兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面早期外用干擾素與法舒地爾預(yù)防瘢痕增生的實(shí)驗(yàn)研究

羅坤　喬柱

[摘要]目的：本實(shí)驗(yàn)觀察兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用干擾素與法舒地爾預(yù)防瘢痕增生的療效。方法：選擇健康的新西蘭大耳白兔，制作兔耳創(chuàng)傷模型48只，隨機(jī)分為A，B，C三組，每組16只共計(jì)32個(gè)創(chuàng)面，A組外用干擾素霜，B組外用法舒地爾霜，C組為生理鹽水對(duì)照組。術(shù)后第一天起用藥至4周后兔耳上皮化，切取瘢痕組織計(jì)算瘢痕增生指數(shù)，觀察masson染色膠原纖維的形態(tài)分布及成纖維細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：A組與B組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A組與C組、B組與C組之間差異皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著（P<0.01）。結(jié)論：兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用干擾素與法舒地爾能有效預(yù)防抑制瘢痕增生。

[關(guān)鍵詞]干擾素；法舒地爾；創(chuàng)傷；成纖維細(xì)胞；增生性瘢痕；實(shí)驗(yàn)研究

[中圖分類號(hào)]R619⁺.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）03-0074-03

增生性瘢痕是整形外科研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，臨床治療較為困難，一般采用手術(shù)切除輔以其它方法如藥物注射、激光、按摩、加壓、硅凝膠膜等。經(jīng)臨床證實(shí)如干擾素，鈣通道阻滯劑等藥物較為有效。Lee，京薩等通過一系列研究證實(shí)肌注或者外用鈣通道阻滯劑均能有效抑制兔耳瘢痕增生。依此，本實(shí)驗(yàn)利用兔耳作為瘢痕模型，對(duì)兔耳創(chuàng)傷后即用干擾素與法舒地爾至創(chuàng)面上皮化愈合，觀察其預(yù)防抑制瘢痕增生的療效。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)兔48只由雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，兔齡8～12個(gè)月，兔耳完好，雌雄不計(jì)，體重為2.0～2.5kg。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑：實(shí)驗(yàn)所需手術(shù)的器械由雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，相機(jī)（自備），干擾素（北京凱英科技有限公司），鹽酸法舒地爾（成都華宇制藥有限公司），0.9%氯化鈉注射液（成都青山利康藥業(yè)有限公司）。

1.3創(chuàng)傷模型的制作：依據(jù)李薈元研究設(shè)計(jì)的瘢痕模型制作方法，將兔耳腹側(cè)全層皮膚去除1.5cm×1.5cm，并刮除其軟骨膜。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將48只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成3組，每組16只，每只兔耳造模一個(gè)共創(chuàng)傷模型32個(gè)。實(shí)驗(yàn)組A組外用干擾素α-2b（將凡士林99g加1g干擾素α-2b注射液，制成1%的干擾素α-2b霜），B組外用法舒地爾（將凡士林99g加1g法舒地爾注射液，制成1%的法舒地爾霜），C組生理鹽水為對(duì)照組（將凡士林99g加1g無菌生理鹽水，制成1%的生理鹽水霜）。

1.5用藥方法：術(shù)后第1天，A組外用干擾素α-2b霜每日1次均勻薄層涂抹在創(chuàng)面上，至兔耳上皮化愈合共計(jì)4周。B組每日1次外用法舒地爾霜與C組每日1次生理鹽水霜，至兔耳上皮化愈合共4周。

1.6標(biāo)本切取及處理：實(shí)驗(yàn)第29天處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在嚴(yán)格無菌條件下切取兔耳標(biāo)本，帶有部分正常皮膚軟組織和軟骨膜。10%的甲醛溶液固標(biāo)本定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色和Msson染色。

2觀察指標(biāo)

2.1大體方面觀察：每天觀察并拍照記錄創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)、創(chuàng)面愈合后瘢痕形成情況如：組織的顏色、質(zhì)地、大小、厚度等。分別在實(shí)驗(yàn)第7天、14天、28天記錄數(shù)據(jù)并分析，在第28天時(shí)創(chuàng)面上皮化，大體表現(xiàn)：根據(jù)溫哥華瘢痕評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記錄評(píng)分。

2.2瘢痕增生指數(shù)（HI）測(cè)量：在低倍鏡下測(cè)微尺測(cè)出正常皮膚表面至軟骨表面的厚度b，測(cè)出瘢痕表面至軟骨表面的厚度a，依據(jù)Morris等提出的瘢痕增生指數(shù)HI=a/b即得出結(jié)果。

2.3成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)FBh在HE染色標(biāo)本中，低倍顯微鏡下尋找顯示最清楚、成纖維細(xì)胞數(shù)最多的區(qū)域，通過高倍鏡下觀察4個(gè)不重復(fù)的不同區(qū)域視野并目測(cè)計(jì)數(shù)，得到的結(jié)果取均數(shù)，此數(shù)即為該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的成纖維細(xì)胞數(shù)目（Weidner法）。

3統(tǒng)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)采用PASW Statistics18（SPSS18.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用了t檢驗(yàn)，并且按檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01差異顯著；P>0.05則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)瘢痕的預(yù)防抑制作用無明顯差異。

4結(jié)果

4.1一般觀察：實(shí)驗(yàn)第28天時(shí)，創(chuàng)面皆愈合形成瘢痕，干擾素和法舒地爾不影響創(chuàng)面的愈合，且愈合時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)A組：肉眼可見瘢痕不超過手術(shù)范圍，瘢痕質(zhì)地平軟，顏色淡，斑塊體積小；B組：瘢痕不超過手術(shù)范圍，質(zhì)地稍平軟，顏色稍淡，斑塊體積較??；C組：瘢痕增生高出皮膚表面但不超過手術(shù)范圍，質(zhì)地硬，顏色紅，瘢痕斑塊體積大。

4.2 HE染色觀察：A組、B組鏡下可見創(chuàng)傷區(qū)表皮和真皮稍顯增厚，細(xì)胞層次少，表皮的厚薄程度不均，瘢痕厚度略高于周圍正常皮膚，瘢痕內(nèi)可見呈梭形成纖維細(xì)胞和炎細(xì)胞；C組表皮和真皮增生明顯，細(xì)胞層次明顯增多，可見大量不規(guī)則的梭型成纖維細(xì)胞呈漩渦狀，可見大量的成纖維細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

4.3 Masson染色觀察：A組、B組Masson染色觀察膠原致密，形態(tài)纖細(xì)，膠原纖維排列整齊；C組膠原纖維藍(lán)染顏色深，膠原酥松粗大，膠原纖維排列紊亂。

4.4瘢痕增生指數(shù)及成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1、表2。由表1可見：實(shí)驗(yàn)A組和實(shí)驗(yàn)B組比較P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)A組瘢痕增生不明顯，實(shí)驗(yàn)B組輕度瘢痕增生。實(shí)驗(yàn)A組、B組和對(duì)照C組比較P<0.01，C組瘢痕增生明顯。由表2可見：實(shí)驗(yàn)A組和實(shí)驗(yàn)B組比較P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)A組成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)少于實(shí)驗(yàn)B組。實(shí)驗(yàn)A組、B組和對(duì)照C組比較P<0.01，A組、B組成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯少于C組。

5討論

深度創(chuàng)傷后創(chuàng)面成纖維細(xì)胞大量增生，膠原纖維基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致皮膚纖維化，形成突出表面的瘢痕組織。增生性瘢痕之所以治療困難，是因?yàn)橹两駴]有一個(gè)很好的研究模型，對(duì)發(fā)病機(jī)理不清。建立有效的動(dòng)物瘢痕模型為研究瘢痕提供可靠的方法，李薈元研究探索兔耳作為研究瘢痕的動(dòng)物模型。朱桂英等進(jìn)一步研究如何選擇兔耳創(chuàng)傷部位及深度，術(shù)后處理方法，為增生性瘢痕的研究提供了成功率更高的兔耳模型。在兔耳可作為有效的瘢痕模型的研究背景下，對(duì)兔耳創(chuàng)傷后即用干擾素與法舒地爾至創(chuàng)面上皮化愈合，觀察其預(yù)防抑制瘢痕增生的療效。

干擾素可誘導(dǎo)細(xì)胞分化，抑制合成膠原蛋白并促進(jìn)其降解，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的正性調(diào)節(jié)作用，抑制α平滑肌肌動(dòng)蛋白的合成，從而抑制瘢痕增生。鈣通道阻滯劑主要作用于多種酶如：Rho激酶（三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白，可抑制細(xì)胞增殖，參與重構(gòu)細(xì)胞骨架，在細(xì)胞分化遷移凋亡發(fā)揮作用）、MLCK（肌球蛋白輕鏈激酶，屬于鈣調(diào)素依賴酶，催化肌球蛋白磷酸化，激活肌球蛋白ATP酶引起平滑肌收縮）、PKA和PKC（cAMP依賴蛋白激酶A、C使肌細(xì)胞生成素磷酸化，抑制肌細(xì)胞生成素與DNA的結(jié)合能力，阻止細(xì)胞分化為肌纖維）等多種酶，抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子活動(dòng)，減輕炎癥反應(yīng)從而減輕組織損傷。許寧等研究表明，鈣通道阻滯劑維拉帕米增強(qiáng)Smad7的表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞α-Smad7mRNA及合成細(xì)胞外基質(zhì)。劉沖等認(rèn)為，鈣通道阻滯劑維拉帕米能夠改變損傷處血管分布影響瘢痕形成。鹽酸法舒地爾為新型鈣通道阻滯劑，通過抑制Rho激酶、抑制PKA、C活性，減輕組織重構(gòu)，有效地抑制成纖維細(xì)胞的增殖而抑制瘢痕。

本實(shí)驗(yàn)從大體及細(xì)胞學(xué)對(duì)兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用干擾素與法舒地爾進(jìn)行研究，干擾素與法舒地爾皆能預(yù)防抑制瘢痕增生，干擾素抑制瘢痕的作用強(qiáng)于法舒地爾，但干擾素副作用較多，不能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡而易復(fù)發(fā)；法舒地爾副作用少，對(duì)健康皮膚無明顯副作用而優(yōu)于干擾素。本實(shí)驗(yàn)表明，兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用干擾素與法舒地爾能預(yù)防抑制瘢痕增生，但還有待進(jìn)一步研究如用藥頻次、用量以及用藥的最佳濃度和停藥后治療效果的觀察。