空間異質(zhì)性對大曲微生物群落的影響

唐慧芳，黃 鈞，周榮清,2,*，秦 輝，張宿義，董 異，王 超，王小軍，母 雨，潘強(qiáng)林

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

大曲在我國傳統(tǒng)白酒的生產(chǎn)中具有重要作用，一直都是行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。大曲是由未滅菌大麥、小麥或豌豆等原料在開放的環(huán)境中，籍以源于兩者的微生物群落，在驅(qū)動因素的脅迫作用下，形成包含功能菌群、粗酶制劑、揮發(fā)性物質(zhì)及前體代謝成分等頗具特色的必需釀酒原料之一[1-5]。這些驅(qū)動因子包括環(huán)境溫度、濕度、曲心溫度、水分含量和酸度。后三者可通過適度調(diào)節(jié)前二者進(jìn)行調(diào)控[6]，因此將前兩者視為環(huán)境因子，后三者視為內(nèi)生因子。這些驅(qū)動因子調(diào)控曲坯微生態(tài)體系中種（株）間互作關(guān)系、營養(yǎng)網(wǎng)絡(luò)等成為影響大曲屬性的主要因素[5]。

因所使用原料及發(fā)酵過程峰值溫度的差異，可將大曲分為3 種不同的類型，峰值溫度在62～65、60～62 ℃及50 ℃左右的分別是高溫、中高溫和低溫大曲，這些大曲分別用于醬香型、濃香型和清香型白酒的生產(chǎn)[7-8]。高溫大曲以Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Bacillus、Weissella和Lactobacillus為主要優(yōu)勢細(xì)菌屬，真菌則以Thermoascus、Thermomyces和Aspergillus為主[9]。中溫大曲優(yōu)勢真菌屬主要包括Issatchenkia、Thermoascus、Trichocladium、Aspergillus、Rhizopus和Rhizomucor，優(yōu)勢細(xì)菌屬為Weissella和Lactobacillus[10]。低溫大曲中優(yōu)勢細(xì)菌屬包括Bacillus和Lactobacillus，優(yōu)勢真菌屬包括Rhizopus和Saccharomyces[11]。

近年來，基于功能菌株（群）強(qiáng)化大曲發(fā)酵是改善品質(zhì)的熱門研究方向之一，且已取得良好結(jié)果。如Wang Peng等[12]接種了Bacillus licheniformis，既改善了大曲風(fēng)味特征，又提高了淀粉水解酶活力。He Guiqiang等[13]接種B.velezensis和B.subtilis顯著提高了淀粉水解力和酯化力，也提高了酯類、吡嗪類和醇類等特征成分含量。宇宙射線誘變是一種獨(dú)特育種手段，具有效率高、突變范圍寬、周期短等特點(diǎn)，應(yīng)用于釀酒微生物菌種的選育具有廣闊前景[14]。

本研究以接種太空誘變曲擴(kuò)培的強(qiáng)化大曲為對象，探討在大型曲房中心位置8 層貨架式曲架的上、中、下層曲（分別為第1～3、4～5、6～8層）在主發(fā)酵期中理化性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢，研究驅(qū)動因子對群落多樣性的影響規(guī)律。旨在揭示多層發(fā)酵房驅(qū)動因子與大曲群落的相關(guān)性，為大曲生產(chǎn)過程的自動化調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品取自四川瀘州著名釀酒企業(yè)制曲中心。

化學(xué)試劑均為分析純，購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix、ITS1/ITS4引物、DNase/RNase-free Deionized Water、真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL 16M高速冷凍離心機(jī) 湘麓離心機(jī)儀器公司；S100TMThermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel DocTMXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TU-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海 雙捷實驗設(shè)備有限公司；TES1360A溫濕度測試儀 泰仕電子工業(yè)股份有限公司；TP3001電子探針溫度計 天津凱士達(dá)儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與收集

生產(chǎn)流程及設(shè)施簡圖如圖1所示。

圖1 架子曲生產(chǎn)流程（A）與曲房布局（B）Fig.1 Flow chart of the production process of Daqu (A) and layout of Daqu fermentation room (B)

大曲生產(chǎn)是接種1%（m/m）的母曲，按照DB 5105/T 36—2020《地理標(biāo)志產(chǎn)品 瀘州老窖系列曲藥（久香牌）生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》[15]和Zheng Xiaowei等[16]所述過程及參數(shù)控制進(jìn)行。母曲是搭載在神州11號太空艙并在太空誘變1 個月曲粉逐級擴(kuò)大的陳曲。翻曲是為了通風(fēng)散熱，調(diào)節(jié)曲塊水分，為曲坯發(fā)酵提供適宜的溫、濕度環(huán)境[17]，架子曲以空氣導(dǎo)流調(diào)控裝置調(diào)節(jié)室內(nèi)溫、濕度與大曲曲心溫度，模擬人工翻曲，實現(xiàn)無翻曲的生產(chǎn)工藝。

取樣：分別從曲房中心曲架的上、中、下層隨機(jī)取2 塊大曲，粉碎混勻后堆積成錐型，分別從曲粉堆的四周與中心點(diǎn)5 點(diǎn)共取樣300 g，再次混勻后分為兩份，其中一份280 g置于4 ℃保藏用于理化檢測，另一份20 g則置于-80 ℃保藏用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。樣品名稱及相應(yīng)信息如表1所示。

表1 取樣點(diǎn)的信息及編號Table 1 Information and codes of sampling sites

1.3.2 微生物群落組成檢測

總DNA提取：使用Fast DNA SPIN kit，按照供應(yīng)商提供操作程序提取后，分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop ND-1000分光光度計檢測其純度和含量。分別使用引物338F/806R和ITS5/ITS1 PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA V3～V4區(qū)和真菌的ITS1區(qū)域。擴(kuò)增體系25 μL：5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL，0.25 μL DNA聚合酶（5 U/μL，Q5 High-Fidelity），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），正反引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。細(xì)菌擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)熱2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過25 個循環(huán)，最后72 ℃保持5 min。真菌擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，經(jīng)32 個循環(huán)，最后72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的片段純化回收。純化樣品后委托派森諾生物科技有限公司在Illumina NovaSeq平臺完成DNA片段進(jìn)行雙端（Paired-end，2×300）測序。

DADA2序列去噪：首先調(diào)用QIIME切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體獲得擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variants，ASV）。接著通過Greengenes/UNITE數(shù)據(jù)庫，將ASV特征序列與數(shù)據(jù)庫中的參考序列相比對，獲取每個ASV所對應(yīng)的分類學(xué)信息，去噪后，合并ASV特征序列和ASV表格，并去除singletons ASV。

1.3.3 理化性質(zhì)的檢測

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[18]所述方法和步驟測定水分、酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力和酯化力。環(huán)境溫度與濕度使用溫濕度測試儀測定，曲心溫度使用電子探針溫度計測定。所有實驗均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用OriginPro 2022對驅(qū)動因子以及大曲酶特性進(jìn)行可視化。使用派森諾基因云平臺（https://www.genescloud.cn/home）對微生物群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、冗余分析（redundancy analysis，RDA）以及基于average的層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）。使用基迪奧生信云平臺（https://www.omicshare.com/tools/home/task/index.html）和圖圖云平臺（https://www.cloudtutu.com/#/login）對驅(qū)動因子和優(yōu)勢微生物屬（相對豐度＞1%）分別進(jìn)行普氏分析與Mantel檢驗。使用IBM SPSS Statistics 25軟件對優(yōu)勢微生物屬通過Spearman算法（r＞0.70，P＜0.05）構(gòu)建共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)Cytoscape可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程空間異質(zhì)性驅(qū)動因子的變化趨勢

如圖2所示，上、中、下三層大曲的水分含量逐步降低，到10 d均降低至15%以下，達(dá)到轉(zhuǎn)房標(biāo)準(zhǔn)[19]。不同層次環(huán)境溫度、濕度及大曲曲心溫度的變化趨勢類似。發(fā)酵起始2 d后，因菌群繁殖與代謝釋放大量熱，曲坯的水分大量散發(fā)[20]，曲房濕度陡增，熱量跟隨水蒸氣上升，導(dǎo)致下層溫度、濕度低于上、中層。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，中、下層大曲的曲心溫度略高于上層大曲，可能與環(huán)境溫、濕度和微生物群落組成有關(guān)。發(fā)酵初期，曲坯水分、溫度適合產(chǎn)酸微生物繁殖，所以大曲酸度陡升[21]，尤其是上層曲坯酸度高達(dá)1.7 mmol/10 g，隨后又下降直至達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)。同期上層曲坯的酸度略高于中、下層曲，可能與上層大曲高溫、高濕環(huán)境的周期更長，從而產(chǎn)酸更多有關(guān)[22]。

圖2 驅(qū)動因子的變化趨勢Fig.2 Changes in driving factors during fermentation

2.2 發(fā)酵過程酶活力的變化

由圖3A可知，發(fā)酵前2 d，各層樣品均未檢出液化力。第3天時略升，第8天時上層、中層液化力趨于穩(wěn)定。下層曲的液化力8 d后速增，可能是下層溫度偏低，菌群生長緩慢，高濕度環(huán)境更適合霉菌生長所致。3 個不同層次大曲的糖化力變化趨勢相同，但強(qiáng)度不同（圖3B）。糖化酶活力起伏振蕩波動后在6 d后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢，類似邢鋼等[23]報道的結(jié)果。這是原料所含內(nèi)源酶被激活、后遇高溫失活，同時因微生物菌群分泌糖化酶隨生物量增高而提高，并伴隨高溫和酸脅迫影響的綜合結(jié)果。類似前述的不同層次間溫度變化趨勢，糖化力也是上層曲的波動程度最大，下層曲的波動最小。且下層曲糖化力明顯高于中層和上層曲，可能與下層前期溫度低且升溫緩、濕度適宜密切相關(guān)。

圖3 發(fā)酵過程中不同層次大曲酶活力的變化趨勢Fig.3 Changes in enzymatic activities in different layers of Daqu during fermentation

上、中、下三層曲的發(fā)酵力也類似陳曉茹等[24]報道的結(jié)果，顯著降后陡然升，又降低至趨于平穩(wěn)的趨勢（圖3C），與酸度的變化趨勢相反（圖1）。發(fā)酵力表征的是大曲中的酶利用糖轉(zhuǎn)化為CO2與乙醇的能力，與酵母菌的活力密切相關(guān)[23]。發(fā)酵力的變化趨勢類似溫度。而酯化力的變化趨勢則與液化力類似（圖3D）。酯化力同樣與霉菌和酵母的繁殖代謝密切相關(guān)[25-27]，霉菌和酵母發(fā)酵前期生長較為緩慢，隨后生長旺盛[27]，酯化力則陡增，隨后趨于穩(wěn)定，且在發(fā)酵后期，上、下層樣品的酯化酶活力顯著高于中層大曲。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)的差異

樣品中檢出真菌和細(xì)菌有效序列分別是53111～88490和67181～115456，其高質(zhì)量序列是52943～88244和45465～101691。3 層大曲微生物群落的α多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)波動增加的趨勢（圖4）。上層、下層大曲細(xì)菌的α多樣性指數(shù)均在8 d達(dá)到頂峰，中層則是在6 d，且明顯低于上、中層樣品。3 層大曲真菌的α多樣性指數(shù)波動相似，僅上層第8天樣品有差異。

圖4 不同層次對微生物群落α多樣性的影響Fig.4 Effects of different layers on the α-diversity of microbial communities in Daqu

微生物群落主要由Firmicutes和Proteobacteria 2 個細(xì)菌門及Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota 3 個真菌門組成，包括56 個細(xì)菌屬和59 個真菌屬，平均相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬包括Lactobacillus、Weissella、Bacillus、Kosakonia、Staphylococcus、Thermoactinomyces等12 個細(xì)菌屬（圖5A）和Pichia、Thermoascus、Rhizomucor等7 個真菌屬（圖6A）。不同空間位置環(huán)境溫度、濕度等參數(shù)及其變化顯著影響生產(chǎn)過程曲坯的微生物多樣性和豐富度[21]。如中層和下層的Firmicutes相對豐度始終在85.16%～99.03%之間，上層曲則是前5 d都是Firmicutes占絕對優(yōu)勢，而從6 d起，Proteobacteria豐度陡增，占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖6 不同層次對真菌群落結(jié)構(gòu)和組成的影響Fig.6 Structure and composition of fungal community in different layers of Daqu

如圖5A所示，整個過程中，Weissella和Lactobacillus在發(fā)酵過程中的相對豐度交替變化，如0 d 曲坯中Weissella相對豐度高達(dá)81.77%，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，其在各層曲的豐度迅速降低至2%后逐漸增高，然后又降至約1%，類似Zhu Min等[28]報道的結(jié)果。Lactobacillus經(jīng)1 d發(fā)酵就達(dá)到峰值，上、中層曲中相對豐度分別是92.44%和90.08%，隨之漸降，8 d降至1%以下，而下層在4 d才達(dá)到峰值（約為70%），結(jié)束時降至42.89%。這些趨勢同發(fā)酵過程中酸度增高，水分逐步降低，適合Lactobacillus繁殖密切相關(guān)[28]。0 d曲坯中Bacillus相對豐 度低于1%，發(fā)酵前期，除1 d下層樣品外，中層和上層相對豐度都在1%左右，在發(fā)酵后期相對豐度提升，因為Bacillus可產(chǎn)耐熱芽孢，可以承受高達(dá)60～62 ℃高溫[29]，故在發(fā)酵8 d中、下層曲中豐度分別達(dá)到了57.53%、39.39%，在上層曲中雖不占主導(dǎo)，但也穩(wěn)定在10%左右。

初始曲坯中，Kosakonia相對豐度僅為8.24%，空間位置顯著影響其相對豐度，主發(fā)酵結(jié)束時，上、中、下層曲相對豐度分別為30%、2.19%和5.38%。Staphylococcus在發(fā)酵過程中最高相對豐度分別達(dá)5.18%、15.79%、9.75%。類似地，在發(fā)酵結(jié)束時中層和下層曲中Thermoactinomyces相對豐度分別是27.84%和8.96%，而Pantoea和Kroppenstedtia僅在上層和中層分別約為20%和22%，在其余層次中的相對豐度則小于1%，是非優(yōu)勢屬。

細(xì)菌群落基于Bray-Curtis距離的PCoA結(jié)果表明，大曲微生物群落時空特征差異顯著（圖5B）。具體地，0 d樣品獨(dú)聚一簇，上層曲1～5 d和6～10 d兩個階段成簇，且相距較遠(yuǎn)，表明群落結(jié)構(gòu)差異顯著。中層和下層曲均聚類成3 簇，前者是1～5、6 d和8～10 d分別成簇，前兩簇距離較近；下層則是8 d和10 d分別單獨(dú)成簇，兩者距離較遠(yuǎn)，1～6 d結(jié)構(gòu)相似且距離緊密。發(fā)酵前5 d的3 層曲細(xì)菌群落各自聚類在同簇，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，空間位置則顯著影響群落結(jié)構(gòu)，聚類距離趨遠(yuǎn)。這些結(jié)果也被HCA驗證，顯示出與PCoA相似的群集模式（圖5C）。

Pichia、Thermoascus、Rhizomucor等7 個屬為優(yōu)勢菌（圖6A）。整個主發(fā)酵期間，Ascomycota始終占優(yōu)勢，其相對豐度最高可達(dá)99.93%。起始時（0 d），Pichia相對豐度高達(dá)99.38%，前5 d的3 個層次大曲Pichia相對豐度都維持在96.70%～99.82%之間。6 d后，上層和中層曲中Pichia相對豐度便逐步下降，而下層曲直到8 d，Pichia相對豐度仍高達(dá)97.40%，10 d才降至68.88%。后期，中層曲Pichia相對豐度較下層曲低，但仍在60%以上；上層曲則降至10.76%。在上、中層和下層大曲分別經(jīng)6 d和8 d的發(fā)酵后，Thermoascus、Rhizomucor與Rhizopus都成為優(yōu)勢菌。上層曲因中后期溫度較高，環(huán)境濕度和曲坯水分顯著降低，抑制酵母菌和霉菌等熱敏真菌繁殖[21,30]，所以Thermoascus[10]和Thermomyces[31]等嗜熱真菌[32]變?yōu)閮?yōu)勢菌，與Xiao Chen等[30]報道的結(jié)果相符。

基于真菌多樣性的PCoA和HCA都表明（圖6B、C），發(fā)酵前期曲坯的真菌群落結(jié)構(gòu)均相似，上層和中層發(fā)酵0～5 d曲坯聚類成簇、下層則是0～8 d聚集一簇，6～8 d中層曲聚類成另一簇，上、中、下3 層發(fā)酵10 d曲坯單獨(dú)成簇。

2.4 變量對群落結(jié)構(gòu)的驅(qū)動作用

使用普氏分析與Mantel檢驗研究驅(qū)動因子對微生物群落演替的貢獻(xiàn)（圖7）。普氏分析表明驅(qū)動因子對細(xì)菌群落的貢獻(xiàn)顯著，而對真菌貢獻(xiàn)不顯著。Mantel檢驗顯示曲坯水分含量與環(huán)境濕度顯著影響上層曲坯的微生物組成，而酸度與曲心溫度則次之。同時，水分含量與酸度均顯著影響中層曲坯的微生物群落，環(huán)境濕度對其真菌組成影響較細(xì)菌群落大。而在下層大曲中，水分含量對細(xì)菌和真菌均有顯著影響，而酸度僅對細(xì)菌群落影響顯著。結(jié)合普氏分析與Mantel檢驗的結(jié)果表明，驅(qū)動因子對細(xì)菌群落的貢獻(xiàn)更顯著。

圖7 微生物群落與環(huán)境因子間的普氏分析（A、B）和 Mantel檢驗（C～E）Fig.7 Procrustes analysis (A,B) and Mantel test (C–E) between microbial communities and driving factors

通過方差分解分析（variance partitioning analysis，VPA）辨析內(nèi)生因子與環(huán)境因子對微生物群落的影響強(qiáng)度，如表2所示。驅(qū)動因子對上層大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，中層次之，而下層大曲細(xì)菌結(jié)構(gòu)僅受內(nèi)生因子的顯著影響；僅中層大曲真菌群落受驅(qū)動因子顯著影響。另外，在上層曲中，內(nèi)生因子對真菌群落影響強(qiáng)于細(xì)菌，而環(huán)境因子僅對細(xì)菌群落影響顯著。在中層大曲中，驅(qū)動因子對真菌和細(xì)菌群落的貢獻(xiàn)度相同，其中內(nèi)生因子的貢獻(xiàn)度略大于環(huán)境因子。而在下層大曲中僅內(nèi)生因子對微生物群落貢獻(xiàn)顯著，且對細(xì)菌和真菌群落的貢獻(xiàn)度相同。其結(jié)果與普氏分析和Mantel檢驗一致。

表2 驅(qū)動因子與微生物的VPATable 2 VPA between driving factors and microbial communities

使用RDA明確驅(qū)動因子與具體優(yōu)勢菌屬的相關(guān)性。如圖8所示，水分和酸度均與Lactobacillus和Pichia呈正相關(guān)。而酸度與Bacillus和Rhizopus等呈負(fù)相關(guān)，不同于Zhu Min等[28]的研究，可能與其優(yōu)勢微生物相對豐度以及生產(chǎn)工藝不同有關(guān)。上層曲心溫度和室溫呈負(fù)相關(guān)，而在中、下層兩者呈強(qiáng)正相關(guān)，這可能由上、中、下層空氣流動程度不同等條件差異導(dǎo)致。在上層大曲中，曲心溫度與Pantoea、Bacillus、Kosakonia、Staphylococcus、Rhizomucor、Thermoascus等呈正相關(guān)。中層大曲曲心溫度與Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Scopulibacillus、Kosakonia、Pantoea等呈正相關(guān)，下層大曲曲心溫度Pichia、Thermomyces、Rhizomucor、Thermoascus等呈正相關(guān)。這些結(jié)果很好證明了Bacillus、Rhizomucor、Thermoascus、Thermomyces等耐高溫能力強(qiáng)[30,33]。

圖8 微生物群落與驅(qū)動因子間的RDAFig.8 RDA between microbial communities and driving factors

2.5 微生物間相關(guān)性

如圖9所示，在上層大曲中存在81 對互作關(guān)系，其中53 對為正相關(guān)；在中層大曲與下層大曲中分別存在55 對和43 對互作關(guān)系，其中正相關(guān)關(guān)系分別為35 對和36 對。上、中、下層大曲中共享的僅有10 對關(guān)系，包括Lactobacillus與Acinetobacter、Rhizomucor這兩對負(fù)相關(guān)，以及Bacillus與Acinetobacter、Thermoascus、Rhizomucor，Enterobacter與Kosakonia、Pantoea，Pantoea與Kosakonia，Rhizomucor與Thermoascus、Rhizopus這8 對正相關(guān)。Lactobacillus與Rhizomucor呈負(fù)相關(guān)可能是因為乳桿菌生產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)，高酸度環(huán)境不利于Rhizomucor這類不耐酸菌屬生長[34]，在前期Lactobacillus相對豐度高，抑制了Rhizomucor繁殖，后期Lactobacillus相對豐度降低，酸度也下降，提高了Rhizomucor的豐度。Bacillus和Thermoascus呈正相關(guān)可能與它們都是耐熱菌有關(guān)[4,30]。除此之外，8 對相同的關(guān)系在上層和中層曲中，上層與下層大曲和中層與下層大曲中分別存在18 對和5 對相同的關(guān)系。綜上所述，不同層次大曲微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著的同時，微生物間的共生共斥關(guān)系亦不同，表明不同層次間驅(qū)動因素的差異可能也導(dǎo)致微生物間的互作關(guān)系發(fā)生改變，從而共同促進(jìn)大曲群落形成。

圖9 微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)在不同層次間的差異Fig.9 Differences in microbial co-occurrence networks among different layers of Daqu

3 結(jié)論

以多層貨架式工藝生產(chǎn)的主發(fā)酵期上、中、下3 層大曲為對象，探討了其驅(qū)動因子和酶活力的變化過程，以及驅(qū)動因子對大曲微生物群落的貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，3 層曲的水分均在10 d內(nèi)逐步降低至15%以下，達(dá)到轉(zhuǎn)房標(biāo)準(zhǔn)。不同層間環(huán)境溫度、濕度及曲心溫度的變化程度不同，但波動趨勢相同。同期的上層曲坯酸度略高于中層和下層，酶活力則反之。在大曲微生態(tài)體系中，微生物群落的時空性特征顯著，尤其是發(fā)酵中后期，PCoA和HCA也揭示了其規(guī)律性。VPA、普氏分析和Mantel檢驗都表明，驅(qū)動因子顯著影響細(xì)菌群落組成，但不同驅(qū)動因子對不同層次大曲的影響程度不同。具體地，驅(qū)動因子均顯著影響上、中層曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，而下層曲僅受內(nèi)生因子的影響顯著。另外，內(nèi)生因子對上層曲的真菌群落貢獻(xiàn)強(qiáng)于細(xì)菌，而在中、下層曲中貢獻(xiàn)度相同。環(huán)境因子僅對上層細(xì)菌群落和中層微生物群落具有顯著影響。其中，水分和酸度均與Lactobacillus和Pichia呈正相關(guān)，但不同層次驅(qū)動因子間相關(guān)性不同。同時，不同層次大曲中微生物間相互作用也有差異。綜上，多層貨架式工藝生產(chǎn)大曲過程中，不同層次間大曲酶特性及群落結(jié)構(gòu)的差異與驅(qū)動因子顯著相關(guān)，可通過調(diào)控發(fā)酵過程中驅(qū)動因子從而對大曲質(zhì)量進(jìn)行調(diào)控，這為大曲的智能制造提供了科學(xué)依據(jù)。