植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的研究進(jìn)展

李宇 李素貞 陳茹梅 盧海強(qiáng)

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，其作為重要的輔因子在植物體的各種重要的代謝過(guò)程中發(fā)揮作用，如光合作用、呼吸作用、荷爾蒙的合成及固氮作用等［1］。植物缺鐵會(huì)帶來(lái)產(chǎn)量和品質(zhì)下降等問(wèn)題，嚴(yán)重缺乏時(shí)甚至?xí)?dǎo)致作物絕產(chǎn)［2］。植物中鐵過(guò)量也會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)造成危害，鐵在植物體內(nèi)過(guò)量積累會(huì)引起鐵中毒，表現(xiàn)為生理代謝失調(diào)、生長(zhǎng)發(fā)育受阻。因此，植物中鐵的攝取與平衡必須受到嚴(yán)格的控制，來(lái)滿(mǎn)足其生長(zhǎng)供應(yīng)與需求。

鐵在土壤中的含量豐富，植物可以從土壤中獲得鐵，但是植物從土壤中攝取鐵的能力是有限的，主要原因是鐵以三價(jià)鐵及磷酸鹽形式存在，在堿性土壤中尤為明顯。植物應(yīng)答缺鐵條件形成了兩種鐵的吸收機(jī)制：機(jī)制I和機(jī)制Ⅱ［3-4］。機(jī)制I和機(jī)制Ⅱ的主要區(qū)別是機(jī)制I吸收Fe2+，而機(jī)制Ⅱ是以螯合的策略吸收Fe3+。雙子葉植物及非禾本科單子葉植物利用機(jī)制I吸收鐵，禾本科植物利用機(jī)制Ⅱ吸收鐵［5］。機(jī)制I植物吸收鐵的主要過(guò)程：植物先向根際分泌酚類(lèi)物質(zhì)或氫離子來(lái)酸化土壤增加鐵的溶解性［6］，隨后鐵還原酶FRO（Fe3+-chelate reductase）基因?qū)e3+還原為Fe2+，最后通過(guò)Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1/IRT2（iron-regulated transporter）［7］將其轉(zhuǎn)運(yùn)至植物體內(nèi)細(xì)胞以滿(mǎn)足植物生長(zhǎng)發(fā)育需要［8］。機(jī)制Ⅱ是基于螯合策略，首先在植物根細(xì)胞中經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)合成麥根酸類(lèi)物質(zhì)PS（phytosiderophores），麥根酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TOM1（transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1）將PS轉(zhuǎn)運(yùn)至根際，與土壤中的Fe3+螯合形成Fe3+-PS復(fù)合物，黃色條紋蛋白YSL（yellow stripe）將Fe3+-PS螯合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)［9］。兩種機(jī)制均由復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)調(diào)控，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由多種轉(zhuǎn)錄因子組成，其中堿性螺旋-環(huán)-螺旋bHLH（basic halix-loop-halix）家族的成員發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10］。

本文以依賴(lài)兩種不同鐵吸收策略調(diào)控體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的擬南芥和水稻為例，對(duì)二者中的相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)作用中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)、討論，以期能夠提高我們對(duì)植物控制鐵元素動(dòng)態(tài)平衡這一復(fù)雜機(jī)制的理解。

1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征

bHLH家族是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，亞族豐富［11］，擬南芥、水稻中的所有bHLH家族成員可分為32個(gè)亞族，其中擬南芥中包含的bHLH家族成員有162個(gè)，水稻中包含167個(gè)［12］。

bHLH蛋白是一個(gè)真核轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)與細(xì)胞分化和發(fā)育有關(guān)的一系列基因的表達(dá)［13］。bHLH家族以其高度保守的堿性/螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域命名，bHLH結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸殘基組成，分為兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)是堿性區(qū)，通常由13-17個(gè)氨基酸組成，位于氨基酸序列的N端，負(fù)責(zé)二聚化和參與DNA與E-box序列的結(jié)合［14］；另一個(gè)是由近40個(gè)氨基酸組成的HLH區(qū)域，位于氨基酸序列的C端，由兩個(gè)含有疏水殘基的α螺旋組成（圖1），需要二聚化來(lái)調(diào)控參與各種信號(hào)通路的靶基因的表達(dá)［15-16］。對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征的了解能幫助我們更好地理解bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵缺乏基因的表達(dá)機(jī)理。

圖1 鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要蛋白bHLH結(jié)構(gòu)域Fig.1 Alignment of the bHLH domain of iron-regulated network main proteins

2 植物中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究現(xiàn)狀

2.1 擬南芥中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH家族

2.1.1 機(jī)制I的BTS感受器通路 擬南芥是典型的模式植物之一，利用機(jī)制I吸收鐵，并且bHLH家族成員在擬南芥中研究得比較多，尤其是參與缺鐵脅迫應(yīng)答的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。到目前為止，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有屬于6個(gè)亞族的17個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與鐵的平衡調(diào)節(jié)［17-18］，在應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫時(shí)，同一亞族的轉(zhuǎn)錄因子往往發(fā)揮著相似的功能。

擬南芥缺鐵反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游是E3連接酶基因BTS（brutus），BTS受缺鐵強(qiáng)烈誘導(dǎo)，是一種潛在的鐵傳感器，對(duì)鐵離子高度敏感，其能與鐵結(jié)合并且具有泛素化轉(zhuǎn)錄因子的功能［19］。在擬南芥以及其他一些雙子葉植物中，還存在著兩個(gè)與BTS部分功能冗余的E3泛素連接酶，BTSL1（Brutus-like 1）和BTSL2，C末端結(jié)構(gòu)域具有E3連接酶活性，在擬南芥體內(nèi)能促進(jìn)類(lèi)缺鐵所誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH29/FIT（fer-like Fe deficiency-induced transcription factor）的降解。BTSL1和BTSL2之間也存在相互協(xié)同調(diào)節(jié)，但不與BTS之間關(guān)聯(lián)［20］。BTS缺鐵響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與參與鐵信號(hào)傳導(dǎo)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族IVc亞族的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子bHLH34、bHLH104、bHLH105/ILR3（iaa leucine resistant 3）和bHLH115直接相互作用，靶向IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子在富鐵植物中降解，負(fù)向調(diào)節(jié)鐵的吸收，這對(duì)于防止過(guò)量鐵攝取至關(guān)重要［21］。

在對(duì)IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在根中缺鐵時(shí)，除了ILR3，AtbHLH115、AtbHLH104和AtbHLH34也都被證明是鐵吸收的正調(diào)控因子，而ILR3和bHLH104是最關(guān)鍵的IVc轉(zhuǎn)錄因子亞族，相比較來(lái)說(shuō)，bHLH115起到的作用較小，bHLH34似乎不參與地上部缺鐵反應(yīng)［22］。bhlh115表現(xiàn)出對(duì)缺鐵的敏感性，而bHLH115的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了鐵的積累，這表明bHLH115正向調(diào)控鐵缺乏反應(yīng)基因的表達(dá)［23］。bHLH104/105或bHLH34/105的同源或異源二聚體發(fā)揮著非冗余調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的作用，直接參與bHLH47/PYE（popeye）的調(diào)控［24］。bHLH34和bHLH104功能缺失的突變體中發(fā)生鐵缺乏反應(yīng)的中斷和植物體內(nèi)鐵含量減少的情況，而過(guò)表達(dá)植物則促進(jìn)了鐵缺乏反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)以及增加了植株鐵的積累量［23］。Li等［12］進(jìn)一步分析表明，每一個(gè)IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員都可以直接激活下游Ib亞族基因bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄，它們擁有相似的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明bHLH IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子與bHLH121/URI（upstream regulator of IRT1）相互作用，并能夠促進(jìn)其在細(xì)胞核的積累，共同激活I(lǐng)b亞族基因轉(zhuǎn)錄［25-26］。

研究發(fā)現(xiàn)bHLH121功能缺失突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥嚴(yán)重的鐵缺乏癥狀，減少擬南芥體內(nèi)鐵的積累量，并擾亂與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)。過(guò)表達(dá)FIT有助于提高bhlh121的存活率。而且bHLH121具有DNA結(jié)合活性，可以與FIT和bHLH Ib基因的啟動(dòng)子結(jié)合，但未發(fā)現(xiàn)它對(duì)這些基因具有直接的轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性。bHLH121在bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子下游發(fā)揮作用，是bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子的直接靶點(diǎn)，其表達(dá)受缺鐵誘導(dǎo)，且依賴(lài)于bHLH IVc［17］。這些結(jié)果均表明，bHLH121與bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子一起正向調(diào)節(jié)FIT的表達(dá)，在維持?jǐn)M南芥中鐵的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

遺傳分析表明，F(xiàn)IT是bHLH121的下游靶基因，屬于IIIa亞族，是擬南芥缺鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心轉(zhuǎn)錄因子［27］。FIT在根表皮受缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)，fit表現(xiàn)出黃化表型，缺鐵時(shí)fit幼苗無(wú)法存活，約一半的缺鐵誘導(dǎo)基因在其根中表達(dá)下調(diào)，而鐵吸收關(guān)鍵基因FRO2和鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1（iron-regulated transporter 1）的表達(dá)量顯著降低［28］，這說(shuō)明FIT對(duì)于擬南芥缺鐵應(yīng)答的調(diào)節(jié)是必需的。

在酵母細(xì)胞中表達(dá)FIT與Ib亞族的bHLH38/39/100/101中的任何一個(gè)可激活FRO2和IRT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)［29］，這表明FIT能與bHLH38/39/100/101中的任何一個(gè)形成異源二聚體直接調(diào)控FRO2和IRT1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)二價(jià)鐵的吸收。而進(jìn)一步的分析表明，F(xiàn)RO2和IRT1在轉(zhuǎn)錄水平上不受調(diào)控，因?yàn)樵谌辫F條件下FIT過(guò)表達(dá)植株中都檢測(cè)到了IRT1蛋白的積累和較高的FRO2的活性。與野生型相比過(guò)表達(dá)FIT和AtbHLH38/AtbHLH39的植株在地上部積累了更多的鐵［30］。以上這些結(jié)果表明FIT與Ib亞族的bHLH38/39/100/101互作形成異源二聚體來(lái)正調(diào)控下游的FRO2和IRT1，以促進(jìn)擬南芥等機(jī)制I植物吸收鐵。在擬南芥中的突變研究表明，Ib bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞族的成員bHLH100和bHLH101在功能上是冗余的，但它們可能通過(guò)激活不同的下游基因來(lái)調(diào)節(jié)鐵缺乏的反應(yīng)［15］，bHLH38和bHLH39也是這樣［16］，bHLH38/39與bHLH100/101之間盡管非常相似，但是它們之間仍存在著非冗余的功能。

PYE是根中柱鞘細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的缺鐵響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子。Long等［31］對(duì)PYE的功能分析表明，在缺鐵條件下，PYE對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有正向調(diào)節(jié)作用。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PYE能夠通過(guò)直接結(jié)合到煙酰胺合成酶NAS4（nicotianamine synthase 4）、FRO3、鋅誘導(dǎo)的促進(jìn)因子ZIF1（zincinduced facilitator 1）的啟動(dòng)子上，并下調(diào)其表達(dá)。PYE與bHLH104/105/115互作，下調(diào)鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因。通過(guò)CHIP-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，bHLH115直接激活bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄，這表明bHLH34、AtbHLH104、bHLH105和bHLH115均參與了PYE調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在擬南芥鐵穩(wěn)態(tài)的維持中起著關(guān)鍵作用。

bHLH11也是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的負(fù)調(diào)控因子，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，隨著鐵缺乏的增加而表達(dá)量降低。共表達(dá)分析表明，IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)了bHLH11的核積累。進(jìn)一步分析表明，bHLH11抑制了IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Ib亞族基因（bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101）的調(diào)控。bHLH11還作為FIT的負(fù)調(diào)控因子，抑制FIT在擬南芥中的表達(dá)［32］。這些結(jié)論表明bHLH11可以使植物避免鐵攝取過(guò)量而導(dǎo)致的鐵中毒問(wèn)題。

2.1.2 機(jī)制I的植物激素信號(hào)通路 FIT作為擬南芥中響應(yīng)缺鐵脅迫網(wǎng)絡(luò)中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種響應(yīng)缺鐵信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，是這些信號(hào)的調(diào)節(jié)中心。在調(diào)控鐵吸收過(guò)程中，大部分的FIT是以非活性的形式存在，只有小部分FIT被磷酸化，感知環(huán)境中鐵的增加［33］。在缺鐵條件下，植物體內(nèi)的Ca2+濃度增加，作為第二信使被類(lèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶b亞基蛋白CBL1（calcineurin-B-like Ca2+sensor protein 11）或CBL9檢測(cè)到，激活Ca2+誘導(dǎo)的絲氨酸蛋白激酶CIPK11（cbl-interacting protein kinase 11）將FIT-C端的Ser272處磷酸化，激活大量的FIT，并且這一位點(diǎn)的磷酸化會(huì)促進(jìn)FIT和Ib異源二聚體的形成，激活下游缺鐵響應(yīng)基因。FIT還存在另一種磷酸化，就是在Tyr237和Tyr238的磷酸化，會(huì)對(duì)FIT活性產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致FIT向細(xì)胞核的遷移率降低，與bHLH39的相互作用減少,這也是一個(gè)調(diào)節(jié)FIT活性的方式［34］。

在擬南芥中，存在茉莉酸JA（jasmonic acid）對(duì)缺鐵脅迫的多重抑制。JA信號(hào)通路已知的主要調(diào)控因子是IIIe亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的bHLH6/MYC2（myelocytomatosis proteins）。在JA存在的情況下，MYC2導(dǎo)致IVa亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子（bHLH18、bHLH19、bHLH20和bHLH25）的表達(dá)上調(diào)［35］。這4個(gè)功能相似的轉(zhuǎn)錄因子主要在根中表達(dá)，并且都與FIT相互作用，調(diào)節(jié)FIT蛋白的積累。目前的相關(guān)研究還未提出FIT與IVa亞族的這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子形成的異源二聚體在植物鐵缺乏調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的下游靶基因是哪些，僅指出了FIT與IVa亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用會(huì)導(dǎo)致FIT的26s蛋白酶體降解，而FIT與Ib亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的相互作用則會(huì)促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性，這就使得IVa亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子和Ib亞族的轉(zhuǎn)錄因子在與FIT的結(jié)合之間存在著一種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，前者促進(jìn)FIT降解，而后者促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性。

赤霉素GA（gibberellin）是另外一類(lèi)植物生長(zhǎng)激素，已被證實(shí)在鐵缺乏反應(yīng)中發(fā)揮作用［36］。研究發(fā)現(xiàn)，在缺鐵條件下，使用GA4處理后的赤霉素缺失突變體，其IRT1、FRO2、bHLH038和bHLH39（后兩者控制IRT1和FRO2表達(dá)）的表達(dá)量顯著提高，但是FIT的表達(dá)不受GA4誘導(dǎo)。這表明GA在缺鐵條件下對(duì)鐵吸收相關(guān)基因的誘導(dǎo)是依賴(lài)FIT的。GA信號(hào)通過(guò)DELLA蛋白參與缺鐵反應(yīng)，酵母雙雜交、熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像（FRET-FLIM）和免疫共沉淀（Co-IP）分析表明，GA信號(hào)的DELLA阻遏蛋白可以與FIT、bHLH38和bHLH39蛋白形成異二聚體。FRET-FLIM和EMSA結(jié)果顯示，DELLA-FIT異源二聚體并不阻止FIT和Ib亞族 bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體，而是通過(guò)阻止FIT和Ib亞族 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的異源二聚體與其靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)抑制FIT的轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)綠色熒光蛋白幼苗的芯片分析表明，在缺鐵條件下，在DELLA蛋白存在的情況下，F(xiàn)IT與其目標(biāo)基因啟動(dòng)子的相互作用減少［37］。在缺鐵條件下，DELLA蛋白在根分生組織中積累，最終使FIT與Ib亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子異源二聚體的形成以及激活鐵攝取基因。

EIN3（ethylene insensitive 3）和EIL1（EIN3-like 1）是兩個(gè)通過(guò)乙烯信號(hào)通路激活的轉(zhuǎn)錄因子［38］。二者均可以和FIT相互作用，促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性，從而增加鐵攝取基因的表達(dá)。乙烯信號(hào)通路的EIN3或是EIL1并不影響FIT和Ib亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控，二者均可以抑制FIT被蛋白酶體降解，通過(guò)促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性來(lái)增強(qiáng)鐵的獲取［39］。MED16（mediator subunit 16）是中介體復(fù)合物的一個(gè)亞單位,連接異源二聚體的RNA聚合酶II（Pol II）復(fù)合體, 提高FIT/ Ib bHLH二聚體與FRO2和IRT1啟動(dòng)子結(jié)合的穩(wěn)定性,向RNA聚合酶2傳輸信號(hào),激活FRO2和 IRT1表達(dá)［40］。MED16與另一個(gè)亞基MED25（mediator subunit 25）相互作用，MED25通過(guò)與EIN3和EIL1的相互作用，在鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［41］。

關(guān)于機(jī)制I植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)研究得相對(duì)比較清楚，不論是缺鐵情況下還是生長(zhǎng)在富鐵的肥沃土壤中，植物中都有相應(yīng)功能的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)發(fā)揮作用，這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成一張復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)（圖2），精準(zhǔn)地調(diào)控鐵的吸收和運(yùn)輸，使植物體內(nèi)的鐵積累量始終維持在一個(gè)較為穩(wěn)定的狀態(tài)，為植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育保駕護(hù)航。

圖2 擬南芥中鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控Fig.2 Fe homeostasis regulation in Arabidopsis

圖3 擬南芥和水稻中調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of bHLH TFs regulating Fe homeostasis in Arabidopsis and rice（Oryza sativa）

2.2 水稻中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子

水稻由于其生長(zhǎng)條件可以是淹水，也可以土培，所以是鐵吸收完整的機(jī)制Ⅱ與部分機(jī)制I同時(shí)存在［42］，bHLH轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控水稻機(jī)制Ⅱ鐵的吸收及機(jī)制I與機(jī)制Ⅱ鐵的運(yùn)輸。與擬南芥相比，水稻中現(xiàn)已被研究的鐵運(yùn)輸調(diào)控相關(guān)bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子較少，但水稻中的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子大多與擬南芥中的為同源基因，處在同樣的亞族位置（圖3），在水稻中發(fā)揮著與擬南芥中相似的功能。

OsHRZ1（hemerythrin motif-containing really interesting new gene and zinc-finger protein 1）與擬南芥中的BTS同源，類(lèi)似地，OsHRZ1通過(guò)26S蛋白酶途徑靶向OsPRI1（positive regulator of iron homeostasis 1）［43］。hrz1相比野生型對(duì)照對(duì)鐵缺乏的耐受性更強(qiáng)，Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示，隨著OsHRZ1-GFP含量的增加，OsPRI1蛋白豐度降低，這些結(jié)果表明了OsHRZ1在鐵充足的條件下通過(guò)泛素化OsPRI1負(fù)向調(diào)節(jié)鐵的穩(wěn)態(tài)［44］。比較分析表明，OsPRI1的氨基酸序列與IVc亞族的AtbHLH34/104/105/115相似，與AtbHLH34/104/105/115正調(diào)控AtbHLH38/39/100/101一樣，OsPRI1直接上調(diào)OsIRO2的表達(dá)進(jìn)而激活鐵吸收相關(guān)基因的表達(dá)［45］。OsPRI2和OsPRI3是OsPRI1的兩個(gè)同源基因，已被鑒定與OsPRI1功能類(lèi)似，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也與OsHRZ1直接相互作用，且OsHRZ1促進(jìn)了OsPRI2和OsPRI3的降解［20］。CHIP-qPCR實(shí)驗(yàn)與EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明OsPRI2和OsPRI3也可以與OsIRO2（iron-related transcription factor 2）和OsIRO3的啟動(dòng)子結(jié)合。因此，OsPRI1/2/3相似且具有相同的功能。

OsIRO3是屬于bHLH IVb亞族的轉(zhuǎn)錄因子，與AtPYE同源，受OsPRI1/2/3正調(diào)控。OsIRO3在根、葉和基節(jié)中表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期葉片中表達(dá)水平較高。OsIRO3基因敲除導(dǎo)致植株對(duì)缺鐵敏感，幼葉嚴(yán)重壞死，根發(fā)育不良，這些證據(jù)表明OsIRO3在響應(yīng)水稻缺鐵上是必不可少的［46］。在缺鐵條件下，iro3在地上部積累了較高水平的鐵，這與上調(diào)OsNAS3的表達(dá)有關(guān)，從而導(dǎo)致尼克酰胺NA（nicotianamine）在根中的積累增加。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，OsIRO3可以直接與OsNAS3啟動(dòng)子中的E-box結(jié)合。此外，在鐵充足的條件下，鐵相關(guān)運(yùn)輸基因的表達(dá)顯著上調(diào)。因此，OsIRO3在響應(yīng)缺鐵的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并且直接負(fù)向調(diào)節(jié)OsNAS3的表達(dá)［46］。同屬于IVb亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH061，與兩個(gè)已知的鐵調(diào)節(jié)因子有很高的序列相似性：與水稻中的OsIRO3有43%的相似性和擬南芥中的AtPYE有49%的相似性。在缺鐵條件下，OsbHLH061基因敲除導(dǎo)致地上部鐵的過(guò)度積累和對(duì)鐵毒害的敏感，而酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明OsPRI1和OsbHLH061互作［47］，表明OsbHLH061是在鐵充足時(shí)與OsPRI1互作共同下調(diào)OsIRO3的表達(dá)，負(fù)向控制鐵向地上部的運(yùn)轉(zhuǎn)和在水稻中的積累，維持鐵穩(wěn)態(tài)。

OsIRO2是屬于bHLH家族Ib亞族的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)水稻中鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因，是OsPRI1的另一個(gè)靶基因。OsIRO2在根和葉中表達(dá)，在缺鐵條件下，OsIRO2在營(yíng)養(yǎng)組織中的表達(dá)僅限于根和葉。OsIRO2過(guò)表達(dá)植株地上部的鐵積累量是普通水稻的2-4倍，這表明OsIRO2是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因［48］?；蛐酒治霰砻鳎琌sIRO2在根中調(diào)控59個(gè)缺鐵誘導(dǎo)基因，如OsNAS1、OsNAS2，煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶OsNAAT1（nicotianamine aminotransferase 1），脫氧麥根酸OsDMAS1（rice synthesizes the Fe chelator 2'-deoxymugineic acid 1），OsYSL15和TOM1都受到OsIRO2的正調(diào)控［49］。而OsIRO3直接調(diào)控OsIRO2的表達(dá)。酵母雙雜交試驗(yàn)表明，OsIRO3與OsPRI1和OsPRI2相互作用，已經(jīng)證實(shí)OsPRI1/2/3通過(guò)直接與OsIRO2啟動(dòng)子結(jié)合并激活其啟動(dòng)子來(lái)正向調(diào)節(jié)OsIRO2的表達(dá)［35］，而OsIRO3與OsPRI1和OsPRI2相互作用抑制了OsPRI1/2對(duì)OsIRO2的轉(zhuǎn)錄激活。因此，OsIRO3通過(guò)抑制OsIRO2的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)鐵的動(dòng)態(tài)平衡［50］。

通過(guò)RNA-seq分析鑒定出的OsbHLH156與擬南芥中的FIT同源，是bHLH家族IIIa亞族的轉(zhuǎn)錄因子，主要在根部表達(dá)且受缺鐵誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)證明OsbHLH156具有轉(zhuǎn)錄激活能力。GUS染色結(jié)果顯示OsbHLH156的表達(dá)模式與OsIRO2相似，主要在根成熟區(qū)的上皮、外皮層、皮層、內(nèi)皮層及中柱表達(dá)。OsIRO2定位在細(xì)胞質(zhì)，OsbHLH156定位在細(xì)胞核，當(dāng)OsIRO2與OsbHLH156共表達(dá)時(shí)，兩蛋白均定位于細(xì)胞核。BIFC和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OsbHLH156與OsIRO2相互作用。在提供三價(jià)鐵條件下，OsbHLH156基因敲除突變體在缺鐵條件下生長(zhǎng)時(shí)葉綠素含量比野生型植株降低了55%，降低了地上部的鐵積累量［51］，這一結(jié)果證明在缺鐵條件下OsbHLH156和OsIRO2對(duì)于激活機(jī)制Ⅱ中鐵的吸收及運(yùn)輸是必不可少的，二者共同正向調(diào)控水稻中三價(jià)鐵的吸收與運(yùn)輸。

雖然水稻和擬南芥采用不同的鐵吸收策略，但是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，無(wú)論是水稻中的OsbHLH156還是擬南芥中的FIT，都通過(guò)與bHLH 家族Ib亞族轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)缺鐵反應(yīng)。OsbHLH156是促進(jìn)OsIRO2核定位所必需的，這一現(xiàn)象最近也被證明在擬南芥中發(fā)生，其中AtbHLH39的核定位需要FIT［52］。這說(shuō)明，這兩種鐵的吸收策略本質(zhì)上并沒(méi)有太大的不同（圖4）。

圖4 水稻中鐵穩(wěn)態(tài)機(jī)制Fig.4 Fe homeostasis mechanism in rice

2.3 其他植物鐵穩(wěn)態(tài)bHLH家族

番茄是機(jī)制I植物，鐵吸收及運(yùn)輸模式與擬南芥相似。FER就是最先從番茄中分離得到的參與高等植物鐵穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，和擬南芥的FIT同源，在根表皮和外層皮層細(xì)胞層中都有表達(dá)［53］。FER激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LeIRT1的表達(dá)，調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)［54］。SlbHLH068是策略I機(jī)制中另一個(gè)bHLH家族的成員，表達(dá)模式與FER的表達(dá)模式具有一定的相似性，在缺鐵條件下表達(dá)量顯著上調(diào)，但不受其他營(yíng)養(yǎng)水平的影響。這表明，SlbHLH068在番茄體內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)中起特異性作用。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，SlbHLH066/067/068與擬南芥中AtbHLH38/AtbHLH39/AtbHLH100高度同源，功能也相近。酵母雙雜交和轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SlbHLH068與FER形成異源二聚體激活了酵母細(xì)胞中由LeFRO1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)［55］。這些結(jié)果表明FER/SlbHLH068異二聚體可以直接結(jié)合并激活LeFRO1的表達(dá)以促進(jìn)鐵的吸收。

木本植物蘋(píng)果也是采取策略I吸收鐵，MdbHLH104被鑒定為蘋(píng)果中應(yīng)對(duì)缺鐵反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，序列與OsPRI1相似。MdbHLH104基因的過(guò)表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株和愈傷組織在缺鐵條件下的H+-ATPase活性和對(duì)鐵缺乏的耐受性［56］。Wang等［47］的研究表明，MdHLH104蛋白直接與MdAHA8基因的啟動(dòng)子結(jié)合正向激活其表達(dá)，以及質(zhì)膜H+ATPase活性和鐵的吸收。類(lèi)似地，MdbHLH104直接調(diào)控了3個(gè)鐵敏感的bHLH基因的表達(dá)，即MdbHLH38、MdbHLH39和MdPYE。此外，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MdBHLH104還與MdbHLH105、MdbHLH115、MdPYE、MdbHLH11和MdbHLH121相互作用，共同調(diào)節(jié)MdAHA8基因的表達(dá)、質(zhì)膜H+-ATPase活性和蘋(píng)果愈傷組織中鐵的含量。因此，MdbHLH104是蘋(píng)果中鐵動(dòng)態(tài)平衡的正調(diào)控因子，與其他蘋(píng)果bHLH家族一起通過(guò)調(diào)控MdAHA8基因的表達(dá)和質(zhì)膜H+-ATPase的活性來(lái)調(diào)節(jié)蘋(píng)果對(duì)鐵的吸收。

從木本植物小金海棠中分離到3個(gè)bHLH基因：MxbHLH01、MxIRO2和MxFIT，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，MxbHLH01的表達(dá)僅限于根，在缺鐵條件下表達(dá)上調(diào)，MxbHLH01可能與其他蛋白質(zhì)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因?qū)θ辫F的響應(yīng)［57］。在缺鐵條件下，MxIRO2在小金海棠的根和葉中均被誘導(dǎo)［58］。它可能與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體或多聚體，以控制與鐵吸收相關(guān)的基因的表達(dá)。目前有關(guān)果樹(shù)應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫的研究較少，還需要進(jìn)一步挖掘果樹(shù)鐵吸收及運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。

3 總結(jié)與展望

目前bHLH轉(zhuǎn)錄因子是已知的在高等生物的代謝、生理和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族［59］。從在番茄中分離出并鑒定FER［60］開(kāi)始，人們就從未停止過(guò)對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的探索與研究，尤其是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫的調(diào)控機(jī)制方面。隨著各種生物技術(shù)手段越來(lái)越完善、相關(guān)研究越來(lái)越多，我們對(duì)bHLH家族成員是如何調(diào)控鐵吸收及運(yùn)輸?shù)臋C(jī)理也越發(fā)清晰明了。通過(guò)對(duì)bHLH在植物各組織基因表達(dá)的檢測(cè)、目的基因在細(xì)胞中的定位情況以及其他一些體外蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)的研究，在缺鐵條件下利用兩種機(jī)制調(diào)控鐵平衡的相關(guān)過(guò)程已經(jīng)相對(duì)清晰地展現(xiàn)在了我們的眼前，然而我們現(xiàn)在仍然不知道這個(gè)網(wǎng)絡(luò)最上游的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是如何調(diào)節(jié)的，以及同亞族相似但非冗余的bHLH轉(zhuǎn)錄因子各自具體的功能也還未被研究，這表明我們?nèi)匀粵](méi)有把這個(gè)鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)完全地探索清楚。我們離完全了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)機(jī)理還有很長(zhǎng)一段距離，還需要在探究真相的道路上繼續(xù)前行。