乳腺癌細(xì)胞著絲粒蛋白W表達(dá)水平對抗腫瘤藥物TEOA敏感性的影響

王陸洋 張寅昊 孫曉彤 李可意 周俊宇 唐陸勝 楊陳 王瑩

最新全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌發(fā)病率達(dá)31%，且預(yù)后差、復(fù)發(fā)率和死亡率均較高[1-4]。新型免疫療法被認(rèn)為可有效提高患者療效和相對生存率，但在低收入人群較多的發(fā)展中國家，免疫療法的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)仍然較重[5-6]，術(shù)后化療仍是現(xiàn)階段治療乳腺癌的一線療法。但長期使用化療藥物極易產(chǎn)生耐藥性，患者預(yù)后不理想[7-8]。因此，尋找更為有效的治療方案成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[9]。早期篩查乳腺癌并發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)有助于降低乳腺癌死亡率，是延長患者生存期的新策略[10-11]。著絲粒蛋白W（centromeric protein W，CENPW）是構(gòu)成著絲粒核小體的重要組成部分，在多種腫瘤組織中高表達(dá)[12-13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CENPW 可影響結(jié)腸癌細(xì)胞遷移，并通過TGF-β 信號通路影響肺癌進(jìn)程[14-15]。此外，緊密連接蛋白1（claudin-1，CLDN1）是細(xì)胞間通訊和調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，同樣在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。Wang 等[18]研究認(rèn)為CENPW 可能是乳腺癌發(fā)展過程中的重要生物標(biāo)志物，下調(diào)CENPW 表達(dá)是抑制乳腺癌發(fā)展的一種前瞻性策略。2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（2α,3α,24-thrihydroxyurs-12-en-28-oicacid，TEOA）是從草藥毛花獼猴桃根中提純出的一種五環(huán)三萜類化合物，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性[19]。本研究探討乳腺癌細(xì)胞CENPW 表達(dá)水平對抗腫瘤藥物TEOA 敏感性的影響，以期提高TEOA 對乳腺癌的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，在含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。TEOA（粉劑，10 mg）由浙江大學(xué)藥學(xué)院贈予，用二甲基亞砜配成10 mmol/L的母液，備用。無血清培養(yǎng)基購自浙江森瑞生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司。兩對靶向CENPW 的沉默RNA（siRNA：si1-CENPW、si2-CENPW）和陰性對照siRNA-NC（si-NC）序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。細(xì)胞增殖與毒性檢測（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒、Hoechst 核染色試劑、碘化丙啶染色試劑和辣根過氧化物酶-偶聯(lián)二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。增強(qiáng)電化學(xué)（enhanced chemiluminescence-plus，ECL-Plus）超敏發(fā)光液購自杭州弗德生物科技有限公司。RIPA 細(xì)胞裂解液購自美國Sigma-Aldrich 公司。CENPW（批號：NBP1-70496）抗體購自美國Novus 公司。CLDN1（批號：ab242370）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD-1；批號：ab134175）抗體、轉(zhuǎn)錄抑制因子2 蛋白（Slug；批號：ab302780）抗體、去乙?；? 蛋白（Sirtuin 3，SIRT3；批號：ab217319）抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號：ab182858）抗體和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin；批號：ab8227）抗體購自英國Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-NC 序列：F-UUCUCCGAACGUGUCACGU， R-AAGAGGCUUGCACAGUGCA； si1-CENPW 序列：F-GCAGAAGAGUCCAGGACAA，RCGUCUUCUCAGGUCCUGUU；si2-CENPW 序列：FGGAGAAAA-GUGGUGACUUA，R-CCUCUUUUCACCACUGAAU。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105個(gè)/孔，接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h。根據(jù)LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒方法，依次加入稀釋后的si-NC、si1-CENPW 和si2-CENPW，使用無血清培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h 后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h，得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分組和處理 分組1：細(xì)胞分為si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC 序列）、si1-CENPW 組（轉(zhuǎn)染si1-CENPW 序列）和si2-CENPW組（轉(zhuǎn)染si2-CENPW序列）。分組2：細(xì)胞分為si-NC 組、si1-CENPW 組、si-NC+TEOA 組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC序列后，再經(jīng)TEOA處理）和si1-CENPW+TEOA組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染si1-CENPW序列后，再經(jīng)TEOA處理）。

1.4 3 組細(xì)胞CENPW、CLDN1 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。取分組1 的3 組細(xì)胞，1 000 r/min 離心3 min，棄去上清液加入RIPA 裂解液，提取蛋白溶液。根據(jù)BCA 蛋白檢測試劑盒檢測每組蛋白樣品濃度，稀釋樣品蛋白濃度至2 μmol/L。各組蛋白樣品加入到含10% SDS-PAGE 的凝膠中電泳分離，并將其標(biāo)記在聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fldoride，PVDF）膜上。印跡的PVDF 膜放置在5%的脫脂牛奶中常溫封閉1 h，加入CENPW、CLDN1 一抗，4 ℃搖床孵育過夜。取出樣品，分別加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。用ECL-Plus 超敏發(fā)光液于伯樂凝膠成像儀中觀察印跡。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算CENPW、CLDN1 蛋白相對表達(dá)量。

1.5 3 組細(xì)胞遷移能力的檢測 采用貼壁細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取分組1 的3 組細(xì)胞分別接種到6 孔板，待細(xì)胞生長至95%細(xì)胞密度時(shí)，用10 μL 移液管尖劃開細(xì)胞層，在0 和24 h 采集圖像，利用Image J 軟件測量劃痕距離，評估細(xì)胞遷移能力。

1.6 兩組細(xì)胞存活率的檢測 采用CCK-8 法。取分組2 的si-NC+TEOA 組和si1-CENPW+TEOA 組細(xì)胞。調(diào)整密度為1×104個(gè)/孔，接種于96 孔板中。分別用含0、40、45、50 μmol/L TEOA 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。加入10 μL/孔CCK-8 孵育1.5 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度值，計(jì)算兩組細(xì)胞存活率。

1.7 兩組細(xì)胞死亡率的檢測 采用碘化丙啶染色法。取分組2 的si-NC+TEOA 組和si1-CENPW+TEOA 組細(xì)胞，調(diào)整密度為80%，接種于6 孔板中并培養(yǎng)至貼壁。加入50 μmol/L TEOA，1.5 mL/孔，培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)移至6孔板，加入1 g/L 碘化丙啶染色試劑，1.5 μL/孔，避光染色15 min，繼用Hoechst 染色5 min。使用熒光顯微鏡觀察拍照并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞死亡率。

1.8 4 組細(xì)胞中cyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)的檢測 取分組2 的4 組細(xì)胞，參照1.4.1 方法，采用Western blot 法檢測計(jì)算CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0 和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組細(xì)胞CENPW、CLDN1 蛋白表達(dá)水平的比較與si-NC 組相比，si1-CENPW 組和si2-CENPW 組的CENPW、CLDN1 蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 3 組細(xì)胞CENPW、CLDN1 蛋白表達(dá)的比較（A：蛋白電泳圖；B：CENPW、CLDN1 蛋白相對表達(dá)水平）

2.2 3 組細(xì)胞遷移能力的比較 相比si-NC 組，si1-CENPW 組和si2-CENPW 組的劃痕距離較寬（P＜0.05），提示細(xì)胞遷移相對距離較短，細(xì)胞遷移能力降低，見圖2。

圖2 3 組細(xì)胞遷移能力的比較（A：貼壁細(xì)胞劃痕圖；B：細(xì)胞劃痕相對距離）

2.3 兩組細(xì)胞存活率的比較 隨著TEOA 藥物濃度升高，si1-CENPW+TEOA 組細(xì)胞存活率逐漸降低。在藥物濃度為50 μmol/L 時(shí)，si1-CENPW+TEOA 組與si-NC+TEOA 組細(xì)胞存活率差值最大；相比si-NC+TEOA組，45、50 μmol/L TEOA 處理下si1-CENPW+TEOA 組的細(xì)胞存活率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組細(xì)胞存活率的比較

2.4 兩組細(xì)胞死亡率的比較 碘化丙啶和Hoechst染色結(jié)果顯示，當(dāng)TEOA 藥物濃度為50 μmol/L 時(shí)，si1-CENPW+TEOA 組的細(xì)胞死亡數(shù)量較si-NC+TEOA 組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4（插頁）。

圖4 兩組細(xì)胞死亡率的比較（A：碘化丙啶熒光染色圖，×200；B：細(xì)胞死亡率）

2.5 4 組細(xì)胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的比較 相比si-NC+TEOA 組，si1-CENPW+TEOA 組中CyclinD-1、Slug、SIRT3 的蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。相比si1-CENPW 組，si1-CENPW+TEOA 組中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖5。

圖5 4 組細(xì)胞CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的比較（A：蛋白電泳圖；B：CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白相對表達(dá)水平）

3 討論

乳腺癌仍然是近年來女性中發(fā)病率最高的癌癥，其中浸潤性乳腺癌是原發(fā)性乳腺癌最常見的病理類型，治療方案一般為術(shù)后化療[20-21]。由于化療藥物往往伴隨著嚴(yán)重的毒副反應(yīng)和耐藥性，乳腺癌患者的預(yù)后總是差強(qiáng)人意[22-24]。因此，在基因?qū)用嫔祥_發(fā)更有效、更小毒性反應(yīng)的治療策略是必要的[25-26]。著絲粒蛋白的調(diào)控與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期密切相關(guān)[27-28]，并通過核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM）1 蛋白和TGF-β 信號通路加速細(xì)胞轉(zhuǎn)化[29-30]。CENPW 是一種有前景的基因靶點(diǎn)，干擾其表達(dá)有較好的抑癌效果[31-32]。為闡明CENPW 基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵作用，本研究構(gòu)建了干擾CENPW 基因表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制CENPW 表達(dá)的同時(shí)也阻礙了CLDN1 的表達(dá)。CLDN1 在具有免疫逃逸特性的腫瘤病理學(xué)中起關(guān)鍵作用，干擾CLDN1 的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[33-35]。兩者之間存在上下游關(guān)系并呈正相關(guān)調(diào)節(jié)，使細(xì)胞遷移能力顯著降低。

將CENPW 作為乳腺癌進(jìn)展的預(yù)測因子，以干擾其表達(dá)為切入點(diǎn)聯(lián)合化療藥物治療有助于開發(fā)具有創(chuàng)新性的乳腺癌治療策略。TEOA 是從毛茛根中分離出來含量最多的五環(huán)三萜化合物，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌活性，并通過誘導(dǎo)線粒體活性氧的產(chǎn)生引發(fā)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激來達(dá)到抑癌效果[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，TEOA 對CENPW 表達(dá)失調(diào)的乳腺癌細(xì)胞造成的殺傷效果更強(qiáng)，低濃度TEOA 即可殺傷更多細(xì)胞。細(xì)胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平在抑癌過程中發(fā)揮著重要作用，抑制CyclinD-1 的表達(dá)能阻礙細(xì)胞增殖，干擾Slug 的表達(dá)能阻礙其調(diào)控的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，SIRT3 的缺失可導(dǎo)致線粒體活性氧水平異常并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，下調(diào)Bcl-2 有助于細(xì)胞凋亡的發(fā)生[38-43]。本研究結(jié)果表明，TEOA 抑制了乳腺癌細(xì)胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白表達(dá)，而這一效果在CENPW 表達(dá)失調(diào)的細(xì)胞中更為顯著。干擾CENPW 的表達(dá)能增加細(xì)胞對抗腫瘤藥物TEOA 的敏感性，通過減少藥物用量有效降低TEOA 的毒性反應(yīng)并存在緩解耐藥性的可能性。然而一個(gè)基因調(diào)節(jié)多種代謝途徑，其具體作用機(jī)制不能用單一的信號通路來清楚地解釋，因此本研究的意義尚存在一定局限，需通過進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)干擾CENPW 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，與TEOA 抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用可對乳腺癌細(xì)胞起抑制效果。但本研究僅局限于細(xì)胞生物學(xué)層面，在體內(nèi)是否存在同樣高效的抑癌效果，有待進(jìn)一步研究。