王衛(wèi)華,楊曉琴,桑正林,楊順強,趙 平,劉 云,朱國磊,葉夏英,
(1.昭通學院農(nóng)學與生命科學學院,滇東北高原特色農(nóng)業(yè)研究中心,云南 昭通 657000;2.西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室,云南 昆明 650224)
筇竹(Chimonobambusa tumidissinodaHsueh &T.P.Yi ex Ohrnberger)為地下莖復軸混生中小型竹類,隸屬禾本科(Poaceae),竹亞科(Bambusoideae)、方竹屬(ChimonobambusaMakino)[1],是收錄于《中國珍稀瀕危保護植物目錄》的保護竹種,也是我國特有種質(zhì)資源[2]。筇竹自然分布于我國西南金沙江下游地區(qū),是云南昭通重要的生物資源,昭通天然筇竹林面積占全國天然筇竹林面積的70%以上[3]。筇竹筍具有肉厚、質(zhì)脆、味美之特性,是深受消費者青睞的食品。
果蔬的口感風味與其代謝物的種類、含量及這些代謝物在發(fā)育成熟過程中的動態(tài)變化等密切相關,例如番茄的口感風味與番茄中的有機酸、可溶性糖類等代謝物有關,其中的33 種代謝物與消費者的喜好存在明顯關聯(lián)[4-5]。Wang Ruochen等[6]對生長成熟過程中獼猴桃的風味物質(zhì)變化進行了研究,結(jié)果顯示,獼猴桃風味相關代謝物在其成熟過程中具有明顯的階段特異性。Gao Quan等[7]研究發(fā)現(xiàn)了新鮮竹筍中的苦澀味主要來源于竹筍的代謝產(chǎn)物L-苯丙氨酸。植物次生代謝產(chǎn)物是植物體內(nèi)合成的一類與生長發(fā)育不相關的小分子物質(zhì),它們通常在植物適應環(huán)境和應對脅迫的過程中起到關鍵作用[8],植物來源的食品也具有種類豐富的次生代謝產(chǎn)物(如酚酸類、黃酮類、生物堿類等),而這些代謝物與食品發(fā)揮抗氧化、抗炎、和改善代謝綜合征的生物活性與功能有關[9-12]。
目前,對筇竹筍營養(yǎng)成分的研究結(jié)果表明,筇竹鮮筍富含蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶性糖和粗脂肪等營養(yǎng)物質(zhì),必需氨基酸比例在34%以上[13]。楊奕等[14]通過分析測定3 個不同出土高度筇竹筍主要營養(yǎng)成分,認為出土高度為10~20 cm的筇竹筍營養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟價值最高。然而現(xiàn)有的研究僅局限于筍中的營養(yǎng)物質(zhì),對筇竹筍在生長過程中相關代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化和階段特異性,以及與筇竹筍口感風味相關的其他物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等的研究尚不夠深入。
廣泛靶向代謝組學是一種基于高通量檢測和多元數(shù)據(jù)處理,能夠全面、快速對樣品中小分子代謝物進行定性、定量分析,從而系統(tǒng)分析樣品代謝物差異水平和種類變化的新興技術[15-18]。因此,本研究利用基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)的廣泛靶向代謝組學方法對2 個不同生長期(出土高度為10 cm和25 cm)筇竹鮮筍進行分析,進一步探究筇竹筍代謝物以及其在筍生長過程中的動態(tài)變化和階段特異性,為筇竹資源的綜合開發(fā)和可持續(xù)利用提供參考。
筇竹筍樣品于2021年5月在云南昭通市大關縣三江口采集,經(jīng)昭通學院農(nóng)學與生命科學學院生物科學教研室鑒定確認為禾本科植物筇竹(C.tumidissinodaHsueh &T.P.Yi ex Ohrnberger)的嫩苗。分別量取出土高度為10 cm和25 cm的無蟲害竹筍,脫殼后在頂部、中部和基部各取5 g,混合后放置于凍存管中用液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱待測。
水、甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純)美國Merck公司;標準品二甲基亞砜(色譜純)云南西力生物技術股份有限公司。
Nexera X2 UPLC儀 島津(中國)有限公司;4500QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Applied Biosystems公司;SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)美國安捷倫公司;Scientz-100F普通型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;MM400冷凍混合研磨儀 德國萊馳公司;PTX-FA210S電子天平 華志(福建)電子科技有限公司;XH-D型旋渦振蕩器 美國賽默飛世爾科技公司;JIDI-16D臺式高速離心機 廣州吉迪儀器有限 公司。
1.3.1 樣品提取
樣品放置于凍干機中真空冷凍干燥后利用研磨儀研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀,稱取100 mg的粉末,溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中,后置于旋渦振蕩器,每30 min渦旋一次,每次持續(xù)30 s,共渦旋6 次,樣本置于4 ℃冰箱過夜,離心(12000 r/min,10 min)后,吸取上清,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾樣品,并保存于進樣瓶中,2 個不同生長期的筇竹筍樣本,分別重復取樣3 次,用于UPLC-MS/MS分析。
質(zhì)控樣本由不同組的筇竹筍樣本提取物等量混合制備而成,與分析樣本采用相同處理和檢測方法,重復測定3 次。儀器分析過程中,每10 個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本,以監(jiān)測分析過程的重復性。
1.3.2 UPLC-MS/MS采集條件
UPLC條件:柱溫40 ℃,流速0.35 mL/min,進樣量4 μL;流動相:A相為超純水(加入0.1%甲酸),B相為乙腈(加入0.1%甲酸);洗脫梯度:0.00 min,95% A,5% B;0.00~9.00 min,95%~5% A,5%~95% B,保持1 min;10.00~11.10 min,5%~95% A,95%~5% B,并以5% B平衡至14 min。
MS條件:電噴霧離子源;離子源溫度550 ℃;離子噴霧電壓5500 V(正離子模式)/-4500 V(負離子模式)。三重四極桿掃描使用多反應監(jiān)測模式,根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物,在每個時期監(jiān)測一組特定的多反應監(jiān)測模式離子對。
利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),用MultiaQuant軟件,基于自建數(shù)據(jù)庫(metware database,MWDB),對樣本的代謝物進行質(zhì)譜定性定量分析,對所有代謝物質(zhì)譜峰進行積分,并對同一物質(zhì)質(zhì)譜峰進行積分校正[19]。多元統(tǒng)計包括無監(jiān)督模式識別的主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監(jiān)督模式識別的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)。OPLS-DA在原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后,再進行中心化處理,然后利用R軟件進行分析。差異代謝物篩選采取將OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值、差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)值相結(jié)合的方法。顯著差異代謝物基于2 個篩選標準:1)FC≥2和FC≤0.5的代謝物;2)VIP≥1的代謝物。
經(jīng)過代謝組分析,2 個生長時期的筇竹筍樣本中共檢測鑒定出875 種代謝物(圖1),按代謝物類型將代謝物分為13 類(圖2)。利用面積歸一法獲得各類物質(zhì)的相對含量(表1),25 cm筇竹筍較10 cm樣本相比,糖及醇類、黃酮類、生物堿類相對含量上浮明顯,脂質(zhì)、氨基酸及衍生物占比有所下降。
表1 2 個不同生長期筇竹筍樣本各類代謝物相對含量Table 1 Relative contents of metabolites in bamboo shoots at two different growth stages
根據(jù)代謝組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在875 種代謝物中,筇竹筍樣品中的脂質(zhì)成分種類最多,相對豐度最高,鑒定出脂質(zhì)156 種,包括74 種游離脂肪酸,18 種甘油酯及94 種其他脂類等。其中亞油酸和α-亞麻酸在875 個鑒定代謝物的相對含量分別達3.94%和2.90%。亞油酸和α-亞麻酸是人體必需的不飽和脂肪酸,具有降脂和保護心腦血管等作用[20-22]。本研究表明筇竹筍中不飽和脂肪酸占脂肪酸的主導地位,這與其他竹筍研究結(jié)論[23]基本一致。另有研究顯示,竹筍膳食纖維能夠降低人體低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和動脈粥樣硬化 指數(shù)[24-25]。根據(jù)本研究結(jié)果推測,筇竹筍中豐富的不飽和脂肪酸等脂質(zhì)成分可能是筇竹筍具備改善代謝綜合征(血脂異常)作用的重要物質(zhì)基礎。
從筇竹筍中鑒定出氨基酸及其衍生物共97 種,其中包含蛋白氨基酸17 種,必需氨基酸8 種。利用測出的17 種蛋白氨基酸的相對含量與17 種氨基酸相對含量總和進行比較,求出各氨基酸的相對含量(表2)。從表2可以看出,筇竹筍樣本中L-谷氨酸的相對含量最高,達23.59%;必需氨基酸在17 種氨基酸中的相對含量達34.13%。根據(jù)游離氨基酸的呈味特征[26],從表2還可以分析得出,筇竹筍中鮮味氨基酸如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸,甜味氨基酸如L-脯氨酸相對含量較高,而苦味氨基酸如竹筍中最主要的苦味因子L-苯丙氨酸相對含量較低。這可能是筇竹筍具有鮮甜口感,受消費者喜好的關鍵原因和重要物質(zhì)基礎。
表2 筇竹筍樣本中氨基酸的相對含量Table 2 Relative contents of amino acids in bamboo shoots
從筇竹筍中還鑒定出有機酸77 種(檸檬酸、L-蘋果酸、茉莉酸等)、糖及醇類67 種(3-脫氫-L-蘇糖酸、D-蔗糖、D-果糖等)、維生素19 種(煙酰胺、D-泛酸、抗環(huán)血酸等)、核苷酸及其衍生物56 種(腺嘌呤、鳥苷等)、其他類17 種(4-胍基丁醛等)。據(jù)此可以看出筇竹筍中維生素種類豐富,營養(yǎng)價值高,其中有機酸和可溶性糖種類豐富、相對含量較高,可能也是筇竹筍風味口感形成的重要物質(zhì)基礎。
此外,從筇竹筍中鑒定出比較豐富的次生代謝產(chǎn)物,包括黃酮類101 種(4′-羥基-5,7-二甲氧基黃酮、芹菜素-8-C-(2″-葡萄糖基)阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷等)、酚酸類147 種(3-O-阿魏酰奎寧酸、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、4-羥基苯甲酸等)、生物堿94 種(2-羥基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3(2H)-酮、五羥色胺、哌啶等)、萜類23 種(貝殼杉烯酸等)、木脂素和香豆素17 種(東莨菪內(nèi)酯-7-O-葡萄糖醛酸苷等)、醌類4 種(大黃酚-9-蒽酮等)。由于植物次生代謝產(chǎn)物通常具備一定生物活性,因此這些物質(zhì)成分可能是筇竹筍發(fā)揮活性功能,適應環(huán)境的重要物質(zhì)基礎。
為了解各分組樣本之間的主要代謝物和組內(nèi)樣本之間的差異,運用PCA對2 個不同生長期的筇竹筍樣本和質(zhì)控樣本(mix)進行分析。由圖3可知,PC1貢獻率為44.40%,PC2貢獻率為40.07%,前5 個PC的累計可解釋變異為93.86%,所有樣品坐標點均分布于95%置信區(qū)域,說明該模型可分析不同生長期筇竹筍代謝物的差異情況。質(zhì)控樣本和各組內(nèi)樣本基本重合,表明檢測的穩(wěn)定性和可靠性良好。生長期10 cm的筇竹筍樣本與生長期25 cm的筇竹筍樣本組間差異大,分離趨勢明顯,說明2 個不同生長時期的樣本代謝物存在明顯差異。
圖3 2 個不同生長期筇竹筍樣本與質(zhì)控樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)的PCA得分圖Fig.3 PCA score plot of MS data of bamboo shoots at two different growth stages and those of quality control samples
為進一步分析2 個不同生長期筇竹筍的代謝物差異,篩選2 個組別的差異代謝物,對樣本進行OPLSDA。從圖4A可知,生長期為10 cm的筇竹筍與25 cm的筇竹筍在代謝物上存在顯著差異,這一結(jié)果與PCA的結(jié)果相似。為驗證OPLS-DA的準確性,本模型對數(shù)據(jù)進行了200 次隨機排列組合,模型的=0.801、=1、Q2=0.992,表明所構(gòu)建的OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠,具備良好預測性,適合進一步篩選2 個不同生長期筇竹筍的差異代謝物。
圖4 2 個不同生長期筇竹筍樣本OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA plot of bamboo shoots at two different growth stages
基于OPLS-DA模型的VIP、單變量分析的FC和相應的篩選標準,對分組樣本的差異代謝物進行篩選。如圖5A所示,生長期為10 cm的筇竹筍與生長期為25 cm筇竹筍共存在283 個顯著差異代謝物,2 個不同生長期的筇竹筍顯著差異代謝物個數(shù)占所有檢測出代謝物總數(shù)的32.34%,表明2 個不同生長期筇竹筍的代謝物差異較為顯著。其中生長期25 cm的樣本相較于10 cm樣本上調(diào)代謝物154 個(包括酚酸類44 個、黃酮類32 個、糖及醇類19 個等),下調(diào)代謝物129 個(包括生物堿類22 個、氨基酸及衍生物15 個、脂質(zhì)類15 個等)。
圖5 2 個不同生長期筇竹筍樣本差異代謝物火山圖(A)和排名前20 差異代謝物FC柱狀圖(B)Fig.5 Volcano map (A) and histogram (B) of top 20 most significantly differential metabolites from bamboo shoots at two different growth stages
將衡量代謝成分顯著差異的定量信息FC通過數(shù)學變換為log2FC,按log2FC值篩選出排名前20的顯著差異代謝物(圖5B)。從圖5B可知,在25 cm的筇竹筍樣本中,檸檬酸、沒食子酸、綠原酸等有機酸,酚酸類和多種黃酮類成分出現(xiàn)顯著上調(diào),而N-阿魏酸五羥色胺、吲哚等成分出現(xiàn)顯著下調(diào)。為直觀反映出筇竹筍中主要營養(yǎng)成分和風味物質(zhì)的階段特異性,將2.1節(jié)分析得到的20 種主要營養(yǎng)成分的具體差異情況列出(表3),結(jié)合2 個生長期主要營養(yǎng)成分的VIP、FC值和顯著差異代謝物的篩選標準,從表3可知,亞油酸、α-亞麻酸及多個氨基酸在筇竹筍2 個不同生長期的差異并不顯著,而在25 cm的筇竹筍樣本中,苦味因子L-苯丙氨酸比10 cm樣本的相對含量略低。
表3 2 個不同生長期筇竹筍樣本中20 種主要營養(yǎng)成分VIP值和FC值Table 3 VIP and FC of 20 major nutrient components in bamboo shoots at two different growth stages
為進一步探索2 個不同生長期筇竹筍中代謝通路的差異,利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)對統(tǒng)計篩選出的顯著差異代謝物進行功能注釋。283 個顯著差異代謝物中有102 個代謝物被注釋到82 條代謝通路中,其中被注釋的差異代謝物數(shù)目排前3的KEGG通路類型分別為代謝途徑、次生代謝物的生物合成和ABC轉(zhuǎn)運蛋白,分別占總數(shù)的75.49%、43.14%和14.71%。如圖6所示,生長期為25 cm的筇竹筍樣本與10 cm的樣本相比,黃酮與黃酮醇的生物合成、半乳糖代謝、α-亞麻酸代謝等通路富集明顯且呈現(xiàn)較明顯的上調(diào)趨勢。植物激素信號轉(zhuǎn)導、苯并噁嗪類生物合成等通路呈現(xiàn)出明顯上調(diào)或下調(diào)趨勢,但富集程度不高。與竹筍木質(zhì)化進程關系密切的苯丙素類的生物合成通路富集程度和上調(diào)趨勢尚不明顯。
圖6 2 個不同生長期筇竹筍樣本差異代謝物KEGG富集圖(A)及 差異豐度得分圖(B)Fig.6 KEGG enrichment map (A) and differential abundance score map (B) of differential metabolites in bamboo shoots at two different growth stages
已有研究結(jié)果表明,竹筍中的黃酮類成分具有抗氧化、降血糖等多種活性功能[27-28]。綜合2 個不同生長期筇竹筍的差異代謝物和代謝通路結(jié)果發(fā)現(xiàn),在生長期為25 cm的筇竹筍樣中,包括槲皮素3-O-新橘皮糖苷、槲皮素3-O-蕓香糖苷(蘆?。?、槲皮素7-O-蕓香糖苷、葒草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷(繡線菊苷)等27 個黃酮類代謝物的相對含量較生長期為10 cm的筇竹筍樣出現(xiàn)顯著增加。圖7顯示了25 cm筇竹筍樣中鑒定出的兩個相對含量最高的黃酮類代謝物:4′-羥基-5,7-二甲基黃酮和槲皮素-3-O-蕓香糖苷(蘆?。?,在總代謝物相對含量分別為0.95%和0.43%。4′-羥基-5,7-二甲基黃酮是典型的二氫黃酮,具有抗晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)的活性功能,AGEs則與多種退行性疾病有關[29],而蘆丁是黃酮醇二糖苷,具有抗氧化和抗糖尿病的活性功能[30-31]。據(jù)此可以分析得出,筇竹筍中含有能夠抗氧化和改善代謝綜合征(糖尿?。┑狞S酮類成分,且具有活性功能的黃酮類成分在25 cm的筇竹筍中較10 cm的含量顯著增加。
圖7 筇竹筍中部分代謝物的結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structures of some metabolites in bamboo shoots
茉莉酸(圖7)是由α-亞麻酸合成的脂類派生植物激素,是植物多個生長發(fā)育過程的關鍵調(diào)節(jié)信號 分子[32],同時可驅(qū)動多個次生代謝產(chǎn)物(包括黃酮類、花青素等)在植物中的積累[33]。在麥草中的一項研究表明,外源茉莉酸還能誘導麥草中的酚類物質(zhì)含量增多,從而增加麥草抗氧化和抗炎的活性功能[34]。在本研究中,2 個不同生長期的筇竹筍樣本都檢測到了茉莉酸這一代謝物,與10 cm樣本相比,生長期為25 cm的筇竹筍樣本中茉莉酸相對含量出現(xiàn)顯著上調(diào)(VIP=1.17、FC=2.35)。同時,代謝途徑結(jié)果(圖6)顯示α-亞麻酸代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導通路出現(xiàn)了富集與上調(diào)。據(jù)此綜合分析推測,筇竹筍生長過程中,茉莉酸由α-亞麻酸經(jīng)生物合成途徑快速富集產(chǎn)生并在筇竹筍生長過程中起到關鍵作用,可能是黃酮類代謝物富集上調(diào)的關鍵調(diào)控因子。能否通過外源性的茉莉酸誘導筇竹筍活性功能成分的增加從而增強筇竹筍活性功能有待進一步的研究探索。
苯并噁嗪類是存在于禾本科植物中的一類次生代謝產(chǎn)物,也是一種重要的化感物質(zhì),具有抗蟲、抗病的防御功能[35]。在本次筇竹筍代謝組學研究中,發(fā)現(xiàn)包括2-羥基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3(2H)-酮、2-羥基-1,4-苯并噁嗪-3(2H)-酮葡萄糖苷等多個苯并噁嗪類生物堿(圖7),代謝組學結(jié)果還顯示,生長期25 cm的筇竹筍樣本相比10 cm樣本,苯并噁嗪類生物合成通路出現(xiàn)下調(diào)(圖6),苯并噁嗪生物堿相對含量下降,呈現(xiàn)出階段特異性,這可能與筇竹筍出筍早期需要更多化感物質(zhì)對抗生物脅迫有關。
筇竹筍是滇東北高原特色農(nóng)產(chǎn)品,也是產(chǎn)區(qū)農(nóng)民重要的經(jīng)濟收入來源。然而,目前在采筍季節(jié),筇竹筍采收的規(guī)格參差不齊,部分地區(qū)采收者甚至會“見筍就打”,這對筇竹資源的可持續(xù)開發(fā)利用十分不利。本研究結(jié)果顯示,相對于生長期為10 cm的筇竹筍,生長期為25 cm筇竹筍中的20 種主要營養(yǎng)成分變化并不顯著,而與口感風味密切相關的有機酸、糖與醇類、鮮甜味氨基酸等代謝物相對含量上升,苦味因子L-苯丙氨酸相對含量下降,與抗氧化和改善代謝綜合征等活性功能密切相關的黃酮類代謝物顯著上升。因此與生長期為10 cm的筇竹筍相比,生長期為25 cm的筇竹筍具有更高的綜合經(jīng)濟價值,可能是更加適合的采收規(guī)格。
運用基于UPLC-MS/MS的廣泛靶向代謝組學對昭通產(chǎn)筇竹筍進行分析。從2 個不同生長期(出土高度分別為10 cm和25 cm)筇竹筍樣本中共鑒定出13 類875 個代謝物,表明筇竹筍是營養(yǎng)成分豐富的食品原料。多元統(tǒng)計分析顯示,2 個不同生長期筇竹筍代謝物存在明顯的階段特異性,生長期為10 cm的筇竹筍與生長期為25 cm的筇竹筍共存在283 個顯著差異代謝物,其中102 個代謝物被注釋到了82 條代謝通路中。通過綜合分析得出,20 種主要營養(yǎng)成分在生長期為10 cm和25 cm的筇竹筍樣本中差異并不顯著,而與口感風味、活性功能有關的代謝物在生長期為25 cm的樣本中相對含量更高,且25 cm筇竹筍樣本中苦味因子相對含量更低。因此與生長期為10 cm的筇竹筍相比,生長期為25 cm的筇竹筍綜合經(jīng)濟價值更高,可能是更加適合的采收規(guī)格。本研究結(jié)果可為筇竹資源的綜合開發(fā)和可持續(xù)利用提供重要的理論參考。