氣質(zhì)聯(lián)用儀測定食品中16種反式脂肪酸方法的研究

◎ 許蕤竹，虞太六

（上海華測品標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，上海 201114）

食品中的脂肪酸可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸兩大類，不飽和脂肪酸由于含有雙鍵，存在順反異構(gòu)體。反芻動物的油脂中含有天然反式脂肪酸，油脂的氫化加工過程也會產(chǎn)生反式脂肪酸。過量攝入反式脂肪酸會對人體產(chǎn)生很大的危害，眾多研究表明，反式脂肪酸可能會引發(fā)冠心病、形成血栓、導(dǎo)致肥胖、引發(fā)糖尿病等，還會影響嬰幼兒的生長發(fā)育。美國、丹麥等國家要求在食品標(biāo)簽上標(biāo)注反式脂肪酸的含量[1]，中國香港也把反式脂肪酸作為核心營養(yǎng)素標(biāo)注在食品包裝上?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》（GB 28050—2011）中規(guī)定配料中含有氫化油、部分氫化油的產(chǎn)品，如人造奶油、植脂末、起酥油等，應(yīng)標(biāo)示反式脂肪酸含量。

目前國標(biāo)中反式脂肪酸的檢測標(biāo)準(zhǔn)主要是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中反式脂肪酸的測定》（GB 5009.257—2016），該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了氣相色譜法測試C16:1t-C22:1t等16種反式脂肪酸的方法。然而，脂肪酸的種類非常多，多種脂肪酸因結(jié)構(gòu)近似，在色譜分析中保留時間相近或不能被分離，導(dǎo)致定性困難和定量不準(zhǔn)確[2]。氣質(zhì)聯(lián)用儀的應(yīng)用將會很好地解決上述問題，通過色譜保留時間和質(zhì)譜特征離子雙重分析，即使在分離度不理想時也能夠更加準(zhǔn)確地定性和定量。氣質(zhì)聯(lián)用儀測定反式脂肪酸的應(yīng)用已有許多報道，但能夠同時測定16種常見反式脂肪酸方法的研究很少見。本實驗擬采用氣質(zhì)聯(lián)用儀同時測定含動植物油脂的食品中16種反式脂肪酸，對前處理方法、儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠、操作簡便、適用范圍廣的反式脂肪酸測定方法，作為對國標(biāo)方法的補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸（HCL）：分析純；乙醚（C2H10O）：分析純；石油醚：沸程30～60 ℃；無水乙醇（C2H6O）：色譜純；氫氧化鉀-甲醇溶液：2 mol·L-1；異辛烷（C8H18）：色譜純；硫酸氫鈉（NaHSO4）：分析純。

1.2 儀器

氣質(zhì)聯(lián)用儀：（Agilent 7890A-5975C），配自動進(jìn)樣器；恒溫水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；分析天平：感量0.001 g和0.000 1 g；離心機(jī)；渦旋振蕩器。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

16種反式脂肪酸甲酯混標(biāo)（TMRM）見表1。

1.4 實驗方法

1.4.1 食品中脂肪的提取和測定

稱取待檢測樣品2～5 g（精確至0.001 g），置于100 mL具塞比色中，加入5～10 mL水充分混合，再加入8 mL鹽酸，混勻。將比色管放入70 ℃水浴鍋中，每隔10 min振搖一次，大約50 min試樣完全水解，取出比色管，再加入10 mL乙醇混合，放置冷卻。待溫度降至室溫后，往比色管中加入25 mL石油醚-乙醚溶液（1∶1，體積比），蓋塞后充分振搖萃取，靜置分層后，吸出上層有機(jī)相，置于100 mL具塞量筒中。往比色管中再加入25 mL石油醚-乙醚溶液（1∶1，體積比），按照前述萃取方法，重復(fù)再提取兩次，合并有機(jī)相，用乙醚定容。精準(zhǔn)移取50 mL有機(jī)相于蒸發(fā)皿中，50 ℃水浴蒸干，置于100 ℃下恒重，計算食品中的脂肪含量；剩余50 mL有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑后，得到的脂肪用于后續(xù)測試。

1.4.2 制備反式脂肪酸甲酯

稱取50 mg脂肪，置于10 mL具塞比色管中，加入5 mL異辛烷溶解脂肪，再加入1 mL氫氧化鉀-甲醇溶液（2 mol·L-1），渦旋混合均勻，放置反應(yīng)約1 h，至比色管內(nèi)液體澄清。往比色管中加入2 g硫酸氫鈉，用來中和過量的氫氧化鉀，用渦旋振蕩器混合均勻，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾，收集至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)氣質(zhì)聯(lián)用儀測定。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。采用毛細(xì)管色譜柱SP-2560（聚二氰丙基硅氧烷）：100 m×0.25 mm×0.2 μm；載氣流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；程序升溫：初始140 ℃（5 mim），以2 ℃·min-1升至230 ℃（20 min）；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：20∶1。

（2）質(zhì)譜條件[3]。電離方式：電子轟擊（EI源）；電子能量：70 eV；離子源溫度：200 ℃；四極桿溫度：150 ℃；選擇離子監(jiān)測模式；溶劑延遲時間10 min。

（3）定量方法。面積歸一化法。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪測定前處理方法的選擇

食品中常用的脂肪測定方法有酸水解法和索氏提取法[4]，酸水解法適用于大部分食品中脂肪的測定，索氏提取法不適用于結(jié)合態(tài)脂肪的測定。采用兩種方法同時對脂肪標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測試，結(jié)果均在證書上給定的標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。比較兩個方法的測定過程，索氏提取法耗時較長，所用試劑較多，且受限于設(shè)備，無法同時測定多個樣品。綜合考慮適用范圍和測試成本、效率，本研究選用酸水解法來提取和測定食品中的脂肪含量。

2.2 甲酯化方法選擇

脂肪酸屬于高沸點物質(zhì)，在色譜分析中需要將脂肪酸甲酯化，降低沸點，再進(jìn)行儀器分析。常用的脂肪酸甲酯化方法有三氟化硼-甲醇法、氫氧化鉀-甲醇法、濃硫酸-甲醇法等。三氟化硼-甲醇法和濃硫酸-甲醇法均需要在高溫下冷凝回流，測試過程復(fù)雜，測試時間長，且三氟化硼有一定的毒性，濃硫酸也有很強(qiáng)的腐蝕性，操作危險系數(shù)較大。相比之下，氫氧化鉀-甲醇法在常溫下即可反應(yīng)，操作簡單、快速，危險性也較小。從反應(yīng)效率角度分析，李培武等[5]研究發(fā)現(xiàn)三氟化硼-甲醇法和濃硫酸-甲醇法的酯化效率更高，更適合于絕對含量的測定，而氫氧化鉀-甲醇法適合于相對含量的測定。本研究采用面積歸一化法進(jìn)行定量計算，所以更適合選用操作簡便的氫氧化鉀-甲醇法來制備脂肪酸甲酯。

2.3 色譜條件優(yōu)化

SP-2560和HB-88同為脂肪酸測定專用柱，兩種色譜柱均為強(qiáng)極性柱，對脂肪酸甲酯都有很好的分離度。本研究分別采用這兩種色譜柱來分析16種反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過不斷嘗試和調(diào)整升溫程序，發(fā)現(xiàn)SP-2560對幾種C18:3的反式脂肪酸的分離略優(yōu)于HB-88，所以最終選擇色譜柱為SP-2560。

2.4 定量、定性離子的選擇

本研究先通過對16種反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，通過全掃描來得到總離子流圖，再根據(jù)保留時間和質(zhì)譜特征確定定量、定性離子。定量、定性離子的選擇結(jié)果與林麒等[6]的研究一致。各種反式脂肪酸甲酯的保留時間以及定量、定性離子見表2。

表2 各種反式脂肪酸甲酯的保留時間以及定量、定性離子表

2.5 定量方法選擇

反式脂肪酸檢測中的常用定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和面積歸一化法等[7]。內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法適用于計算反式脂肪酸的絕對含量，面積歸一化法是計算反式脂肪酸的相對含量，再利用食品中脂肪的含量數(shù)據(jù)來折算出食品中反式脂肪酸的含量。受限于反式脂肪酸的分離度等原因，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法計算都會產(chǎn)生更大的誤差。所以本研究采用面積歸一化法進(jìn)行檢測結(jié)果的計算。

2.6 回收率以及精密度實驗

以目標(biāo)峰達(dá)到3倍信噪比的濃度來計算檢出限，該方法的檢出限為0.01%（以脂肪計）。通過空白基質(zhì)3水平（10 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1）6平行的加標(biāo)實驗，得到方法的回收率在81%～108%，RSD為3.1%～11.4%，見表3。該方法準(zhǔn)確可靠，方法的回收率和RSD均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）規(guī)定的檢驗方法確認(rèn)要求。

表3 回收率以及精密度試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究利用氣質(zhì)聯(lián)用法對食品中16種反式脂肪酸進(jìn)行檢測，通過對比實驗，選擇用酸水解法提取脂肪，用氫氧化鉀-甲醇法來制備脂肪酸甲酯，同時優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，并采用面積歸一化法進(jìn)行計算，從而建立了一種便捷、高效的檢測方法。通過大量實驗數(shù)據(jù)分析表明，該方法準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。該方法為解決反式脂肪酸定性復(fù)雜這一難題提供了一種方案。