間接參與高級醇代謝的重要調(diào)控元件，在調(diào)控釀酒酵母異丁醇合成上應(yīng)受到重視。對釀酒酵母合成異丁醇過程中轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制的研究有利于進(jìn)一步提高異丁醇產(chǎn)量，將成熟的代謝策略并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的理性改造應(yīng)用到釀酒酵母中，使工程菌株能夠定向調(diào)控異丁醇的合成。人工轉(zhuǎn)錄調(diào)控是調(diào)節(jié)異丁醇代謝通路的有效策略，但直接敲除或過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，應(yīng)該充分考慮到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因（一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子往往同時(shí)調(diào)控若干個(gè)基因）功能以及轉(zhuǎn)錄因子對基因轉(zhuǎn)錄的正負(fù)調(diào)控方向。

6 提高異丁醇耐受性

盡管上文的這些代謝策略顯著提高了釀酒酵母合成異丁醇的能力，但利用釀酒酵母工程菌株生產(chǎn)異丁醇尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。在發(fā)酵過程中，代謝終產(chǎn)物異丁醇的逐漸積累可能會破壞菌體細(xì)胞膜和線粒體的功能、阻礙細(xì)胞生長［47］。因此釀酒酵母對異丁醇的低耐受性極大地限制了其合成異丁醇的能力，是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的主要瓶頸之一［48］。近年來，研究者為了提高釀酒酵母工程菌株生產(chǎn)異丁醇的工業(yè)實(shí)用性，利用EMS（甲基磺酸乙酯）誘變技術(shù)使釀酒酵母能夠在異丁醇濃度為16 g/L的培養(yǎng)基中生長，并通過逆向工程試驗(yàn)表明，過表達(dá)基因CWP2和SRP4039可以提高釀酒酵母對異丁醇的耐受性［48］。同時(shí)Zhang等［47］研究發(fā)現(xiàn)，通過改造釀酒酵母的TATA結(jié)合蛋白Spt15p可以提高其異丁醇耐受性和產(chǎn)量。Promdonkoy等［4］利用適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE）以及合理的代謝工程策略將異丁醇的濃度提高到了92.9 mg/L。

EMS和ALE技術(shù)都能夠有效提高釀酒酵母的異丁醇耐受性，但這些誘變技術(shù)難以保證釀酒酵母性狀的穩(wěn)定遺傳，之后的研究應(yīng)該進(jìn)一步通過基因工程改造穩(wěn)定異丁醇耐受性的遺傳［49-50］。然而，釀酒酵母的異丁醇耐受機(jī)制是一種復(fù)雜的表型，受到多個(gè)基因的調(diào)控，未來的研究應(yīng)致力于解析與釀酒酵母異丁醇耐受性有關(guān)的調(diào)控機(jī)制，為釀酒酵母異丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

7 總結(jié)與展望

隨著代謝調(diào)控策略和合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用工程釀酒酵母細(xì)胞生產(chǎn)新一代生物燃料異丁醇取得了一定的突破（表1）。在天然釀酒酵母細(xì)胞中，過表達(dá)異丁醇合成途徑上的基因以及阻斷異丁醇競爭途徑，異丁醇產(chǎn)量可得到明顯改善。為了進(jìn)一步提高異丁醇產(chǎn)量，通過改變酶的輔因子依賴性和過表達(dá)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶解決代謝過程中氧化還原輔因子不平衡的問題，這在提高釀酒酵母異丁醇合成能力方面起著至關(guān)重要的作用。特別地，在釀酒酵母中重構(gòu)異丁醇合成途徑，解除胞質(zhì)和線粒體的空間隔離阻礙，顯著提高了異丁醇產(chǎn)量。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作為異丁醇合成過程中的重要元件，對其進(jìn)行調(diào)控不但可以消除一些對異丁醇合成途徑上的反饋抑制，還能夠動態(tài)地調(diào)控異丁醇的合成。基于上述一系列策略，工程釀酒酵母的異丁醇合成能力得到進(jìn)一步提升。但隨著異丁醇工業(yè)化的發(fā)展，高濃度異丁醇積累對釀酒酵母細(xì)胞的危害成為一個(gè)新的挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化、EMS誘變技術(shù)、基因組重測序以及逆向工程試驗(yàn)等方法都有望提高工程釀酒酵母對異丁醇的耐受性。盡管利用這些代謝工程手段構(gòu)建了生產(chǎn)異丁醇的工程菌株，但是高產(chǎn)異丁醇的瓶頸仍然存在，異丁醇的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率還有很大的提升空間。

表1 釀酒酵母工程菌株生產(chǎn)異丁醇的代表性實(shí)例Table 1 Representative examples of isobutanol production by engineered S.cerevisiae

第一，大部分異丁醇的研究還是以葡萄糖為碳源，無法達(dá)到低成本的經(jīng)濟(jì)效益和可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)目標(biāo)。由于釀酒酵母具有成熟的異丁醇合成途徑，又能夠有效利用木質(zhì)纖維素等生物質(zhì)［3］。因此，未來的研究可以將釀酒酵母進(jìn)一步改造，使其可以利用低成本的木糖作為原料合成異丁醇，而不是葡萄糖。Lane等［11］認(rèn)為木糖的同化與高級醇的合成可能存在協(xié)同效應(yīng)，這為將來木糖生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高價(jià)值生物燃料的研究提供參考。另外，釀酒酵母可以利用氨基酸作為氮源，通過Enrlich途徑生產(chǎn)高級醇。因此工程釀酒酵母在利用生物煉制中的廢料蛋白質(zhì)生產(chǎn)生物燃料方面顯示出了巨大的潛力。Ha等［51］通過連續(xù)高通量發(fā)酵，利用釀酒酵母將微藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物燃料。這種利用廢料蛋白質(zhì)中的氨基酸來合成生物燃料的可持續(xù)生產(chǎn)方式，對實(shí)現(xiàn)全球氮循環(huán)從而最大限度地減少能源需求有重要意義［52］。

第二，由于釀酒酵母是一種復(fù)雜的真核生物，其代謝途徑上還有許多的機(jī)制有待探索，如線粒體中的2-酮異戊酸酯跨膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)是否存在調(diào)控機(jī)制、Fe-S簇生物合成相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚不清晰等［53］。另一方面，即使基于合理的代謝調(diào)控策略對釀酒酵母進(jìn)行改造，但還是會出現(xiàn)異丁醇產(chǎn)量不變或降低的現(xiàn)象。因此未來研究中對某個(gè)基因的功能解析，不應(yīng)該單單僅基于表型，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等整合組學(xué)方法進(jìn)行全局分析，把握代謝改造過程中的全局變化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并解決更多的未知瓶頸。

除了代謝改造以外，未來研究還可以嘗試在釀酒酵母中將異丁醇與某種物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合生產(chǎn)，通過該物質(zhì)去降低異丁醇對釀酒酵母的危害，從而增加異丁醇產(chǎn)量［54］。另一有效手段是利用兩種微生物協(xié)同代謝，克服宿主自身合成異丁醇的缺陷，有可能成為一種新的異丁醇合成策略。有研究發(fā)現(xiàn)將酵母與乳酸菌共培養(yǎng)進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，兩者的相互作用影響了阿魏酸的代謝。即釀酒酵母中阿魏酸的主要代謝產(chǎn)物從4-乙烯基愈創(chuàng)木酚變成二氫阿魏酸［55］，該研究表明協(xié)同發(fā)酵會導(dǎo)致細(xì)胞外界條件的變化，從而改變了相關(guān)酶的活性。

綜上所述，將多種代謝策略創(chuàng)新性組合使用顯著提高了工程菌株中異丁醇的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率，但在異丁醇工業(yè)化上仍存在很多瓶頸，并需要進(jìn)一步探索。此外，這些代謝策略在以釀酒酵母為主的釀造行業(yè)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，通過合理運(yùn)用這些逐漸成熟的高級醇代謝調(diào)控策略可實(shí)現(xiàn)對飲料酒中微量風(fēng)味物質(zhì)（如異丁醇）的精密調(diào)控，提高飲料酒的品質(zhì)，從而在新時(shí)代滿足人們對各式各樣飲料酒的需求。