清香型白酒新酒和陳酒感官特征及香氣物質(zhì)的差異性分析

孫細珍，熊亞青，劉家歡，錢全全，解倩倩，魏淑霞，陳彥和

（1.勁牌有限公司，湖北 黃石 435100；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435100）

小曲清香型白酒屬于清香型白酒類別[1]，具有香氣自然、純正清雅的獨特風味，深受中國湖北、重慶、云南等地消費者喜愛，年產(chǎn)量超過20萬 kL。白酒中水和乙醇的含量約占總體積的98%，而決定其風格差別的香氣成分僅約占2%[2]。新釀造的白酒入口辛辣暴沖，刺激性強，新酒味較重，口感欠佳，經(jīng)過一段時間的貯存后，酒體變得柔和，具有綿甜爽凈的老熟風味[3]，促進白酒的質(zhì)量提升。白酒陳釀過程中會產(chǎn)生復雜的物理和化學變化[4]，如揮發(fā)、締合、氧化還原、酯化、水解、縮合等反應，這些變化使酒中的微量成分趨于新的平衡，達到香濃、醇和、味凈的要求。

隨著科學的不斷進步，越來越多的提取、分離手段廣泛應用于分析白酒中的微量成分，如直接進樣、液液萃取[5]（liquid-liquid extraction，LLE）、液液微萃取[6]（liquid-liquid microextraction，LLME）、頂空固相微萃取[7]（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）、溶劑輔助蒸發(fā)萃取[8]等，薄膜固相微萃?。╰hin film solid-phase microextraction，TF-SPME）作為一項新的提取技術(shù)，通過將吸附相涂在碳網(wǎng)片上提高相表面積和體積，較之常規(guī)的SPME更為靈敏和準確[9]，具有良好的應用前景；以上技術(shù)與氣相色譜-嗅聞[10]（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、氣相色譜-質(zhì)譜[11]（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、全二維飛行時間質(zhì)譜[12]等鑒定技術(shù)的聯(lián)合使用，更是有力地推動了酒類產(chǎn)品風味研究的進展。

近年來，研究白酒陳釀過程中風味物質(zhì)的變化規(guī)律多有報道，任宏彬等[13]采用氣相色譜直接進樣法發(fā)現(xiàn)清香型白酒中酯類物質(zhì)隨貯存時間的延長呈下降的趨勢，其中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量下降明顯；李曉等[14]采用氣相色譜直接進樣法發(fā)現(xiàn)清香型白酒在12 個月的貯存過程中，總酸、乙縮醛含量呈上升趨勢，總酯、乙醛呈下降趨勢；秦丹等[15]采用LLME-GC-MS發(fā)現(xiàn)青稞酒原酒貯存過程中總酯、總醇、總酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、4-乙基苯酚、苯甲醛、乙偶姻、糠醛的含量變化規(guī)律。研究清香型白酒新酒和陳酒感官特征與香氣物質(zhì)差異，對調(diào)控陳釀工藝、提高白酒風味品質(zhì)具有重要的指導意義。

本實驗以清香型白酒新酒和陳酒為研究對象，基于感官評價定量描述，采用GC-O-MS、TF-SPME-GC-MS技術(shù)對清香型白酒中香氣物質(zhì)進行定性與定量分析，通過香氣萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）、香氣活度值（odor activity value，OAV）、香氣重組實驗篩選出清香型白酒中重要的風味化合物，進一步采用熱圖分析新酒和陳酒中香氣物質(zhì)的差異性；通過全面解析清香型白酒新酒和陳酒的香氣輪廓與香氣物質(zhì)差異，為調(diào)控優(yōu)化清香型白酒的陳釀工藝、進一步提高清香型白酒的風味品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型白酒樣品由勁牌有限公司生產(chǎn)，新酒（標記為QXBJ-Y）貯存時間小于6 個月；陳酒（標記為QXBJ-A）于陶缸中貯存8 a；新酒和陳酒各10 批，編號分別為QXBJ-Y1～10，QXBJ-A1～10。

無水乙醇、二氯甲烷（使用前需重蒸）（均為色譜純）北京邁瑞達科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；正構(gòu)烷烴（C7～C18）、叔戊醇、乙酸正戊酯、辛酸乙酯-D15、2-辛醇等標準品 美國Sigma-Aldrich公司；其他標準品 上海安譜實驗科技股份有限公司；本實驗中使用的標準品均為色譜純，乙醛純度不小于40%，其他標準品純度均不小于98%，本實驗中所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB135-S十萬分之一電子分析天平 美國Mettler-Toledo公司；FA2004萬分之一天平 上海精密科學儀器有限公司；Flex 2純水處理系統(tǒng) 上海威立雅水處理技術(shù)有限公司；DC12H氮吹儀 上海安譜科技有限公司；Multi Reax渦旋振蕩儀 德國海道夫儀器公司；ZNCL-BS智能磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；8890-5977B GC-MS聯(lián)用儀、8890氣相色譜儀（配氫火焰離子檢測器）、150位液體進樣器、DB-FFAP毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國Agilent科技有限公司；嗅聞儀（ODP4）、MPS 2樣品前處理平臺、熱脫附管、熱脫附單元（thermal desorption unit，TDU）、冷卻注射系統(tǒng)（cooled injection system，CIS）、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯-薄膜固相微萃取裝置 德國Gerstel 公司。

1.3 方法

1.3.1 感官定量描述分析

參照ISO 8586—2012《感官分析 選拔、培訓和管理評價員及專家評價員的一般指南》對清香型白酒樣品進行感官分析。感官評價小組由10 名專業(yè)評酒委員（6 男4 女，其中國家級評酒委員5 人，省級評酒委員5 名）組成。感官評價實驗在恒溫實驗室（（20±1）℃）進行，小組成員對清香型白酒新酒和陳酒進行聞香訓練，熟悉新酒和陳酒的香氣特征，對清香型白酒的香氣屬性進行討論，并與對應的參照物進行對比確認，選取焦香、水果香、甜香、花香、糟香、酸味、醇香和青草香作為清香型白酒的香氣屬性描述詞。

小組成員分別對清香型白酒新酒及陳酒的整體香氣輪廓在8 個香氣屬性上進行分析，根據(jù)香氣強度進行打分（0～5 分計），其中“0”表示沒有聞到氣味，“5”表示香氣強度最強。以所有小組成員打分的平均值作為最終結(jié)果，繪制香氣輪廓圖。

1.3.2 新酒和陳酒的比較香氣萃取物稀釋分析

1.3.2.1 風味物質(zhì)的提取與分離（LLE）

參考孫細珍等[16-17]的方法并略作改動，分別取QXBJ-Y1和QXBJ-A1代表性酒樣100 mL，用超純水稀釋至乙醇體積分數(shù)為10%～15%，加氯化鈉至溶液飽和，然后用二氯甲烷萃取3 次（共210 mL，70 mL/次），合并3 次的萃取液于三角瓶中，加入適量無水Na2SO4，密封后置于冰箱（-20 ℃）中脫水干燥，過濾后將有機相用氮氣緩慢濃縮至0.5 mL，萃取物采用濾紙進行感官確認，要求具備樣品的典型香氣特征，用于GC-O-MS分析。

1.3.2.2 風味物質(zhì)的鑒定

經(jīng)LLE提取分離后得到的濃縮液分別在GC-MS上經(jīng)HP-5和DB-FFAP色譜柱進行分析。采用DB-FFAP色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）分析時，升溫程序為：初溫40 ℃，以3.5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，再以15 ℃/min升至250 ℃；載氣（高純He≥99.999%）流速為1.42 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，進樣量為1 μL，不分流進樣；采用HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）分析時，升溫程序為：初溫50 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，以30 ℃/min升至320 ℃，保持10 min。載氣（高純He≥99.999%）流速為1 mL/min，進樣口溫度為280 ℃，進樣量為1 μL，不分流進樣。

M S 條件：電子電離源；電子能量70 e V；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；輔助通道加熱溫度280 ℃；掃描模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z20～500。

GC-O條件：在配有嗅聞儀（ODP4）的GC-MS上進行；樣品經(jīng)DB-FFAP分離后按照1∶1的分流比分別進入嗅聞儀及質(zhì)譜，嗅聞儀傳輸線溫度為250 ℃，嗅聞口溫度為200 ℃，加濕器流速50 mL/min。3 名經(jīng)嗅聞訓練[8]的評價人員（1 名男性和2 名女性）對樣品進行GC-O分析，分析過程中將鼻子置于嗅聞口前，記錄色譜流出物的保留時間和香氣特征。

1.3.2.3 比較香氣萃取物稀釋分析（comparative aroma extract dilution analysis，CAEDA）

參照文獻[1]方法將LLE得到的濃縮液在進樣分析前逐級進行稀釋（稀釋位數(shù)為2，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、…），隨后采用1.3.2.2節(jié)條件進樣GC-O分析，測定各風味物質(zhì)的香氣稀釋因子（flavor dilution，F(xiàn)D，即GC-O分析時能被嗅覺感知到的最大稀釋倍數(shù)）。

1.3.3 定量分析

1.3.3.1 氣相色譜-氫火焰離子檢測器

參考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》，對清香型白酒中含量較高的常量指標（包括乙醛、乙酸乙酯、乙縮醛、正丙醇、異丁醇、3-甲基丁醇、乳酸乙酯、乙酸共8 種）采用氣相色譜-氫火焰離子檢測器（內(nèi)標法測定，內(nèi)標物分別為叔戊醇（IS1，16000 mg/L）、乙酸正戊酯（IS2，16000 mg/L）、2-乙基丁酸（IS3，16000 mg/L）。

1.3.3.2 TF-SPME-GC-MS

除上述常量指標外，其他化合物采用TF-SPMEGC-MS方法進行定量[19]。用超純水將待測樣品稀釋至乙醇體積分數(shù)為10%，取8 mL于頂空瓶（20 mL）中，加入20 μL內(nèi)標混合物（2-辛醇，IS4，150 mg/L；辛酸乙酯-D15，IS5，250 mg/L），加入NaCl使溶液飽和，蓋上頂空瓶蓋，搖勻。在頂空瓶蓋上插入薄膜支架，將薄膜（使用前已于250 ℃老化1 h）懸掛于樣品溶液上方，密封后置于磁力攪拌器上攪拌60 min（50 ℃、1000 r/min）。取出薄膜于解吸管中脫附后，經(jīng)DBFFAP色譜柱進行GC-MS分析，GC-MS條件同1.3.2.2節(jié)。

采用溶劑排空模式，流速為60 mL/min，TDU初始溫度為40 ℃，保留1 min，以60 ℃/min的速率升溫至250 ℃，并保持4 min；TDU傳輸線溫度為280 ℃，采用液氮冷卻，初始溫度為-100 ℃平衡0.5 min，然后以12 ℃/s的速率升溫至250 ℃，保持3 min。

1.3.4 OAV的計算

柏木烯、柏木腦的香氣閾值通過自主測定獲得[20]，其他化合物的香氣閾值由文獻查閱獲得。閾值測定方法：用46%乙醇溶液配制一系列濃度風味物質(zhì)標準溶液，采用三點選配法測定。根據(jù)每個人的評價結(jié)果，采用最優(yōu)級估計閾值法，得個人閾值TBET，根據(jù)公式計算各化合物的香氣閾值。

各物質(zhì)的OAV為氣味物的平均濃度Ci與其閾值Ti之比，即OAV=Ci/Ti。暫不考慮風味物質(zhì)的相互影響，當OAV＜1時，說明該物質(zhì)對樣品總體氣味貢獻不明顯；當OAV≥1時，說明該物質(zhì)對樣品總體氣味有明顯貢獻，OAV越大說明該物質(zhì)對樣品總體氣味的貢獻程度越大，通常認為OAV≥1的化合物為氣味活性物質(zhì)。

1.3.5 香氣重組實驗

將表2中OAV≥1的風味物質(zhì)進行香氣重組實驗，分別將新酒和陳酒中OAV≥1的風味物質(zhì)按其定量濃度配制于模擬基質(zhì)中（將95%的食用乙醇經(jīng)脫臭處理，用超純水稀釋至55%，調(diào)整pH值至4.2），于室溫下平衡10 min，建立對應的香氣模型，同時準備新酒和陳酒樣品各一杯，在清香型白酒的8 個風味屬性上進行感官評價分析。

1.4 統(tǒng)計與分析

每個獨立實驗均進行至少3 次平行實驗。風味物質(zhì)定量結(jié)果以表示。應用SPSS 22.0對不同樣本之間的最小顯著差異進行單因素分析，P≤0.05被認為具有統(tǒng)計學差異；使用Origin 2019對數(shù)據(jù)進行說明。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒香氣輪廓分析

從圖1可知，陳酒中焦香、甜香、酸味的香氣強度高于新酒，而糟香、水果香、青草香和醇香在新酒中的香氣強度則高于陳酒，新酒和陳酒中花香的香氣強度相近。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)焦香、甜香、酸味、青草香、水果香在新酒和陳酒中存在顯著性差異（P≤0.05）。

圖1 清香型白酒新酒和陳酒感官評價Fig.1 Sensory evaluation of young and aged baijiu

2.2 風味物質(zhì)定性與鑒定確認

為了進一步明確新酒和陳酒中揮發(fā)性物質(zhì)差性，通過GC-O-AEDA方法對兩者的香氣提取液進行分析。采用NIST譜庫檢索、保留指數(shù)（retention index，RI）、香氣特征比對，最后通過標準品確認，從清香型白酒中鑒定出結(jié)果FD不小于2的風味物質(zhì)共69 種，包括酯類19 種、醇類12 種、酸類8 種、醛酮類10 種、呋喃與內(nèi)酯類10 種、酚類6 種、萜烯類3 種、硫化物1 種，結(jié)果如表1 所示。其中，2,3-丁二酮、2-戊基呋喃、2-乙?；秽?、糠酸乙酯、糠醇、γ-戊內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、柏木烯、柏木腦在清香型白酒中首次通過AEDA方法被鑒定出。

表1 清香型白酒中香氣化合物AEDA鑒定結(jié)果Table 1 Information about aroma compounds in qingxiangxing baijiu identified by AEDA

由表1可知，陳酒中香氣化合物的整體強度大于新酒。陳酒中共計10 種風味物質(zhì)的FD不小于256，包括為辛酸乙酯、異戊酸乙酯、二甲基三硫、1,1-二乙氧基乙烷、香草醛、3-甲基丁醛等；新酒中FD不小于256的化合物共7 種，包括二甲基三硫、辛酸乙酯、乙酸乙酯、1,1-二乙氧基乙烷、丁酸乙酯等。這些化合物對形成清香型白酒陳酒和新酒的風味特征具有重要影響。

從清香型白酒中共鑒定出19 種呈水果香、花香、甜香等愉悅香氣的酯類化合物，陳酒中所有酯類的FD均大于新酒，酯類化合物主要來自于微生物的產(chǎn)酯生化反應，另有一部分酯類來自于蒸餾或陳釀過程中的有機酯化反應[21]。通過對比發(fā)現(xiàn)新酒中大多數(shù)醇類物質(zhì)的香氣強度與陳酒相當，其中新酒中正丙醇的FD值大于陳酒，乙醇的香氣強度也大于陳酒，而陳酒中β-苯乙醇的強度比新酒高，整體上新酒的醇香香氣強度大于陳酒，醇類化合物主要通過原料中糖類物質(zhì)在有氧條件下產(chǎn)生，或通過酵母等微生物通過還原相應的醛類化合物而形成[22]。清香型白酒中FD值較大的酸類物質(zhì)主要為乙酸（醋）、丁酸（奶酪）和戊酸，在陳酒中酸類物質(zhì)的FD值均大于新酒，酸類物質(zhì)對清香型白酒的口感提升具有重要作用；此外發(fā)現(xiàn)呈煙熏氣味的愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚和呈丁香氣味的4-乙基愈創(chuàng)木酚、乙醛（青草）、香草醛、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、1,1-二乙氧基乙烷、糠醛在陳酒中香氣強度高于新酒；二甲基三硫在新酒和陳酒中均有較高的FD值，尤其在新酒中FD值達到2048，在陳酒中為1024。

2.3 定量分析與OAV

通過AEDA可以鑒定出對清香型白酒有香氣貢獻的化合物，計算OAV可以進一步確認它們對酒體的貢獻度。本研究通過建立標準曲線，對清香型白酒陳酒中54 種FD不小于4的風味物質(zhì)進行定量分析。各化合物對應的標準曲線及方法學參數(shù)如表2所示，每個化合物的方法學參數(shù)均滿足定量要求。從陳酒和新酒中分別鑒定出43 種和40 種重要的化合物（OAV≥1）。

表2 清香型白酒中54 種風味物質(zhì)定量結(jié)果Table 2 Results of qualitative analysis of 54 flavor substances in young and aged qingxiangxing baijiu

從表2可知，大多數(shù)FD值高的香氣化合物也具有較高的OAV，說明AEDA技術(shù)可以識別清香型白酒中的香氣活性化合物，而結(jié)合OAV計算的定量分析可以進一步補充和驗證AEDA的結(jié)果。清香型白酒陳酒中有20 種化合物的OAV高于新酒，包括丁酸乙酯、1,1-二乙氧基乙烷、異戊酸乙酯、異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醛、香草醛、乙醛、糠醛、己醛、苯乙醛、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、γ-壬內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、乙酸、異戊酸、愈創(chuàng)木酚；新酒中有8 種化合物的OAV高于陳酒，主要為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、二甲基三硫、3-甲基丁醇、正丙醇、異丁醇、月桂酸乙酯、2-戊基呋喃，這些是造成清香型白酒陳酒與新酒風味特征差異的主要原因。

2.4 香氣重組實驗

將清香型白酒陳酒和新酒中OAV不小于1（表2）的香氣物質(zhì)分別進行香氣重組實驗，以確認AEDA和OAV對重要香氣風味物質(zhì)的識別準確度。由感官評價小組對清香型白酒新酒和陳酒樣品與各自的重組模型進行對比分析，對8 個香味屬性的香氣強度分別進行打分，繪制風味輪廓圖，結(jié)果如圖2所示。重組模型與各自的原始樣品在8 種香氣屬性上均顯示出微小的差異（P＞0.05），表明本實驗對清香型白酒新酒和陳酒的主要香氣化合物獲得了成功表征。

圖2 清香型白酒陳酒（A）和新酒（B）重組實驗Fig.2 Flavor profiles of aged (A) and young (B) baijiu in aroma recombination experiments

2.5 香氣化合物的熱圖分析

為了進一步探索清香型白酒新酒和陳酒中風味物質(zhì)的差異，對54 種風味物質(zhì)進行熱圖分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 清香型白酒新酒和陳酒含量熱圖Fig.3 Heatmap of differential flavor substances between young and aged qingxiangxing baijiu

由圖3可知，新酒和陳酒中風味物質(zhì)在含量上存在較大的差異，兩者間重要的差異性風味物質(zhì)（P≤0.05）主要包括γ-丁內(nèi)酯、異戊酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、異丁酸乙酯、異戊酸、1,1-二乙氧基乙烷、β-苯乙醇、2-戊基呋喃、乙醛、丁酸、己酸乙酯、苯甲醛、糠醛、香草醛、己醛、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮等。整體上，陳酒中的微量風味物質(zhì)更為豐富，其中大部分酯類、有機酸、醛酮類在陳酒中高于新酒，而大部分醇類，如正丙醇、異丁醇、異戊醇則在新酒中更高。此外，清香型白酒主要的風味物質(zhì)乙酸乙酯在新酒中更高，呋喃類、內(nèi)酯類物質(zhì)則在陳酒中更高，因此清香型白酒新酒的醇香、酯香更強，而陳酒中焦香明顯高于新酒，這與感官評價結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

通過感官分析與定量描述，明確了清香型白酒新酒和陳酒的風味與感官特征差異，陳酒中焦香、甜香和酸味強度高于新酒，而新酒中青草味、水果香、糟香和醇味強度高于陳酒；通過提取、分離、鑒定樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)，并采用CAEDA和OAV法明確了新酒和陳酒的重要香氣物質(zhì)及差異，隨后根據(jù)定量結(jié)果分別配制新酒和陳酒樣品的模擬液，它們在8 個感官屬性上分別與原始樣品獲得了重組；新酒中重要的香氣物質(zhì)主要為二甲基三硫醚、辛酸乙酯、1,1-二乙氧基乙烷、3-甲基丁醛、乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、異丁酸乙酯、3-甲基丁醇、γ-丁內(nèi)酯等共40 種；陳酒中重要的香氣物質(zhì)主要為二甲基三硫醚、辛酸乙酯、1,1-二乙氧基乙烷、3-羥基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、異戊酸乙酯、異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛、γ-丁內(nèi)酯、苯乙醛、乙酸乙酯、愈創(chuàng)木酚、己酸乙酯、2,3-丁二酮、香草醛、己醛、乙醛、乙酸異戊酯、糠醛、丁酸乙酯、3-甲基丁醇等共43 種；最后通過熱圖對清香型白酒新酒和陳酒中差異性重要香氣物質(zhì)（P≤0.05）進行綜合分析，主要為γ-丁內(nèi)酯、異戊酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、異丁酸乙酯、異戊酸、1,1-二乙氧基乙烷、β-苯乙醇、2-戊基呋喃、乙醛、丁酸、己酸乙酯、苯甲醛、糠醛、香草醛、己醛、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮等。整體來說，清香型白酒新酒和陳酒中香氣物質(zhì)種類差異不明顯，但是在含量上存在較大的差異，陳酒中微量的香氣物質(zhì)更為豐富，大部分酯類、有機酸、醛酮類在陳酒中高于新酒，而大部分醇類，如正丙醇、異丁醇、異戊醇則在新酒中更高，香氣物質(zhì)含量差異對感官特征具有重要影響。本實驗通過探討清香型白酒陳釀后感官特征與香氣物質(zhì)的變化，為清香型白酒的貯存老熟提供參考。