黃芪建中湯對胃潰瘍大鼠血清炎癥因子、胃黏膜表皮生長因子受體表達(dá)的影響

陳思清,周賽男,韓運(yùn)宗,劉 琴,周 姝

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410021)

胃潰瘍是一種常見的消化系統(tǒng)胃黏膜良性病變,具有發(fā)病率高、易反復(fù)發(fā)作、易導(dǎo)致多種嚴(yán)重并發(fā)癥的特點(diǎn)[1-3]。現(xiàn)階段以西藥治療胃潰瘍多可暫時改善癥狀,降低胃黏膜組織炎癥因子水平,但單純使用西藥治療難使其痊愈,疾病仍易反復(fù)發(fā)作[4-5]。中醫(yī)藥治療胃潰瘍效果顯著,可標(biāo)本兼治,降低疾病的復(fù)發(fā)率。中醫(yī)認(rèn)為,胃潰瘍有脾胃虛寒、脾胃濕熱、肝郁脾虛、寒滯血瘀、寒熱錯雜等多種證型,其中脾胃虛寒證較為常見,溫健中焦、補(bǔ)益脾氣是胃潰瘍的重要治療原則。黃芪建中湯是治療脾胃虛寒證胃潰瘍的主方[6]。且臨床研究證實(shí),黃芪建中湯聯(lián)合西藥治療能夠促進(jìn)胃潰瘍的愈合[7-8]。目前研究發(fā)現(xiàn),黃芪建中湯促進(jìn)胃潰瘍愈合的機(jī)制,可能是通過干擾已損傷胃黏膜細(xì)胞的凋亡程序,促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的增殖修復(fù),增強(qiáng)胃黏膜保護(hù)屏障機(jī)制,上調(diào)大鼠胃黏膜中黏蛋白的比例等[9-10]。本研究進(jìn)一步觀察黃芪建中湯對胃潰瘍大鼠血清炎癥因子及胃黏膜表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor,EGFR)的表達(dá),以探究其促進(jìn)脾胃虛寒型胃潰瘍愈合的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:SPF級成年雄性健康Wistar大鼠,體重190～210 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室。維持實(shí)驗(yàn)室溫度24～26 ℃,濕度50%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始造模。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號CSB-E11987r,武漢華美生物);白介素-1β(IL-1β)試劑盒(批號CSB-E08055r,武漢華美生物);白介素-6(IL-6)試劑盒(批號CSB-E04640r,武漢華美生物);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號CW2569,北京康為世紀(jì));熒光定量試劑盒(批號CW2601,北京康為世紀(jì));EGFR(批號ab52894,美國abcam);β-actin(批號66009-1-Ig,美國Proteintech);酶標(biāo)儀(型號MB-530,深圳匯松科技);熒光定量RCP儀(型號Quant Studio 1,美國Thermo);熒光PCR板(型號SPL0960,美國Thermo)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物:黃芪建中湯由黃芪22 g,白芍18 g,大棗6 枚,桂枝、生姜各9 g,炙甘草6 g,飴糖30 g組成。中藥湯液制備方法:將以上中藥加水煎煮濃縮成1 g/ml的藥液,灌胃劑量為6.8 g/(kg·d)。小承氣湯由大黃12 g、枳實(shí)9 g、厚樸6 g組成。藥液制備方法同黃芪建中湯。于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ陨现兴幘徲诤现嗅t(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房。將奧美拉唑腸溶膠囊(國藥準(zhǔn)字H20170228)用雙蒸水配制成生藥含量為0.21 mg/ml的混懸液,現(xiàn)用現(xiàn)配,灌胃劑量為4.2 mg/(kg·d)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組與給藥:將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、奧美拉唑組和黃芪建中湯組,每組15 只。模型組、黃芪建中湯組、奧美拉唑組大鼠均采用耗氣破氣法結(jié)合饑飽失常法建立脾胃虛寒證模型:隔日灌胃小承氣湯10 g/(kg·d)+灌胃當(dāng)日禁食以致虛,連續(xù)造模10 d后用冰醋酸法[11]處理以上大鼠,術(shù)后繼續(xù)采用耗氣破氣法結(jié)合饑飽失常法處理20 d;黃芪建中湯組及奧美拉唑組大鼠每日下午在模型組基礎(chǔ)上給予相應(yīng)治療藥物;正常組大鼠隔日上午及每日下午予蒸餾水灌胃;期間觀察大鼠形態(tài)改變,記錄各組大鼠體重及進(jìn)食量。

1.2.2 取材與HE染色:禁食24 h后用3%戊巴比妥鈉5 ml/kg麻醉大鼠,麻醉完成后剖開胸部,腹主動脈取血,將全血標(biāo)本室溫靜置2 h,5 ℃條件下5000 r/min離心5 min,將上清液置于-80 ℃冰箱中保存待用。處死大鼠,迅速取大鼠的胃黏膜組織,0.9%氯化鈉溶液漂洗后于液氮中速凍5 min,然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。將部分胃黏膜組織進(jìn)行石蠟包埋,切片,行HE染色,鏡下觀察大鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變。

1.2.3 胃黏膜損傷指數(shù)(UI)評分:觀察記錄各組大鼠胃潰瘍面積,并使用Guth標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算UI評分,評估胃黏膜損傷程度。存在斑點(diǎn)或者糜爛計(jì)1分,糜爛長度<1 mm計(jì)1分,l～2 mm計(jì)2分,2～3 mm計(jì)3分,3～4 mm計(jì)4分,依次類推;若寬度>2 mm,總評分乘以2。UI評分由二人同時評估,取其平均值。

1.2.4 PCR法檢測大鼠胃組織EGFR mRNA表達(dá):取保存在TRIzol中的胃黏膜組織至離心管中,采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成產(chǎn)物cDNA。采用SYBR法對RNA進(jìn)行相對測定,以β-actin作為內(nèi)參,循環(huán)數(shù)和溫度按試劑盒說明書設(shè)置,引物序列由上海生工合成,見表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測大鼠胃組織EGFR蛋白表達(dá):向胃組織中加入RIPA裂解液并反復(fù)研磨組織,離心后收集上清液。SDS-PAGE變性電泳將蛋白按分子量大小分開,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上,膜用封閉液封閉過夜,次日用封閉液稀釋一抗,和膜共同孵育過夜。用封閉液洗去游離的一抗后,以二抗HRP goat anti-mouse IgG和HRP goat anti-rabbit IgG孵育1.5 h,以β-actin作為內(nèi)參。使用Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯色,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像,最后用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.6 ELISA法檢測血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平:腹主動脈取血,室溫靜置2 h后,5 ℃條件下5000 r/min離心5 min,取上清液,按相應(yīng)ELISA試劑盒說明書操作檢測IL-1β、TNF-α及IL-6水平。反應(yīng)終止后使用酶標(biāo)儀測量每孔在450 nm波長下的光密度值(OD值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,若符合正態(tài)分布則用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較,不符合正態(tài)分布則用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì);符合方差齊性用LSD法,不符合方差齊性則用DunnettT3法;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變 正常組大鼠胃黏膜表面光滑無水腫,未見明顯充血,未見潰瘍點(diǎn)及糜爛斑等,各腺體、上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)整,位置連續(xù)有序;模型組大鼠胃黏膜上皮可見破損,皺襞存在中斷,上皮組織可見點(diǎn)狀潰瘍及糜爛,同時可見大量炎性細(xì)胞浸潤;黃芪建中湯組與奧美拉唑組大鼠胃黏膜損傷較模型組明顯減輕,均可見輕度水腫,有少量炎性細(xì)胞浸潤,腺體排布大致規(guī)整,未見明顯潰瘍。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織形態(tài)觀察(HE染色,×400)

2.2 各組大鼠胃黏膜UI評分比較 與正常組比較,模型組UI評分顯著增加(P<0.01);與模型組比較,黃芪建中湯組和奧美拉唑組大鼠UI評分明顯降低(均P<0.01);且黃芪建中湯組和奧美拉唑組大鼠UI評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜UI評分比較(分)

2.3 各組大鼠胃黏膜組織EGFR mRNA及蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜組織EGFR mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,奧美拉唑組、黃芪建中湯組大鼠胃黏膜組織EGFR mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(均P<0.05);奧美拉唑組與正常組EGFR mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3(圖2)。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織EGFR蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠胃黏膜組織EGFR mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-6水平比較 與正常組比較,模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-6水平顯著升高(均P<0.01);與模型組比較,奧美拉唑組、黃芪建中湯組大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-6表達(dá)顯著降低(均P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-6水平比較(ng/ml)

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為,胃潰瘍有脾胃虛寒、脾胃濕熱、肝郁脾虛、寒滯血瘀、寒熱錯雜等多種證型,其中脾胃虛寒證較為常見。脾胃虛寒證胃潰瘍患者予健脾護(hù)胃之藥可以溫脾胃之虛寒,使脾健運(yùn),脾運(yùn)則氣機(jī)得以通暢,陰陽得以調(diào)和[11]。有研究表明,臨床治療胃潰瘍時,輔以健脾溫胃之藥可以助正氣生,邪氣餒,促進(jìn)機(jī)體康復(fù)[12]。黃芪建中湯是治療胃潰瘍脾胃虛寒證之主方,黃芪建中湯源于《金匱要略》,配方主要有黃芪、干姜、炒白術(shù)等藥物,重在溫養(yǎng)脾胃?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為,黃芪建中湯中的有效成分能調(diào)節(jié)與胃黏膜保護(hù)、損傷相關(guān)的因子,減少炎癥因子的產(chǎn)生,抑制炎癥反應(yīng)并強(qiáng)化消化道的免疫調(diào)節(jié)作用,促使胃潰瘍向愈[13-14]。

胃黏膜損傷可導(dǎo)致胃潰瘍,上皮細(xì)胞受損是胃黏膜損傷的病理學(xué)指標(biāo)[15]。EGFR表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面,接受刺激會發(fā)生磷酸化,持續(xù)向細(xì)胞內(nèi)發(fā)送信號,促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化,是黏膜重要保護(hù)因子之一。已有研究表明,通過調(diào)控EGFR相關(guān)信號通路能夠明顯降低炎癥反應(yīng)[16-17]。有研究證明,EGFR及TNF-α等是治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶標(biāo),是多個信號通路的相交靶點(diǎn)[18]。多項(xiàng)研究表明,提高胃黏膜EGFR表達(dá)水平能夠降低炎癥反應(yīng),促進(jìn)胃潰瘍的愈合[19-21]。EGFR與其配體結(jié)合后啟動核內(nèi)相關(guān)基因,促進(jìn)細(xì)胞增殖這一過程對胃癌的發(fā)生與預(yù)后至關(guān)重要。已有多項(xiàng)研究表明,EGFR高表達(dá)對癌癥有著直接誘發(fā)作用,而胃潰瘍長期反復(fù)發(fā)作可能最終發(fā)展為胃癌[22-23]。本研究結(jié)果表明,黃芪建中湯治療后大鼠胃黏膜組織EGFR基因及蛋白表達(dá)均明顯升高,黃芪建中湯組胃黏膜損傷存在顯著改善。說明黃芪建中湯可能通過促進(jìn)EGFR的表達(dá)以激活細(xì)胞增生機(jī)制,促進(jìn)胃潰瘍的愈合。

TNF-α是一種重要的炎癥標(biāo)志物,在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要致炎作用,其主要來自于活化的巨噬細(xì)胞。正常水平的TNF-α能發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫及抗感染的作用并以此維持機(jī)體的健康狀態(tài),若TNF-α高表達(dá),則會產(chǎn)生相反的效應(yīng),誘發(fā)炎癥,使機(jī)體免疫失衡等[24]。除此之外,TNF-α還能誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,如IL-1、IL-2、IL-6等,以促進(jìn)炎癥反應(yīng),并加重胃潰瘍黏膜損傷[25]。本研究表明,黃芪建中湯治療后大鼠胃黏膜組織TNF-α、IL-6及IL-1β表達(dá)水平明顯降低,炎癥反應(yīng)明顯減輕,胃黏膜組織病理改變較模型組明顯好轉(zhuǎn)。本研究通過采用黃芪建中湯治療脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠,探究黃芪建中湯治療胃潰瘍的作用機(jī)制。研究結(jié)果提示,黃芪建中湯治療后胃潰瘍大鼠胃黏膜受損程度明顯改善,胃黏膜組織EGFR mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯降低,炎癥反應(yīng)明顯減輕。

綜上所述,黃芪建中湯治療脾胃虛寒型胃潰瘍可顯著改善胃黏膜損傷,其作用機(jī)制可能與黃芪建中湯升高EGFR mRNA及蛋白表達(dá)、降低炎癥因子水平有關(guān)。