脂肪干細胞與放射損傷成纖維細胞共培養(yǎng)后細胞因子表達的差異

秦嶺 閻海萍 尹小芳 楊超 栗穎利 李敏

[摘要]目的：探討脂肪干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）與放射損傷成纖維細胞（Fibroblast，F(xiàn)b）共培養(yǎng)后細胞因子表達的差異。方法：使用劑量8 Gy的X線放射源，對大鼠的成纖維細胞進行單次照射，建立ADSCs與放射后成纖維細胞共培養(yǎng)模型。分別把未干預(yù)的成纖維細胞設(shè)為空白對照Fb1組，放射后成纖維細胞設(shè)為Fb2組，ADSCs與放射后成纖維細胞共培養(yǎng)組設(shè)為Fb3組，利用蛋白質(zhì)芯片檢測各組差異表達的細胞因子，并通過Elisa檢測驗證。結(jié)果：研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fb2組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的表達水平低于Fb1組（P＜0.05），F(xiàn)b3組GM-CSF表達水平高于Fb2（P＜0.01）；Fb3組血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達水平高于Fb2組（P＜0.05）；各組表皮細胞因子（Epidermal growth factor，EGF）和血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：ADSCs與放射后成纖維細胞共培養(yǎng)后多種生長因子、黏附因子、趨化因子上調(diào)，部分炎性因子下調(diào)；ADSCs可能主要通過VEGF和GM-CSF促進成纖維細胞放射損傷的修復(fù)。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細胞；成纖維細胞；放射損傷；細胞因子；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）07-0086-04

Differences in Cytokines Expression after Co-Culture of Adipose Stem Cells with Irradiated Fibroblasts

QIN Ling1，YAN Haiping2，YIN Xiaofang1，YANG Chao3，LI Yingli4，LI Min5

（1.The PLA 960th Hospital Graduate Training Base of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，Liaoning，China; 2.Jinan's Eleventh Leaving Cadre Recuperation Center of Shandong Provincial Military Region，Jinan 250013，Shandong，China; 3.Plastic Surgery of PLA Naval Medical Center，Shanghai 200433，China; 4.Department of Plastic Surgery，960th Hospital of PLA，Jinan 250000，Shandong，China; 5.Department of Nuclear Medicine， 960th Hospital of PLA，Jinan 250000，Shandong，China）

Abstract： Objective? To investigate the difference in cytokines expression after co-culture of ADSCs and radiation-damaged fibroblasts. Methods? An X-ray radiation source of 8 Gy was used to illuminate rat fibroblasts to establish a co-culture model of ADSCs and radiation-damaged fibroblasts. Unintervened fibroblasts were set as blank control Fb1，radiation damaged fibroblasts as Fb2， and ADSCs with radio-injured fibroblasts as Fb3. Differentially expressed cytokines were detected in each group using protein microarray， which were verified by Elisa. Results? The expression of granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF） in Fb2 group were lower than that in Fb1 group （P＜0.05），while the expression of GM-CSF in Fb3 group were higher than that in Fb2 group （P＜0.01）; Moreover，the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF） in Fb3 group were higher than that in Fb2 group （P＜0.05）. However， there was no significant difference in epidermal growth factor（EGF） and platelet derived growth factor（PDGF） content in each group. Conclusion? Some growth factors， adhesion factors， and chemokines were up-regulated while some inflammatory factors were down-regulated after co-culture of ADSCs with radiation-damaged fibroblasts. ADSCs may promote the repair of fibroblast radiation damage mainly through VEGF and GM-CSF.

Key words： adipose derived stem cells; fibroblast; radiation damage; cytokines; granulocyte-macrophage colony stimulating factor; vascular endothelial growth factor

皮膚作為放射損傷最常累及的器官，約90%的患者接受放射性治療后會出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。目前常用的乳膏、皮瓣移植以及手術(shù)切除修復(fù)等治療方式的有效性仍缺乏證據(jù)[1]。Fb的遷移和增殖被認為在很大程度上影響傷口收縮、細胞外基質(zhì)的沉積和組織的重建[2]。而大量成纖維細胞的放射損傷成為了放射性皮膚損傷難愈合的重要原因之一。但是單純使用成纖維細胞治療，可能會導(dǎo)致皮膚組織纖維化[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可以通過分泌細胞因子和黏附分子等物質(zhì)修復(fù)放射損傷后的成纖維細胞與內(nèi)皮細胞[4，6]，并且脂肪來源干細胞對增生性瘢痕成纖維細胞能夠發(fā)揮抗纖維化作用[7]。但是，目前尚不明確ADSCs主要通過哪些細胞因子來影響放射損傷后成纖維細胞的修復(fù)。

本實驗采用實驗組前期設(shè)計的ADSCs與放射損傷成纖維細胞共培養(yǎng)模型，通過蛋白芯片高通量篩查ADSCs可能通過哪些細胞因子促進放射后成纖維細胞的修復(fù)，并進行Elisa定量檢測來驗證。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑：直線加速器（西門子，德國）；超凈工作臺（青島 海爾）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo scientific，美國）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；流式細胞儀（Mihenyi Biotec，德國）；GenePix 4000B芯片掃描儀（Axon，美國）；0.4μm細胞共培養(yǎng)皿（Corning，美國）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、膠原酶Ⅰ型、胰蛋白酶、Dispase酶（Gibco，美國）；戊巴比妥鈉（Signa，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，上海）；RIPA裂解液（碧云天，上海）；酶標儀（Thenno Scientific，美國）；Elisa檢測試劑盒（碧云天，上海）；CD29、CD44、 CD31、CD45抗體（Miltenyi Biotec，德國）；波形蛋白（Vimentin）抗體（CST，美國）。

1.2 實驗動物：選取6～8周齡雄性SD大鼠10只，每只體重300～400 g，由長海醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.3 大鼠ADSCs的提取、培養(yǎng)與鑒定：取10只SD大鼠脫頸處死，75%酒精浸泡10 min后，分離腹股溝脂肪，用1%雙抗PBS沖洗。在適量PBS中盡量剪碎脂肪后加入等體積膠原酶Ⅰ型，37℃、100 r/min搖床消化50 min。離心后棄上清，加入適量含胎牛血清（FBS）的DMEM終止消化，經(jīng)過75μm篩網(wǎng)過濾后離心，棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸后移至培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d換液一次。待細胞長至90%融合度后傳代用于表面CD分子鑒定及定向誘導(dǎo)分化，具體細胞驗證和實驗步驟參考課題組前期方法[8]。

1.4 大鼠成纖維細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定：取SD大鼠腹部皮膚，分離脂肪等其他組織后用PBS沖洗，加入Dispase酶消化過夜，溫度為4℃。分離真皮與表皮組織，盡量剪碎真皮組織后放入10 ml含0.25%胰酶DMEM培養(yǎng)皿中，于標準狀態(tài)下培養(yǎng)箱孵育2 h。用75 μm篩網(wǎng)過濾組織液后離心棄上清，重懸后將所得細胞懸液轉(zhuǎn)移在配置好的培養(yǎng)液中（含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基）。每2 d換一次液，90%融合度后傳代，做Vimentin蛋白表達檢測[8]。

1.5 分組及蛋白質(zhì)提取：Fb1組為空白對照的成纖維細胞，F(xiàn)b2組為接受過8 Gy X線照射后的成纖維細胞，F(xiàn)b3組為照射后與ADSCs共培養(yǎng)的成纖維細胞。待第3代ADSCs和真皮成纖維細胞長至80%～90%后消化后計數(shù)。先準備3塊6孔板，各組6孔板每孔接種1.5×105個Fb，加培養(yǎng)液后置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。ADSCs以1.0×105個/孔的密度接種于共培養(yǎng)組Transwell 6孔板上室中，加培養(yǎng)液置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后換液，在常規(guī)6孔板每孔中加入2 ml培養(yǎng)液，Transwell 6孔板每個上室和下室中加1 ml培養(yǎng)液。Fb2組和Fb3組成纖維細胞利用直線加速器進行X線照射，能量為6 MV，距離100 cm，劑量8 Gy。照射完成后立即將接種ADSCs 的Transwell 6孔板上室放入Fb3組下室中，所有6孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。48 h后收集各組成纖維細胞培養(yǎng)液上清離心后加入蛋白裂解液提取總蛋白[9]。

1.6 細胞因子蛋白芯片檢測：取各組含總蛋白的細胞培養(yǎng)液上清，分別為Fb1組蛋白、Fb2組蛋白和Fb3組蛋白。每組總蛋白液以13 200 rpm離心15 min后，取每組上清400μl于500 ml 1×PBS透析液中，4℃搖床過夜。次日以10 000 rpm離心5 min。BCA法蛋白定量，加入Labeling reagent tube（Item B），室溫震蕩30 min，每5 min輕搖一次。所有樣品加入3μl Stop Solution混勻。參照Raybiotech公司提供的蛋白芯片檢測流程以及試劑盒進行操作，取透析后樣品200μl，加入Blocking Buffer至終體積400μl后進行芯片檢測。芯片干燥后，于4℃封閉，每孔加入800μl Blocking Buffer，除去Blocking Buffer后按照步驟芯片經(jīng)過1×Wash BufferⅠ和1×Wash BufferⅡ洗滌后，1 000 rpm離心后甩干，上Axon GenePix 4000B芯片掃描儀。

1.7 ELISA檢測：取上述Fb1、Fb2和Fb3組含蛋白上清，利用ELISA檢測驗證并定量蛋白質(zhì)芯片初篩的結(jié)果。操作具體過程按照ELISA檢測試劑盒說明書以及相關(guān)參考文獻[9]。每次檢測均為3孔，實驗重復(fù)至少3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析：細胞因子蛋白芯片檢測和Elisa檢測等數(shù)據(jù)匯總Excel統(tǒng)計數(shù)值。多次重復(fù)實驗后所得數(shù)據(jù)用（x ?±s）表示。各組實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0軟件分析，采用多組單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GraphPad Prism 6.0制作圖表。

2? 結(jié)果

2.1 ADSCs與大鼠成纖維細胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定：ADSCs 2 d后貼壁，逐漸由多角形變?yōu)殚L梭形。流式細胞儀檢測ADSCs表面標記結(jié)果顯示CD29、CD44高表達，而CD45、CD31低表達。經(jīng)過成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)的ADSCs胞漿內(nèi)可見脂滴，油紅O染色后脂滴變?yōu)榧t色。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后ADSCs由梭形變成多角形，顯微鏡下可觀察到鈣鹽結(jié)晶沉積及礦化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶及茜素紅染色陽性。成纖維細胞亦呈梭形或多角形，免疫細胞化學(xué)染色后波形蛋白高表達[10]。

2.2 蛋白質(zhì)芯片結(jié)果：蛋白芯片結(jié)果顯示，相比于Fb1組，F(xiàn)b2組中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮細胞因子（Epidermal growth factor，EGF）和血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）等大部分細胞因子下調(diào)。Fb3組比Fb2組上調(diào)的細胞因子包括酪氨酸激酶受體-2（Tyrosine kinase receptor-2，TIE-2）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、金屬蛋白酶組織抑制物-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、分泌型磷蛋白1（Secretory phosphoprotein-1，SPP1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、神經(jīng)生長因子受體（Neurotrophic factor receptor，NGFR）、GM-CSF、L選擇素（CD62L）、VEGF、CD80、EGF、PDGF等；下調(diào)的細胞因子包括腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配（Tumor necrosis factor-associated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-3（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3，TIMP-3）、β神經(jīng)生長因子（Beta nerve growth factor，β-NGF）、IL-3、CD54、IL-12、IL-4、IL-10等，見圖1。通過對比各組差異細胞因子含量發(fā)現(xiàn)在成纖維細胞放射損傷后下調(diào)，經(jīng)過ADSCs共培養(yǎng)后上調(diào)的細胞因子排名靠前為GM-CSF、VEGF、EGF和PDGF。

2.3 Elisa結(jié)果：由于采用半定量蛋白芯片檢測細胞因子，所以利用Elisa檢測對排名靠前幾個細胞因子進行定量驗證。Elisa檢測結(jié)果顯示Fb2組GM-CSF表達量較Fb1組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)b3組GM-CSF表達量較Fb2組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Fb3組VEGF表達量較Fb2組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。EGF和PDGF含量非常少，且各組間含量差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

3? 討論

隨著患者不斷增長的放療需求，脂肪干細胞的移植成為放射性皮膚損傷治療的一種非常有前景的方法。雖然大量研究已經(jīng)證實ADSCs能夠通過旁分泌多種細胞因子促進成纖維細胞增殖以及皮膚創(chuàng)面的愈合[11-12]。但在放射性皮膚損傷中ADSCs通過哪些細胞因子參與修復(fù)仍需要進一步探究。

課題組在前期證實ADSCs能夠促進放射損傷的成纖維細胞修復(fù)的基礎(chǔ)上[10]，利用共培養(yǎng)皿上室的聚碳酸酯膜可以通過細胞因子的特點，對Fb1組、Fb2組和Fb3組細胞因子進行蛋白質(zhì)芯片檢測和Elisa檢測，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞在接受照射后幾乎所有細胞因子的表達下降，而ADSCs干預(yù)的Fb3組較Fb2組中多種生長因子、趨化因子、黏附因子上調(diào)，部分炎性因子下調(diào)。其中在放射損傷組下調(diào)而在ADSCs干預(yù)的Fb3組上調(diào)的細胞因子排名靠前的是GM-CSF、VEGF、EGF和PDGF。這與多項ADSCs治療放射性傷口的研究中發(fā)現(xiàn)的VEGF表達上調(diào)[14-16]和炎癥反應(yīng)減輕一致[13-14]?？壳暗倪@些細胞因子里差異含量較明顯是GM-CSF和VEGF，而EGF和PDGF含量相對較少，與各組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示ADSCs可能是主要通過VEGF和GM-CSF干預(yù)放射損傷后成纖維細胞的修復(fù)。

綜上所述，本研究預(yù)測了ADSCs修復(fù)放射損傷成纖維細胞前后差異細胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs可能主要通過VEGF和GM-CSF干預(yù)放射損傷后成纖維細胞的修復(fù)。但本研究只檢測一部分常見的細胞因子，ADSCs還可能通過其他細胞因子或外泌體等介質(zhì)參與放射損傷成纖維細胞的修復(fù)。另外，實驗組前期發(fā)現(xiàn)在ADSCs修復(fù)放射損傷成纖維細胞后信號通路主要富集在PI3K/AKT與MAPK上[9]。這與Liu等[17]利用人臍帶間充質(zhì)干細胞治療大鼠放射性皮膚潰瘍后創(chuàng)面VEGF表達上調(diào)和PI3K/AKT信號通路的激活相同。所以這將為我們驗證GM-CSF與VEGF和PI3K/Akt與MAPK通路在ADSCs修復(fù)放射損傷成纖維細胞過程中的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2022-04-20

本文引用格式：秦嶺，閻海萍，尹小芳，等.脂肪干細胞與放射損傷成纖維細胞共培養(yǎng)后細胞因子表達的差異[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（7）：86-89.