七葉皂苷影響急性心肌梗死心肌損傷的機(jī)制研究

馬旭輝 方天富 岑明秋 俞佳

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的心血管疾病，發(fā)病快且死亡率高[1]。AMI 發(fā)生時(shí)，冠狀動(dòng)脈急性閉塞造成心肌缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)丟失，導(dǎo)致心室重塑甚至心力衰竭[2]。同時(shí)，AMI 觸發(fā)的缺氧微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)廣泛的心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重心臟損傷[3-4]。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡可能是改善AMI 患者預(yù)后的重要策略。七葉皂苷是從七葉樹(shù)科植物天師粟的干燥成熟種子中提取得到的五環(huán)三萜皂苷，在多個(gè)癌細(xì)胞模型中表現(xiàn)出抗癌作用，包括肺腺癌、肝細(xì)胞癌和白血病[5]。此外，七葉皂苷還具有清除自由基、促進(jìn)血管舒張的生物學(xué)功能[6]。過(guò)去研究表明，七葉皂苷可降低血管通透性，抑制缺氧引起的血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的積累，進(jìn)而保護(hù)缺氧引起的組織損傷[7]。由此推測(cè)七葉皂苷可能對(duì)調(diào)控AMI 的進(jìn)展有一定作用，但目前關(guān)于七葉皂苷和AMI 關(guān)系的研究還很少。本研究通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究七葉皂苷參與調(diào)控AMI 心肌損傷的機(jī)制，以期為尋找AMI 治療新藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 2 月齡雄性SD 大鼠60 只，由杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，溫度（24±2）℃，濕度45%～55%，12 h 光照。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由飲食和飲水。大鼠心肌細(xì)胞H9C2 株（批號(hào)：CL-0089）購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司（武漢），使用含10% FBS和1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，正常傳代。

1.1.2 主要試劑 七葉皂苷（批號(hào)：6805-41-0）購(gòu)自德國(guó)默克生物公司；miR-140-5p 模擬物由吉瑪基因合成；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（批號(hào)：ab196495）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）（批號(hào)：ab32503）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號(hào)：ab8245）抗體均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液（批號(hào)：G3005）、細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（批號(hào)：CA1210）、原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：T2190）均購(gòu)自索萊寶科技有限公司（北京）；改良Eagle 培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（批號(hào)：C11995500BT）、Invitrogen TRIzol（批號(hào)15596018）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒（批號(hào)：B532453-0020）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；HieffqPCR SYBRGreen Master Mix PCR 試劑盒（批號(hào)：11201ES08）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20201ES76）均購(gòu)于翊圣生物（上海）科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 60 只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、AMI 組、AMI+低劑量七葉皂苷（LE）組和AMI+高劑量七葉皂苷（HE）組，每組15 只（造模死亡率較高，最終每組取6 只）。按6 mg/kg 的劑量腹腔注射舒泰麻醉，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率80 次/min，吸氣/呼氣時(shí)間比1∶2。連接心電圖監(jiān)測(cè)。左側(cè)開(kāi)胸，暴露心臟，在冠狀動(dòng)脈起始部2～3 mm 處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending，LAD）。觀察標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)碾妶D，出現(xiàn)ST 段和（或）T 波抬高或降低，心臟局部顏色變暗等心肌缺血變化作為結(jié)扎成功的標(biāo)志，關(guān)胸。假手術(shù)組只開(kāi)胸，不做LAD 結(jié)扎處理。七葉皂苷用0.9%氯化鈉溶液溶解，建模前LE 組和HE 組大鼠分別給予2、10 mg/kg 七葉皂苷灌胃7 d，另兩組等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，批準(zhǔn)文號(hào)：ZJCLA-IACUC-20020109。

1.2.2 細(xì)胞處理和分組 取H9C2 細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105個(gè)/mL 接種至12 孔板，加入20 nmol/L 無(wú)血清培養(yǎng)基配置的miR-140-5p 模擬物，0.5 μL/孔，使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，換新鮮DMEM 培養(yǎng)基。七葉皂苷用磷酸鹽緩沖液配制成10 mmol/L 母液，使用時(shí)按需（10 μmol/L）加入到培養(yǎng)基中。根據(jù)處理將細(xì)胞分為對(duì)照組、低氧組、七葉皂苷組、模擬物組。對(duì)照組正常培養(yǎng)；低氧組細(xì)胞置于含1% O2的低氧培養(yǎng)箱；七葉皂苷組加入10 μmol/L 七葉皂苷，低氧培養(yǎng)；模擬物組細(xì)胞經(jīng)miR-140-5p 模擬物轉(zhuǎn)染后加入10 μmol/L 七葉皂苷，轉(zhuǎn)至低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 大鼠心功能檢測(cè) 采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。大鼠麻醉后連接超聲診斷儀，連接Ⅱ?qū)碾妶D，在LAD 結(jié)扎后，檢測(cè)心功能指標(biāo)。探頭置于胸骨左側(cè)，與胸骨中線成10°～30°，顯示胸骨左室長(zhǎng)軸切面，探頭順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°顯示左室短軸切面。由二維圖像引導(dǎo)取M型曲線并進(jìn)行測(cè)量。顯示胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面后，探頭略向左偏即顯示肺動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面。在胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面和肺動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面上進(jìn)行二尖瓣、主動(dòng)脈瓣和肺動(dòng)脈各瓣口的多普勒血流檢測(cè)，利用SteeringAngle 功能，使多普勒角度盡量小，分別為18°、50°和2°。測(cè)量各組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESd）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和左室短軸縮短率（left ventricular short-axis shortening rate，F(xiàn)S）。

1.3.2 大鼠心肌梗死面積檢測(cè) 采用TTC 染色法。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)束后通過(guò)頸椎脫臼法處死大鼠，分離心臟，4 ℃PBS 溶液洗凈，-20 ℃冷凍30 min。取心臟組織進(jìn)行切片，厚度約2 mm。將切片放入TTC 染色液中37 ℃避光孵育30 min，每隔10 min 翻動(dòng)1 次，使其充分染色。取出心臟切片，用PBS 洗2～3 遍后拍照。心臟非梗死區(qū)染為紅色，梗死區(qū)呈灰白色。選擇每一切片的尾側(cè)面用PhotoShop 軟件進(jìn)行分析，測(cè)量每片的梗死面積和總面積。

1.3.3 大鼠心肌組織和H9C2 細(xì)胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot 法。使用蛋白裂解液提取心肌組織和H9C2 細(xì)胞蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，并通過(guò)BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒完成蛋白定量。使用聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，緩沖液洗3 次，每次5～10 min，加入Bcl-2、Bax 一抗，4 ℃冰箱里孵育過(guò)夜。用TBST 洗3 次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG 二抗，室溫下孵育2 h，用TBST 洗3 次，每次10 min。使用蛋白印跡HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒,使蛋白條帶可視化。使用Image J 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)灰度分析，以GAPDH 為參照，計(jì)算Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 大鼠心肌組織和H9C2 細(xì)胞中miR-140-5p 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。利用Invitrogen TRIzol提取心肌組織和H9C2 細(xì)胞的RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。采用miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄miRNA，使用HieffqPCR SYBRGreen Master Mix PCR 試劑盒檢測(cè)miR-140-5p 的表達(dá)水平，以U6 為內(nèi)參，據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 H9C2 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8 法。取各組H9C2 細(xì)胞，加入10 μL/孔CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.3.6 H9C2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL 染色法。取各組H9C2 細(xì)胞，用4%多聚甲醛（室溫）固定20 min，PBS 清洗，加入Triton X-100 處理細(xì)胞20 min。PBS 洗2 遍，加入150 μL TUNEL 反應(yīng)液，在37 ℃條件下處理60 min。然后用DAPI 染核5 min，PBS 洗2 遍，使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度。相對(duì)熒光強(qiáng)度越大，表明細(xì)胞凋亡程度越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠心功能比較 與假手術(shù)組相比，AMI 組大鼠LVEDd 和LVESd 顯著增大，EF 和FS 顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明AMI 模型構(gòu)建成功。與AMI 組相比，LE 組和HE 組大鼠LVEDd 和LVESd 顯著減小，EF 和FS 顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；相比LE 組，HE 組變化更顯著，提示七葉皂苷濃度越高，心功改善效果越顯著。見(jiàn)表2。

表2 4 組大鼠心功能指數(shù)比較

2.2 4 組大鼠心肌組織Bax 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較 與假手術(shù)組相比，AMI 組中Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示細(xì)胞凋亡加劇。相比AMI 組，LE 組和HE 組Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；相比LE 組，HE 組變化更顯著。提示七葉皂苷可抑制AMI 大鼠心肌組織凋亡，且呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1 4 組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較（A：蛋白電泳圖；B：Bcl-2 和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平）

2.3 4 組大鼠心肌梗死面積和miR-140-5p 表達(dá)水平比較 假手術(shù)組大鼠心肌無(wú)梗死區(qū)域，AMI 組心肌梗死面積較大。相比AMI 組，LE 組和HE 組心肌梗死面積減少；相比LE 組，HE 組梗死面積更小，提示具有濃度依賴(lài)性，見(jiàn)圖2A（插頁(yè)）。與假手術(shù)組相比，AMI 組miR-140-5p 表達(dá)水平顯著增加，與AMI 組相比，LE 組和HE 組miR-140-5p 表達(dá)水平顯著降低，與LE 組相比，HE 組miR-140-5p 表達(dá)水平進(jìn)一步降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），推測(cè)七葉皂苷可能通過(guò)下調(diào)miR-140-5p 表達(dá)水平改善AMI 大鼠的心肌損傷，見(jiàn)圖2B（插頁(yè)）。

圖2 4 組大鼠心肌梗死面積和miR-140-5p 表達(dá)水平比較（A：心臟切片觀察；B：梗死面積；C：miR-140-5p 表達(dá)水平）

2.4 4 組H9C2 細(xì)胞活性和miR-140-5p 表達(dá)水平比較 相比對(duì)照組，低氧組細(xì)胞活性顯著降低（圖3A）；相比低氧組，七葉皂苷組細(xì)胞活性顯著上升；相比七葉皂苷組，模擬物組細(xì)胞活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3A。 相比對(duì)照組，低氧組miR-140-5p 表達(dá)水平顯著升高；相比低氧組，七葉皂苷組miR-140-5p 表達(dá)水平顯著降低；相比七葉皂苷組，模擬物組miR-140-5p 表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3B。提示七葉皂苷通過(guò)抑制miR-140-5p 表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞活性。

圖3 4 組細(xì)胞活性和miR-140-5p 表達(dá)水平比較（A：細(xì)胞活性；B：miR-140-5p 表達(dá)水平）

2.5 4 組H9C2 細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 相比對(duì)照組，低氧組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，Bax 升高；相比低氧組，七葉皂苷組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，Bax 降低；相比七葉皂苷組，模擬物組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，Bax 升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4A（插頁(yè)）。相比對(duì)照組，低氧組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高，相比低氧組，七葉皂苷組相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；相比七葉皂苷組，模擬物組相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4B（插頁(yè)）。提示七葉皂苷對(duì)細(xì)胞凋亡的改善作用能被miR-140-5p 模擬物逆轉(zhuǎn)。

圖4 4 組細(xì)胞凋亡水平比較（A：Bcl-2 和Bax 蛋白電泳圖和表達(dá)水平比較；B：細(xì)胞凋亡檢測(cè)和比較）

3 討論

AMI 是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，盡管再灌注能夠成功地減少梗死面積和改善總體預(yù)后，但AMI 仍然是心力衰竭發(fā)病率和死亡率增加的主要原因[8]。研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞的突然大量丟失超過(guò)心肌的有限再生時(shí)會(huì)進(jìn)一步加重缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷[9]。AMI 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是多方面的，包括炎癥和氧化應(yīng)激。但是目前AMI 脅迫心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不完全清楚，也沒(méi)有高效的藥物干預(yù)此過(guò)程。因此，探索AMI 誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，開(kāi)發(fā)抑制心肌細(xì)胞凋亡的有效藥物對(duì)于AMI 的治療具有重要意義。本研究成功構(gòu)建了AMI 動(dòng)物和細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)AMI 大鼠心功能下降，主要表現(xiàn)在LVEDd 和LVESd 增加，EF 和FS 降低，心臟組織出現(xiàn)大面積梗死區(qū)，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)下調(diào)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在低氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中，細(xì)胞活性降低，凋亡水平升高。

許多研究描述了七葉皂苷在卵巢、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等各種組織病理生理中的作用，也研究了它在腫瘤中的作用。Selvakumar 等[10]認(rèn)為，七葉皂苷在帕金森病中具有抗凋亡和抗氧化應(yīng)激作用，可以改善帕金森患者的運(yùn)動(dòng)功能。Wang 等[11]認(rèn)為，七葉皂苷對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有抗氧化應(yīng)激作用。Cheng 等[12]認(rèn)為，七葉皂苷可調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞凋亡。最近的數(shù)據(jù)證實(shí)了七葉皂苷在降低發(fā)炎組織的血管通透性方面的抗炎特性，從而抑制水腫形成[13]。在體內(nèi)，七葉皂苷可通過(guò)減輕體質(zhì)量、改善糖脂代謝、部分拮抗低度炎癥和改善胰島素抵抗來(lái)預(yù)防或治療肥胖[14]，減輕糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)病變[15]。此外，七葉皂苷通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在AMI 動(dòng)物和細(xì)胞模型中，心肌細(xì)胞損傷都十分顯著，七葉皂苷處理后，心肌損傷有所改善，且七葉皂苷濃度越高，改善效果越明顯。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)高度保守的非編碼RNA，是轉(zhuǎn)錄后主要的調(diào)控因子，幾乎參與所有細(xì)胞過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA 是心臟病生理和病理過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。如miR-27a-5p 可通過(guò)抑制Atg7 減輕缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷[18]，miR-21 通過(guò)蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱(chēng)AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mamamalian target of rapamycin，mTOR）通路減少細(xì)胞凋亡，緩解缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞損傷[19]。此外，miR-223 通過(guò)Akt/mTOR 通路靶向DNA 修復(fù)酶（poly-ribose polymerase，PARP）-1，緩解缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞過(guò)度自噬和凋亡[20]。miR-133a 是心臟中最豐富的miRNA之一，多項(xiàng)研究表明，miR-133a 參與了心肌梗死的早期病理以及隨后的心臟重塑[21]。miR-208 通過(guò)靶向抑制程序性細(xì)胞死亡因子（programmed cell death，PDCD）4 抑制急性心肌梗死小鼠心肌組織凋亡[22]。miR-122-5p 的循環(huán)細(xì)胞外囊泡穿梭以Bcl-2 依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的活力和凋亡[23]。這些研究提示miRNA 可能成為缺血性心臟病治療的潛在靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p 在AMI 動(dòng)物和細(xì)胞模型中都呈現(xiàn)高表達(dá)，但經(jīng)過(guò)七葉皂苷治療后，不僅心肌損傷有所改善，還能降低miR-140-5p 的表達(dá)水平，并且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。近年研究表明，miR-140-5p 的異常表達(dá)與心臟疾病相關(guān)。miR-140-5p 不僅參與調(diào)控糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡[24]，還能靶向Bcl-2 L1 促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[25]。本研究轉(zhuǎn)染miR-140-5p 模擬物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)七葉皂苷對(duì)低氧誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞損傷的改善作用被逆轉(zhuǎn)，表明七葉皂苷可能通過(guò)抑制miR-140-5p 表達(dá)，改善AMI 心肌損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷通過(guò)調(diào)控miR-140-5p參與AMI 心肌損傷。本研究結(jié)果為探索AMI 誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效抑制心肌細(xì)胞凋亡靶向藥物提供理論依據(jù)，對(duì)AMI 防治具有重要意義。