胰腺癌實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀與研究進(jìn)展△

夏益蘭，林勇

上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院/復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院檢驗(yàn)科，上海 200040

胰腺癌是臨床最棘手的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，預(yù)后極差。明確診斷的胰腺癌患者中約25%有手術(shù)機(jī)會(huì)，如未經(jīng)臨床有效治療，多數(shù)患者會(huì)在確診后1年內(nèi)死亡[1]。一直以來(lái)，因胰腺的特殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、位置和生物學(xué)特征，臨床難以實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌的早期診斷。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，臨床實(shí)驗(yàn)室在腫瘤基因突變檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物的免疫學(xué)檢驗(yàn)等方面不斷涌現(xiàn)出新的方法和技術(shù)。臨床可通過對(duì)某些具有內(nèi)分泌特征或產(chǎn)生典型腫瘤標(biāo)志物的特定腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)，從而輔助診斷惡性腫瘤。胰腺癌實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)于患者盡早接受治療、獲得更好預(yù)后具有十分重要的臨床意義。但目前臨床對(duì)胰腺癌特征性實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的檢測(cè)尚屬于探索階段[2]。本文對(duì)近年來(lái)胰腺癌實(shí)驗(yàn)室診斷的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以期為臨床早期診斷胰腺癌提供參考依據(jù)。

1 胰腺癌實(shí)驗(yàn)室診斷的特殊性

胰腺在人體腹腔內(nèi)較深位置，其鄰近的臟器組織多，血管走向復(fù)雜。術(shù)前病理檢查是診斷胰腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)疑似胰腺癌的術(shù)前診斷多采用超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下細(xì)針抽吸活檢，對(duì)可手術(shù)的胰腺癌患者術(shù)中采用Tru-Cut 穿刺活檢聯(lián)合細(xì)針抽吸活檢。但病理檢查依賴于內(nèi)鏡技術(shù)獲得的活組織標(biāo)本，均為有創(chuàng)性檢查。胰腺特殊的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、位置和生物學(xué)特征使得臨床診斷時(shí)獲取胰腺活組織標(biāo)本十分不易，因此臨床早期診斷胰腺癌較為困難[3]。

2 診斷胰腺癌的實(shí)驗(yàn)室一般檢查

實(shí)驗(yàn)室檢查是簡(jiǎn)單、基本無(wú)創(chuàng)的輔助診斷方法。胰腺癌壓迫胰頭組織可導(dǎo)致梗阻性黃疸。胰腺癌的實(shí)驗(yàn)室一般檢查結(jié)果顯示，直接膽紅素、血清堿性磷酸酶均異常升高；血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶可在正常范圍內(nèi)，有時(shí)可升高；尿膽紅素陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性；血淀粉酶一般無(wú)太大變化，僅在少數(shù)胰管梗阻的早期胰腺癌患者中可有一過性升高；如合并胰島組織受損，部分胰腺癌患者可能出現(xiàn)空腹血糖升高、糖耐量試驗(yàn)陽(yáng)性。以上實(shí)驗(yàn)室一般檢查的陽(yáng)性結(jié)果多提示有梗阻性黃疸[4]，其對(duì)診斷胰腺癌并無(wú)特異性。臨床上還需進(jìn)一步采取影像學(xué)方法對(duì)梗阻的原因、性質(zhì)進(jìn)行鑒別，區(qū)分梗阻性黃疸是良性還是惡性，而且還需與其他胰腺腫物、炎性病變進(jìn)行鑒別診斷。總之，既往臨床實(shí)驗(yàn)室一般檢查診斷胰腺癌的靈敏度和特異度均不理想。

3 早期診斷胰腺癌的新的實(shí)驗(yàn)室檢查方法

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新為實(shí)驗(yàn)室早期診斷胰腺癌提供了可能性和新的途徑。目前對(duì)胰腺癌標(biāo)志物的研究已不再局限于傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)本。不同來(lái)源的標(biāo)本，如體液（胰液、囊腫穿刺液、腹腔積液）、糞便提取液、活檢組織及提取液等也可進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。對(duì)胰腺癌的腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）和腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA）進(jìn)行檢測(cè)，是目前臨床實(shí)驗(yàn)室早期輔助診斷胰腺癌的新途徑。臨床對(duì)胰腺癌的早期診斷有了新的診斷途徑和可能的手段[5-7]。

3.1 胰腺癌相關(guān)血清標(biāo)志物檢測(cè)

3.1.1 糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9） CA19-9 是消化系統(tǒng)TAA。研究報(bào)道，在肝、膽、肺及其他系統(tǒng)良性病變患者中，CA19-9水平可輕度升高；在胰腺炎和黃疸等胰腺良性病變患者中，CA19-9 水平可有短時(shí)、中等程度升高，但一般﹤120 kU/L[8]。Steinberg 等[9]研究報(bào)道，血清CA19-9 水平﹥100 kU/L 診斷胰腺癌的特異度為98%；若CA19-9 水平達(dá)1000 kU/L，則診斷胰腺癌的特異度可達(dá)99.8%。蘇紅權(quán)[10]的研究報(bào)道，血清CA19-9 對(duì)合并肝外惡性梗阻性黃疸的胰腺癌和膽管癌的診斷價(jià)值中等，對(duì)壺腹癌和十二指腸癌的診斷價(jià)值不大。盧熹微等[11]研究報(bào)道，胰腺癌患者體內(nèi)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、CA19-9、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2（insulin like growth factor binding protein 2，IGFBP2）水平均顯著升高，高水平的CTC、CA19-9、IGFBP2 是胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子，或可用于臨床輔助診斷胰腺癌。目前臨床可以應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)輔以核素、熒光物質(zhì)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等技術(shù)對(duì)體液或組織中的CA19-9 水平進(jìn)行檢測(cè)。

3.1.2 CAM17.1 CAM17.1 是一種免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗體，對(duì)胰液中的黏液糖蛋白有很高的特異性。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，CAM17.1 在胰腺癌組織中過表達(dá)[12]。報(bào)道顯示，CAM17.1 診斷胰腺癌的靈敏度為86%，特異度為91%；CAM17.1 診斷無(wú)黃疸胰腺癌的靈敏度可達(dá)89%，特異度可達(dá)94%[13]。因此認(rèn)為，CAM17.1 對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值可能優(yōu)于CA19-9。

3.1.3 糖類抗原50（carbohydrate antigen 50，CA50） CA50 是以唾液酸酯和唾液酸糖蛋白為主要成分的糖類抗原。一般情況下，機(jī)體正常成熟的組織中不存在CA50。當(dāng)機(jī)體上皮細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，由于糖基轉(zhuǎn)移酶失活或胚胎期才活躍的某些轉(zhuǎn)化酶被激活，使細(xì)胞表面的糖類結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生變化，形成CA50。研究報(bào)道，在多種不同組織來(lái)源的上皮性惡性腫瘤患者的體液及組織中可分離出CA50[14]。因此部分學(xué)者認(rèn)為CA50 可作為胰腺癌和其他消化系統(tǒng)腫瘤的血清標(biāo)志物?？梢奀A50 是普遍存在于多種惡性腫瘤中的TAA，并非胰腺癌的TSA。

3.1.4 人胰彈性蛋白酶（human pancreatic elastase，HPE） HPE 于胰腺腺泡中產(chǎn)生，以酶原形式存在于外分泌液中，可被胰蛋白酶激活，包括Ⅰ亞型和Ⅱ亞型。研究報(bào)道，HPEⅠ亞型在胰腺乳頭癌和胰頭癌中的陽(yáng)性檢出率分別為88%和86%，在胰腺體部癌中的陽(yáng)性檢出率為25%[15]。研究表明，HPEⅠ亞型對(duì)直徑﹤3 cm 的早期胰頭癌有較高的診斷價(jià)值[16]。HPEⅠ亞型對(duì)胰腺腫瘤（未合并急慢性胰腺炎）的診斷具有較高的特異度[17]。因此臨床中或許可通過聯(lián)合檢測(cè)HPEⅠ亞型與血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平提高胰腺癌的陽(yáng)性檢出率并對(duì)胰腺腫物的良惡性進(jìn)行鑒別診斷。

3.1.5 其他胰腺癌相關(guān)TAA 指標(biāo) ①胰癌抗原（pancreatic oncofetal antigen，POA）：POA 在胰腺癌中的陽(yáng)性檢出率為48%～60%，在血清中的含量隨疾病進(jìn)展而升高。②胰島淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP）：由胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生，在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌中正常表達(dá)。Ding 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IAPP 在胰腺癌患者血漿中表達(dá)水平升高，其機(jī)制可能是胰腺癌細(xì)胞分泌的可溶性IAPP 釋放因子可以刺激胰島細(xì)胞選擇性分泌血漿IAPP。血漿IAPP 水平升高是早期胰腺癌的特征，IAPP 或IAPP 釋放因子檢測(cè)有助于胰腺癌的早期診斷。③Du-PAN-2：是一種黏性糖蛋白。Du-PAN-2 抗原主要存在于胰腺、膽管等上皮腺管內(nèi)。在健康人血清、唾液腺、胃、大腸和小腸細(xì)胞內(nèi)也可檢測(cè)到低水平的Du-PAN-2。研究顯示，70%～80%的胰腺癌患者中Du-PAN-2 與CA19-9 呈同等水平升高[19]。④CEA：在胰腺癌和其他消化系統(tǒng)腫瘤中均可檢測(cè)到CEA 水平升高，CEA 升高診斷胰腺癌無(wú)特異性。⑤SiSo 細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合腫瘤抗原（receptor cancer-binding antigen expressed on SiSo cell，RCAS1）：楊盈赤等[20]研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌、慢性胰腺炎患者及健康人的血清RCAS1、CA19-9 和糖類抗原242（carbohydrate antigen 242，CA242）水平，結(jié)果顯示，胰腺癌患者血清中3 種腫瘤標(biāo)志物水平均顯著升高，其中RCAS1在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，可作為早期診斷胰腺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物。以上指標(biāo)異常提示發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)升高，但其對(duì)胰腺癌的診斷特異度尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 胰腺癌相關(guān)基因突變的檢測(cè)

胰腺癌的發(fā)生可能與基因突變有關(guān)。目前胰腺癌相關(guān)突變基因，如癌基因鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、抑癌基因p53已得到大量的臨床研究證實(shí)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室可以通過檢測(cè)胰腺癌相關(guān)基因的突變情況對(duì)其進(jìn)行輔助診斷。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索出一些具有一定靈敏度、特異度的胰腺癌基因診斷標(biāo)志物，包括KRAS基因12 密碼子、抑癌基因p53、端粒酶。

3.2.1KRAS基因12 密碼子 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)，可從少量標(biāo)本中快速、準(zhǔn)確地檢出KRAS基因12 密碼子突變情況。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺原位癌階段就已存在KRAS基因突變，提示KRAS基因突變可作為胰腺癌早期診斷標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者中KRAS基因12密碼子突變率可達(dá)93.3%[21]。一項(xiàng)研究在8 例腫瘤直徑1.2～1.3 cm 的胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，75%的患者存在KRAS基因12 密碼子突變[22]。另有研究在31例腫瘤直徑﹤2 cm 的胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，80%的患者存在KRAS基因12 密碼子突變[23]。部分學(xué)者報(bào)道，在胰腺癌癌前病變、胰腺癌出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移時(shí)，運(yùn)用PCR 技術(shù)在外周血中可檢測(cè)出KRAS基因12密碼子突變，但2 例胰島素瘤患者的外周血中均未發(fā)現(xiàn)KRAS突變[24]。以上研究結(jié)果提示，臨床采集胰液、運(yùn)用PCR 反應(yīng)及直接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行KRAS基因突變檢測(cè)，有助于對(duì)胰腺癌進(jìn)行早期診斷。

研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因12 密碼子突變與胰腺癌臨床分期和預(yù)后無(wú)關(guān)[25]。早期胰腺癌即有很高的KRAS基因12 密碼子突變率，在≤2 cm 的早期胰腺癌患者中即可檢出這一基因突變陽(yáng)性。因此KRAS基因12 密碼子突變檢測(cè)可用于臨床早期診斷胰腺癌。實(shí)驗(yàn)室對(duì)獲得的標(biāo)本進(jìn)行KRAS基因12 密碼子突變檢測(cè)，不會(huì)影響對(duì)該標(biāo)本的病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。文獻(xiàn)報(bào)道，部分胰腺腫塊患者的胰液脫落細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了KRAS基因12 密碼子突變陽(yáng)性，其在檢出后的第18 個(gè)月、第40 個(gè)月分別明確診斷為胰腺癌[26]?？梢?，對(duì)KRAS基因12 密碼子突變情況進(jìn)行檢測(cè)可為實(shí)驗(yàn)室早期診斷胰腺癌提供較為可靠的手段。

3.2.2 抑癌基因p53抑癌基因p53突變呈多位點(diǎn)發(fā)生且多在5～8 外顯子上，這使得實(shí)驗(yàn)室對(duì)p53基因突變的檢測(cè)分析較為困難。p53 蛋白性質(zhì)穩(wěn)定、代謝較慢。在良性胰腺疾病中，p53基因突變檢出率較低，但在浸潤(rùn)期胰腺癌患者中均可檢出p53基因突變。Deckard-Janatpour 等[27]運(yùn)用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）方法檢測(cè)胰腺癌標(biāo)本中p53基因突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41%（29/71）的患者p53基因突變陽(yáng)性。提示實(shí)驗(yàn)室或可通過檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)p53基因突變情況輔助診斷早期胰腺癌。

3.2.3 端粒酶 端粒酶是具有逆轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白。一般情況下，在健康人體細(xì)胞中端粒酶并無(wú)活性。胰腺癌是高度惡性腫瘤，研究報(bào)道，在84%（32/38）的胰腺癌手術(shù)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)端粒酶陽(yáng)性[28]。端粒酶在正常胰腺中和良性胰腺疾病時(shí)處于抑制狀態(tài)。胰腺癌患者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，其端粒酶被重新激活，呈持續(xù)活化狀態(tài)。以上研究結(jié)果提示在腫瘤細(xì)胞中端粒酶呈特異性表達(dá)，表明端粒酶活化在胰腺癌的發(fā)生中起著重要的作用。運(yùn)用PCR-SSCP 方法檢測(cè)由內(nèi)鏡檢查獲得的胰腺組織標(biāo)本、胰液，或可作為早期無(wú)創(chuàng)診斷胰腺癌的新途徑。已有研究報(bào)道，在胰腺癌和慢性胰腺炎患者胰液中均發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變和端粒酶活性[29]。提示聯(lián)合檢測(cè)胰液中KRAS基因與端粒酶活性有助于提高胰腺癌早期診斷的靈敏度和特異度。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，目前臨床對(duì)胰腺癌的一般實(shí)驗(yàn)室診斷并無(wú)太大的實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。但是對(duì)胰腺癌相關(guān)基因和血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，可為胰腺癌的早期診斷提供依據(jù)。在有條件開展分子生物學(xué)技術(shù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，可以選擇不同來(lái)源的胰腺組織標(biāo)本，對(duì)具有較高診斷靈敏度和特異度的胰腺癌相關(guān)TAA 和TSA 指標(biāo)進(jìn)行早期實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，有助于對(duì)胰腺癌進(jìn)行早期診斷。