干細胞及其衍生物促進骨結(jié)合的應(yīng)用進展

葉鑫健 姜禾 夏思齊 白怡婧 戴雨薇 陳謙明

口腔種植術(shù)是近年來蓬勃發(fā)展的一種用于修復缺失牙的臨床治療技術(shù)。骨結(jié)合指負載的種植體表面與發(fā)育良好的骨組織在結(jié)構(gòu)與功能上的緊密結(jié)合，是口腔種植的重要理論基礎(chǔ)[1]。種植區(qū)骨質(zhì)量不佳和機體骨愈合能力下降是導致種植早期骨結(jié)合失敗的常見原因，而即刻種植的發(fā)展也對早期高強度的骨結(jié)合提出了更加嚴苛的要求[2]。種植體表面生物化學改性是促進骨結(jié)合的常用方法，該方法將表達生物活性分子的修飾物固定于種植體表面，以誘導內(nèi)源性干細胞成骨向分化及成骨細胞的增殖礦化，但當骨代謝受損時修飾效果欠佳[3]。干細胞是一類高度增殖、自我更新的多向分化潛能細胞，具有強大的生物學功能。近年來，隨著再生醫(yī)學與組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，干細胞及其衍生物在口腔頜面部骨再生及修復重建領(lǐng)域的應(yīng)用潛力逐漸被挖掘，其在促進種植體周骨組織改建和早期骨結(jié)合中的作用初露鋒芒[4]。一方面，以干細胞及其衍生物為修飾涂層的組織工程化種植體具有良好的生物活性和成骨能力，為種植體表面生物化學改性開辟了新的思路；另一方面，植入具有適當誘導指向性的外源性干細胞及其衍生物能夠有效改善受損條件下的骨代謝，有效拓寬種植手術(shù)的適應(yīng)證范圍[5]。本文就干細胞及其衍生物在促進骨結(jié)合方面的應(yīng)用進展作一綜述，以期推動干細胞治療在口腔種植術(shù)和再生醫(yī)學領(lǐng)域的進一步研究和應(yīng)用。

1 應(yīng)用于骨結(jié)合的干細胞類型

1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs） BMSCs 是骨改建的主響應(yīng)細胞，因具有多向分化潛能、高增殖能力及低免疫原性等優(yōu)點，已成為促進骨結(jié)合相關(guān)研究的主要干細胞類型[6]。Jiang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)光控BMSCs 片狀植入物復合體可促進種植區(qū)產(chǎn)生更活躍的骨再生和更牢固的骨結(jié)合，從而降低種植體周圍愈合不良風險和炎癥發(fā)生率。BMSCs 是目前應(yīng)用和研究最為廣泛的干細胞類型，臨床轉(zhuǎn)化前景也最為廣泛。

1.2 牙源性干細胞（dental stem cells，DSCs） DSCs 包括牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、人脫落乳牙干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）、牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）等類型，可通過微創(chuàng)的方法從離體乳牙、正畸牙或智齒中提取[8]。Cao 等[9]研究表明載有SHEDs 的種植體能夠有效改善犬種植體周骨質(zhì)量，并加速早期骨結(jié)合。DSCs 來源豐富且無倫理爭議，兼具高增殖能力與分化潛能，其相關(guān)臨床研究也正在有序開展。

1.3 脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）ADSCs 來源于脂肪組織，具有多向分化潛能[10]。Bressan 等[11]將播種于羥基磷灰石支架的ADSCs 植入犬即刻種植模型后，觀察到其具有促進血管、成骨細胞和骨基質(zhì)形成以及加速種植體周圍缺損骨愈合的治療效果。ADSCs 因取材方便、取材量大、創(chuàng)傷小等優(yōu)點，已成為近年來的研究熱點。

1.4 小造血干細胞（small blood stem cells，SBSCs）SBSCs 源于人外周血、骨髓及臍帶血，具有提取率高、可塑性強、耐受性良好等特征，其來源豐富、免疫排斥風險低，非常適用于自體移植[12]。Ou 等[13]研究證實SBSCs 治療在低密度骨動物模型中具有平衡種植體應(yīng)力和促進早期骨結(jié)合的作用。Sheng 等[14]的Ⅰ期臨床試驗證實，牙科植入SBSCs 治療嚴重骨缺損患者的有效性、安全性和耐受性均十分顯著，SBSCs 可抑制骨結(jié)合過程中的炎癥反應(yīng)，提高患者術(shù)后舒適度，在臨床實踐中有一定的應(yīng)用潛力。

2 干細胞局部移植的組織工程應(yīng)用

干細胞的局部移植利用組織工程化載體將干細胞直接轉(zhuǎn)移至種植體周組織床，以構(gòu)建利于骨生長的局部微環(huán)境與三維分層結(jié)構(gòu)。該應(yīng)用方式依賴于組織工程學技術(shù)的發(fā)展，細胞膜片技術(shù)、組織工程支架技術(shù)等新型技術(shù)的開發(fā)最大限度地保留了移植過程中的細胞活性，其成骨效益也被應(yīng)用于引導骨再生（guided bone regeneration，GBR）術(shù)、上頜竇底提升（sinus floor elevation，SFE）術(shù)等骨組織增量技術(shù)。

2.1 干細胞膜片技術(shù) 干細胞膜片技術(shù)指將純化的干細胞與種植體進行體外共培養(yǎng)，在種植體表面構(gòu)建細胞外基質(zhì)與致密干細胞片層的活性修飾物[15]。該技術(shù)無需蛋白水解酶，減少或避免了移植細胞的破壞及分化表型喪失，外源性干細胞直接增加了種植體表面活性細胞數(shù)量，是種植體表面生物化學改性的理想備選方案[16]。先前研究將兔BMSCs 膜片組裝附著于種植體表面，從組織學、基因調(diào)控和種植體表征等方面證實了其體內(nèi)外的成血管成骨耦合能力[17]。近年來，使用經(jīng)基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄控制的細胞膜片技術(shù)通過加強成骨相關(guān)基因及信號通路的表達，促進了植入的干細胞成骨向分化，已成為研究熱點之一。當前，抗微小RNA（mircoRNA，miRNA）-138 遞送和nel 樣Ⅰ型基因（nel-like typeⅠgene，nell-1）過表達的BMSCs 細胞膜片均取得了可觀的促骨結(jié)合效果[18-19]。在2 型糖尿病大鼠[20]、去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠[21]和放療后大鼠[22]等骨代謝缺陷動物模型中，BMSCs 膜片均展現(xiàn)出改善植入?yún)^(qū)骨質(zhì)量、促進種植體周骨組織的愈合再生和加速種植體骨結(jié)合的強大潛能，這提示該技術(shù)的應(yīng)用可有效提高臨床種植治療的成功率，尤其在骨狀況不佳的情況下。

隨著納米材料的發(fā)展，光控細胞片、熱響應(yīng)細胞片、磁控細胞片、活性氧誘導細胞片等膜片制備技術(shù)應(yīng)運而生[23-24]。新型制備技術(shù)的發(fā)展有望解決細胞膜片離體保存時間短、生物活性損傷、降解緩慢等技術(shù)難題[7，25]。

2.2 組織工程支架技術(shù) 組織工程支架技術(shù)將富含生長因子的高濃度離體干細胞體外移植至可吸收聚合物支架上并回植入組織缺損部位，待支架材料降解后，缺損區(qū)被干細胞及其分泌的基質(zhì)所代替，進而修復、再造和重建缺損組織[26-27]。具有一定機械強度的三維立體支架保障了種植體的初期穩(wěn)定性，適用于伴有重度骨缺損、牙槽骨萎縮患者的種植或即刻種植[28]。以BMSCs 為種子細胞聯(lián)合富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）的骨組織生物支架表現(xiàn)出良好的骨再生相容性，被證實具有優(yōu)化缺損區(qū)再生骨質(zhì)量、提高種植體初期穩(wěn)定性等作用[29-30]。一項8 年隨訪的臨床研究證實，該類型支架在牙槽骨嚴重萎縮的種植患者中長期應(yīng)用同樣具有安全性、有效性和穩(wěn)定性[31]。播種于組織工程支架的ADSCs 在犬即刻種植模型中也表現(xiàn)出促成骨鈣化的類似生物學效應(yīng)[11]。但Stramandinoli-Zanicotti 等[32]在小型豬即刻種植模型中卻未檢測到BMSCs-PRP 支架促骨結(jié)合的顯著性積極效應(yīng)，這可能與植入設(shè)計、支架材料、動物模型種類等因素有關(guān)。

最新研究發(fā)現(xiàn)，生物3D 打印的組織工程支架將種子細胞混入液態(tài)高分子材料或水凝膠，組成“生物墨水”[33]，利用影像技術(shù)對種植區(qū)復雜結(jié)構(gòu)及缺損進行精準設(shè)計，實現(xiàn)了對干細胞分布及材料降解速率的有效調(diào)控[34]。3D 打印技術(shù)能與干細胞移植相輔相成，制造具有更佳形態(tài)匹配、機械抗性與生物相容性的組織工程支架[35]。如何達到支架的降解性能、生物力學性能和種子細胞活性的最佳平衡狀態(tài)是近年來發(fā)展的技術(shù)難點[36]。

2.3 骨組織增量應(yīng)用 干細胞移植物的骨增量作用已在動物基礎(chǔ)實驗中得到證實。有研究發(fā)現(xiàn)在兔GBR 術(shù)中添加ADSCs 膜片可有效促進骨缺損區(qū)新骨形成，并由此推斷干細胞植入物可以輔助傳統(tǒng)植骨材料或生物屏障膜以提高GBR 術(shù)的治療效能[37]。無獨有偶，使用基因轉(zhuǎn)導BMSCs 生物支架行犬SFE 術(shù)也取得了類似的促成骨效果[38]。種植區(qū)充足的骨量及致密的骨質(zhì)是形成良好骨結(jié)合的必要條件，臨床種植手術(shù)常需輔以GBR 術(shù)和SFE 術(shù)等軟硬組織增量技術(shù)以改善術(shù)區(qū)骨質(zhì)量。干細胞的局部移植協(xié)同骨組織增量技術(shù)具有良好療效，為骨量不足患者種植手術(shù)的開展提供了有利條件[39-40]。一項臨床隨機對照試驗表明BMSCs 自體移植促進了SFE 術(shù)中的骨愈合[41]，提示干細胞移植在上頜竇嚴重萎縮患者的鼻竇重建、顱面骨缺損再生和種植手術(shù)中具有廣闊的臨床應(yīng)用潛力。

3 干細胞衍生物及其應(yīng)用

干細胞衍生物是由干細胞釋放或分泌到細胞外間質(zhì)的生物活性成分，包括細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等[42]。干細胞衍生物通過脫細胞的方法去除了移植物中的細胞成分并保留其功能性產(chǎn)物，降低了移植物的抗原性和免疫排斥風險[43]。但干細胞衍生物并不能直接補充成骨細胞數(shù)量，更多起到的是骨誘導的作用。負載于種植體表面的干細胞衍生物可在種植手術(shù)產(chǎn)生的骨創(chuàng)傷微環(huán)境的誘導下，促使BMSCs 募集及成骨向分化，從而實現(xiàn)良好的骨愈合和早期骨結(jié)合[44]。

3.1 干細胞衍生ECM ECM 是細胞內(nèi)環(huán)境中大分子物質(zhì)所構(gòu)成的復雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。ECM 片層在細胞膜片的基礎(chǔ)上經(jīng)脫細胞制備而成，應(yīng)用于種植體表面可構(gòu)建適宜BMSCs 成骨向分化的納米結(jié)構(gòu)與微生化環(huán)境[45]。Fu 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 衍生ECM 包覆在電紡納米纖維表面可顯著增強BMSCs 的黏附增殖和分化成骨能力，與Feng 等[47]在鈦種植體表面觀察到的變化和體內(nèi)種植實驗結(jié)果類似。干細胞衍生ECM 片層有效實現(xiàn)了材料與種植體周圍微環(huán)境的動態(tài)互動，為種植材料表面改性提供了新的策略[48]。此外，以干細胞衍生ECM 為內(nèi)容物的生物活性支架材料具有高生物活性、生物相容性和易用性，在骨生物工程和組織再生領(lǐng)域取得了較大的進展[49]。

3.2 干細胞衍生EVs EVs 是細胞分泌的異質(zhì)性脂雙層膜性囊泡，其內(nèi)容物包含豐富的生物學信號，在細胞間信息傳遞與交流中起到重要作用[50]。裝載到種植體表面的包含有成骨生物信號的干細胞衍生EVs 能有效調(diào)節(jié)BMSCs 血管生成、骨形成與骨改建進程。Ma 等[51]研究發(fā)現(xiàn)，負載精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列信號肽的BMSCs 衍生EVs 涂層的鈦植入物促進了BMSCs 的成骨分化和礦化，顯著增強了種植體骨結(jié)合。利用組織工程技術(shù)對干細胞衍生EVs 內(nèi)容物進行人工改造與重構(gòu)，可靶向輸送生物活性因子并調(diào)節(jié)局部骨代謝[50]。

4 干細胞的全身移植應(yīng)用

干細胞的全身移植指通過注射或介入治療的方法將干細胞移植入患者體內(nèi)，以修復或替換受損組織細胞，是干細胞治療的傳統(tǒng)方式。外源性干細胞直接彌補了受損機體干細胞活性低下及數(shù)量不足的缺陷，適用于自發(fā)性修復受限的患者[52]。有研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs 聯(lián)合神經(jīng)生長因子腹腔注射能夠促進大鼠成骨相關(guān)基因表達，提高大鼠種植體周骨小梁密度、數(shù)量與厚度，并加速種植體早期骨結(jié)合，但全身移植的干細胞常需輔以特定成骨誘導性的生物活性因子，其臨床應(yīng)用的安全性仍有待進一步探究[53]。

糖尿病、骨質(zhì)疏松癥及放療患者因骨結(jié)合受限，被認為是口腔種植的相對或絕對禁忌證，干細胞的全身移植旨在通過調(diào)節(jié)機體新陳代謝、控制基礎(chǔ)性疾病的發(fā)展以拓寬臨床種植的適應(yīng)證范圍[54]。較局部移植而言，干細胞的全身移植要求更高的移植量，其潛在風險和時間經(jīng)濟成本也會隨之提高，目前臨床應(yīng)用僅限于常規(guī)種植手術(shù)及軟硬組織增量技術(shù)無法解決的領(lǐng)域，以期使原本無法進行種植修復的情況同樣適用種植療法[55]。

5 小結(jié)與展望

干細胞及其衍生物具有強大的促血管成骨耦合等生物學效能，干細胞類型豐富，應(yīng)用方式多樣，可直接或間接應(yīng)用于促進種植體周圍骨愈合和早期骨結(jié)合，在骨組織再生領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。負載特定干細胞成分的細胞膜片或生物涂層作為種植體表面生物化學改性的新方法，可用來構(gòu)建兼具成骨活性與低免疫原性的組織工程化種植體。

相較于噴砂、等離子處理、物理氣相沉積、激光處理、微弧氧化處理、生物分子吸附等常規(guī)種植體表面改性方法，干細胞療法較好地解決了引導成骨、優(yōu)化種植體表面、增加生物嵌合等3 者的平衡問題。一方面，外源性引入的具有成骨分化導向的干細胞及其衍生物引導成骨作用顯著，直接參與了種植體周圍骨改建的生物進程；另一方面，干細胞膜片技術(shù)、組織工程支架技術(shù)和骨組織增量等新興組織工程技術(shù)的應(yīng)用為干細胞在種植體表面牢固的生物嵌合提供了保障。此外，干細胞療法有效改善了局部骨質(zhì)量或全身機體狀態(tài)，彌補了內(nèi)源性干細胞活性低下或數(shù)量不足的缺陷，為種植手術(shù)的開展掃清了障礙，尤其適用于骨缺損、牙槽骨萎縮、骨質(zhì)疏松癥、即刻種植和放療后的患者。但需注意的是，現(xiàn)階段干細胞及其衍生物在口腔種植領(lǐng)域的臨床應(yīng)用推廣仍存在一些問題亟待解決。首先，覆蓋于種植體表面的涂層修飾物會因種植手術(shù)過程中不可避免的摩擦產(chǎn)熱導致磨損磨耗、細胞活性降低乃至涂層松動脫落，增加兩者結(jié)合強度的方法仍待進一步探索；其次，不同集落來源干細胞的表型異質(zhì)性和生長能力存異，能夠產(chǎn)生實質(zhì)臨床效應(yīng)的最小移植量存在個體差異性且難以預測；再者，外源性干細胞及其衍生物常需輔以成骨導向生物活性因子，其最佳類型、搭載量、釋放率及相互作用機制目前尚無定論，待進一步優(yōu)化以維持移植物的成骨活性與長期穩(wěn)定性；最后，干細胞研究受到倫理學與法律的嚴格限制，國內(nèi)干細胞移植的監(jiān)管體系尚未成熟，其適應(yīng)證和禁忌證仍需更加精準的把控。

作為再生醫(yī)學最具前景的治療方法之一，干細胞及其衍生物具有很大的臨床應(yīng)用潛力。相信隨著組織工程技術(shù)的深入和相關(guān)政策的完善，干細胞療法將會取得更大的突破，以更好實現(xiàn)骨組織與種植體之間持久、牢固而直接的骨結(jié)合，為種植患者帶來福音。