自然發(fā)酵與接種發(fā)酵“戶太8號”葡萄酒品質(zhì)及真菌微生物多樣性分析

文 栩，王志磊，袁佳璐，線芷晨，袁春龍,2,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒實驗示范站，寧夏 永寧 750104）

“戶太8號”葡萄屬于歐美雜交種，由陜西西安葡萄研究所選育而得，是陜西主栽葡萄品種之一。近年來，陜西“戶太8號”葡萄的種植面積與產(chǎn)量逐年增長，存在成熟期集中及季節(jié)性相對過剩等問題，影響了“戶太 8號”葡萄種植的經(jīng)濟(jì)效益。“戶太8號”作為鮮食葡萄，并不常用來釀酒，梁艷英等[1]以“戶太8號”作為原料釀造冰酒，但涉及到真菌微生物多樣性方面的發(fā)酵研究很少。使用“戶太8號”葡萄釀酒既可以避免因滯銷及雨熱同季氣候造成的腐爛浪費，又可以增加產(chǎn)品附加值，提高果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。

葡萄酒的發(fā)酵主要有兩種方式：一種是釀造過程中不人為添加商業(yè)酵母、SO2等輔料，依靠葡萄攜帶的本土微生物進(jìn)行發(fā)酵的自然發(fā)酵；以及接種活性酵母進(jìn)行發(fā)酵的控制性發(fā)酵方式。自然發(fā)酵能夠產(chǎn)生具有地域特色的風(fēng)味復(fù)雜的特色葡萄酒，展現(xiàn)葡萄酒的地域風(fēng)格[2]。同時，自然發(fā)酵也會給釀造過程帶來不可預(yù)測的風(fēng)險[3]，且不同的栽培管理方式也會對葡萄酒真菌菌落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[4]。近年來，國內(nèi)外對自然發(fā)酵葡萄酒的研究越來 越多[5]。且研究方向主要集中于揮發(fā)性香氣物質(zhì)[6-7]與真菌菌落組成的關(guān)系[8]。葡萄酒有機(jī)酸通常隨著釀造過程中從葡萄轉(zhuǎn)移至葡萄酒中，其種類、濃度都與葡萄酒品質(zhì)有著很大關(guān)系[9]。本研究以“戶太8號”葡萄為原料，使用自然發(fā)酵與接種發(fā)酵兩種方式進(jìn)行葡萄酒釀造，研究兩種發(fā)酵方式“戶太8號”葡萄酒中基本理化指標(biāo)、有機(jī)酸成分、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和真菌微生物多樣性的變化，深入研究“戶太8號”發(fā)酵過程中真菌微生物多樣性變化與葡萄酒品質(zhì)的相關(guān)性，旨在為“戶太8號”葡萄酒發(fā)酵方式選擇及風(fēng)味改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄品種“戶太8號”，采自陜西西安鄠邑區(qū)崔家灣村（東經(jīng)108.6°，北緯34.1°），采收時間為2020年 10月，原料含糖量170 g/L，可滴定酸3.60 g/L（以酒石 酸計）。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014C氣相色譜儀 日本島津公司；1260 infinity II高效液相色譜儀 德國安捷倫公司；IQ7000超純水機(jī) 密理博中國有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方法

采用小容器釀造法進(jìn)行葡萄酒的發(fā)酵。將“戶太8 號” 葡萄除梗破碎，并調(diào)整葡萄醪糖質(zhì)量濃度為216 g/ L，分裝于5 L發(fā)酵罐中分別用于自然發(fā)酵和接種酵母。發(fā)酵罐提前進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，每組用3 個發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。自然發(fā)酵組（記為ZF）：直接進(jìn)行發(fā)酵；接種發(fā)酵組（記為SF）直投接種200 mg/L的商業(yè)酵母（釀酒酵母SY，安琪酵母股份有限公司）進(jìn)行發(fā)酵。預(yù)實驗表明，發(fā)酵溫度為20 ℃的葡萄酒表現(xiàn)出良好品質(zhì)，因此確定發(fā)酵溫度為20 ℃。

每天測定葡萄酒基本理化指標(biāo)以監(jiān)測葡萄酒發(fā)酵過程。并在兩種發(fā)酵方式的除梗破碎階段、發(fā)酵初期（葡萄醪中糖含量剛開始明顯降低）、發(fā)酵中期（葡萄醪中糖含量變?yōu)樵瓉淼囊话耄l(fā)酵末期（葡萄醪中糖質(zhì)量濃度＜4 g/L）進(jìn)行取樣。分別記除梗破碎階段、發(fā)酵初期、發(fā)酵中期、發(fā)酵末期為發(fā)酵0、1、2、3階段，自然發(fā)酵葡萄酒在1、2、3階段的取樣分別記為Z1、Z2、Z3，接種酵母葡萄酒在1、2、3階段的取樣分別記為S1、S2、S3。由于在除梗破碎階段兩種發(fā)酵方式未進(jìn)行差異化處理，因此統(tǒng)一計為Z0。

取樣前先將每個發(fā)酵罐中的發(fā)酵液攪拌混勻，后從發(fā)酵罐上中下3 個不同位置取15 mL酒樣裝入離心管立刻用液氮冷凍，并貯存于超低溫冰箱中（-80 ℃）用于有機(jī)酸含量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及真菌多樣性測定。

1.3.2 發(fā)酵過程中葡萄酒樣品的高通量測序

葡萄酒發(fā)酵過程中真菌微生物的高通量測序工作委托深圳華大基因股份有限公司完成。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對應(yīng)的融合引物配制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系，設(shè)置PCR參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺進(jìn)行測序。

下機(jī)數(shù)據(jù)過濾，剩余高質(zhì)量的clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；將tags聚類成可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）并與數(shù)據(jù)庫比對、物種注釋；基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析，以及關(guān)聯(lián)分析與模型預(yù)測等。

序列拼接使用軟件FLASH（v1.3.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的tags。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的tags聚類為OTU。

1.3.3 葡萄酒基本理化指標(biāo)測定

指標(biāo)測定基于王華[10]方法，葡萄酒中還原糖含量采用菲林試劑熱滴定法測定；可滴定酸采用酸堿滴定法測定；pH值使用pH計進(jìn)行檢測；可溶性固形物采用手持糖量計進(jìn)行測定；乙醇體積分?jǐn)?shù)采用SBA-40C生物傳感器測定。所有指標(biāo)均重復(fù)測定3 次。

1.3.4 發(fā)酵過程中葡萄酒有機(jī)酸的測定

使用高效液相色譜法。取一定量發(fā)酵液，加入離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液用超純水稀釋至2 倍，過0.22 μm濾膜，并收集濾液進(jìn)行分析。

色譜柱：BIO-RAD Aminex HPX-87H（300 mm× 7.8 mm）；色譜柱溫55 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；紫外檢測器；檢測波長215 nm。流動相：5 mmol/L硫酸溶液。

1.3.5 發(fā)酵過程中葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜對發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定[11]，每個樣品重復(fù)測定3 次。

固相微萃?。簩⒋郎y發(fā)酵液10000 r/min離心5 min，取2 mL上清液加入20 mL頂空瓶中，用超純水將發(fā)酵液稀釋4 倍，加入2 g NaCl，再加入40 μg/L 2-辛醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，擰緊瓶蓋，于40 ℃磁力攪拌15 min，然后插入已活化或解析過的萃取頭，于40 ℃攪拌30 min，待揮發(fā)性物質(zhì)在三相（頂空、萃取頭和液體部分）中分布達(dá)到平衡，取下萃取頭，立即送至氣相色譜進(jìn)樣口，230 ℃熱解吸5 min。

色譜條件：載氣為高純度氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min；溫度控制程序為：先升溫至40 ℃并持續(xù)5 min，再以2 ℃/min速率升至130 ℃，隨后以5 ℃/min 速率升至220 ℃并持續(xù)10 min。質(zhì)譜條件：采用不分流模式進(jìn)行，電子電離源；全掃描模式，掃描范圍35～350 u；離子源溫度為200 ℃；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；電子能量為70 eV；連接桿溫度為220 ℃。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性及相對定量：通過與標(biāo)準(zhǔn)品在相同檢測條件下的保留時間、質(zhì)譜圖特征離子對比，結(jié)合NIST 2017質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定性，并通過內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行相對定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Mircosoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；IBM SPSS Statistics 26、The Unscramber X 10.4軟件進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析；Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種發(fā)酵方式葡萄酒基本理化指標(biāo)

如表1所示，兩組均可以正常完成乙醇發(fā)酵（總 糖＜4 g/L），達(dá)到干型酒的標(biāo)準(zhǔn)。然而自然發(fā)酵組發(fā)酵時間為15 d，遠(yuǎn)高于接種酵母組（發(fā)酵時間為7 d）。自然發(fā)酵組酒樣可滴定酸含量高于接種酵母組，pH值低于接種酵母組。此外，接種酵母組酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.17%，接近潛在酒度12%，然而自然發(fā)酵組酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)為8.33%，表明自然發(fā)酵乙醇發(fā)酵速率及乙醇轉(zhuǎn)化效率均比接種發(fā)酵低。兩組酒樣可溶性固形物含量無顯著差異。

表1 兩種發(fā)酵方式葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 1 Major physicochemical indexes of wine from natural and inoculated fermentation

2.2 兩種發(fā)酵方式的有機(jī)酸含量

葡萄酒中的有機(jī)酸按其來源主要可分為兩大類，一類是來源于葡萄漿果，如蘋果酸、檸檬酸、酒石酸 等[12-13]；一類來源于酵母或細(xì)菌的代謝，如琥珀酸、乳酸和乙酸等[14]。這些有機(jī)酸的含量與組成決定葡萄酒的酸度，對葡萄酒的口感也存在重要影響[15]。由圖1a可知，采用兩種發(fā)酵方式進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵的過程中，兩組檸檬酸含量均呈現(xiàn)出下降趨勢。接種酵母組在除梗破碎階段及發(fā)酵初期兩個階段檸檬酸含量下降速率較快，而自然發(fā)酵組則在下個階段內(nèi)檸檬酸含量下降速度快（即發(fā)酵初期及中期）。發(fā)酵中期后兩組檸檬酸含量無顯著差異。由于接種發(fā)酵組中釀酒酵母是優(yōu)勢菌種，發(fā)酵過程旺盛，在發(fā)酵初始階段糖可能無法滿足酵母的需要，而檸檬酸作為碳源迅速被微生物代謝，致使檸檬酸含量下降[16]。

圖1 兩種發(fā)酵方式有機(jī)酸含量的變化Fig.1 Changes in organic acid contents in wine during natural and inoculated fermentation

酒石酸作為葡萄和葡萄酒的主要成分對葡萄酒品質(zhì)可產(chǎn)生較大影響。一些乳酸菌也可以代謝酒石酸，生成乳酸和乙酸[17]。由圖1b可知，在發(fā)酵過程中，酒石酸含量逐漸降低，且在兩種發(fā)酵方式的相同階段含量無顯著差異，變化趨勢相似。發(fā)酵末期接種酵母組酒石酸含量相對較高，而自然發(fā)酵組酒石酸含量較低，可能是自然發(fā)酵過程中的雜菌導(dǎo)致酒石酸被分解。

蘋果酸是果汁最重要的組成成分之一，酸性較強(qiáng)，具特殊香氣。但當(dāng)其含量較高的時候，會給口腔帶來刺激感。由圖1c可知，待發(fā)酵結(jié)束時，兩組蘋果酸含量相近。

乳酸是葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，口感柔和，可用于改善葡萄酒的結(jié)構(gòu)感。由圖1d可知，在除梗破碎階段，葡萄醪中未檢測出乳酸。其中自然發(fā)酵組在發(fā)酵初期乳酸大量生成，而接種酵母組乳酸生成量較少。接種酵母組由于添加了商業(yè)酵母，其快速生長抑制了乳酸的代謝活動菌，如酒酒球菌和乳酸桿菌[18]，同時，較高水平的乳酸不會給葡萄酒產(chǎn)生較大問題[19]。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時，自然發(fā)酵組相較于接種酵母組乳酸含量增加，但蘋果酸含量無明顯差別，可能是因為存在蘋果酸回補(bǔ)代謝途徑，將丙酮酸或其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為蘋果酸。

琥珀酸是一種口感較復(fù)雜的有機(jī)酸，其來源為酵母菌代謝以及谷氨酸轉(zhuǎn)化，琥珀酸的含量對葡萄酒口感具有很大影響。由圖1e可知，在葡萄酒發(fā)酵過程中，兩組酒樣琥珀酸的含量逐漸增加，接種發(fā)酵組琥珀酸的增加較為平穩(wěn)，而自然發(fā)酵組則是在發(fā)酵初期及發(fā)酵中期琥珀酸含量有顯著增幅。發(fā)酵中期及發(fā)酵末期，兩種發(fā)酵方式酒樣中琥珀酸含量相似。推測由于發(fā)酵初期接種酵母組的酵母菌相較于自然發(fā)酵組活躍，因此葡萄酒中琥珀酸產(chǎn)生量大于自然發(fā)酵組。

少量乙酸可豐富葡萄酒的口感，含量過高則會產(chǎn)生不愉快的氣味。從圖1f可以看出，發(fā)酵過程中自然發(fā)酵組乙酸含量逐漸增加，而接種酵母組酒樣中乙酸含量先有少許降低，后略微增加，發(fā)酵末期乙酸含量是自然發(fā)酵組乙酸含量的48.48%。葡萄酒中理想的乙酸質(zhì)量濃度約為0.1～0.3 g/L?？梢钥闯觯匀话l(fā)酵葡萄酒中的乙酸質(zhì)量濃度較高（0.66 mg/L），表明自然發(fā)酵在發(fā)酵過程中存在破敗風(fēng)險，但未超過GB/T 15037—2006《葡萄酒》的規(guī)定。

2.3 兩種發(fā)酵方式揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

如表2所示，共計檢測得到52 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括酯、醇、醛、酮、脂肪酸及其他六大類化合物。其中酯類和醇類是葡萄酒中最主要的風(fēng)味物質(zhì)，酯類25 種，占比48.08%；醇類17 種，占比32.69%；醛類5 種，占比9.6%；酮類和酸類各2 種，占比3.84%。

表2 7 個樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類Table 2 Changes in types of volatile flavor substances during natural and inoculated wine fermentation

由表2可知，在除梗破碎階段，葡萄醪中存在22 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中青葉醛和苯乙醛為這個階段葡萄醪中獨有，發(fā)酵開始后消失。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類逐漸增多。自然發(fā)酵組在發(fā)酵末期存在33 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類16 種，醇類13 種。自然發(fā)酵組發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有8 種，分別為異戊酸乙酯、甲酸丁酯、乙酸庚酯、2-羥基丁酸乙酯、3-羥基十八烷酸甲酯、十四酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、十一烯醇。接種酵母組在發(fā)酵末期存在41 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類22 種、醇類14 種。接種酵母組發(fā)酵過程中產(chǎn)生的特有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有2 種，分別為丙酸乙酯和順-3-壬烯-1-醇。

如圖2所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)開始積累。在發(fā)酵初期，兩組酒樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量相近，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)也較為相似；發(fā)酵中期和發(fā)酵末期，自然發(fā)酵組酯類的相比含量繼續(xù)增加，而組酯類風(fēng)味物質(zhì)的相對含量逐漸降低。發(fā)酵末期，自然發(fā)酵組醇類比接種酵母組高了12.5%，主要集中在苯乙醇；而自然發(fā)酵組酯類含量是接種酵母組的10.11 倍；其乙酸乙酯含量是接種酵母組的12.27 倍；自然發(fā)酵組的脂肪酸類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)只有接種酵母組的10.40%。

圖2 不同發(fā)酵方式揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成Fig.2 Changes in contents of volatile flavor compounds during natural and inoculated wine fermentation

對兩種發(fā)酵方式不同發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果如圖3所示。葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過PCA后提取2 個PC，這2 個PC可以反映全部信息的61%?？梢钥闯觯? 個葡萄醪/酒樣品主要聚為4 部分。自然發(fā)酵組（Z1、Z2、Z3）PC1正方向，接種酵母組（S1、S2、S3）位于PC1負(fù)方向，Z0位于第1坐標(biāo)軸0點附近，差異明顯。在PC2上，未開始發(fā)酵的Z0組位于坐標(biāo)軸正方向，而已經(jīng)開始發(fā)酵的S1、S2、S3、Z2、Z3組位于坐標(biāo)軸負(fù)方向。Z1位于PC20點附近，可能是因為Z1組自然發(fā)酵剛開始時發(fā)酵速率較慢，這個階段產(chǎn)生的新?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較少。圖中可以很明顯區(qū)分開Z0與其他組樣品。此外，在圖中無法區(qū)分S1、S2、S3，說明接種酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較為相似。圖中也無法區(qū)分Z2和Z3，表明在自然發(fā)酵中期和末期，葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較為相似。

圖3 葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA圖Fig.3 PCA plot of volatile flavor compounds in wine

2.4 兩種發(fā)酵方式真菌微生物多樣性的變化

2.4.1 物種豐富度與多樣性分析

表3反映了兩種發(fā)酵方式不同樣品真菌群落多樣性指數(shù)及物種豐富度。覆蓋率為測序深度指數(shù)，其值越高，則樣品中序列沒有被檢測出的概率越低?？梢钥闯?，所有樣品的覆蓋率均大于99.98%，表明本次樣品測序深度足夠，本次測序結(jié)果能夠代表樣品的真實情況。

表3 不同樣品真菌物種豐富度及群落多樣性指數(shù)Table 3 Species richness and diversity indexes of fungal community in different wine samples

豐富度指數(shù)不考慮每個物種的相對豐度，給予相對豐度高的物種與相對豐度低的物種相同權(quán)重[20]。除梗破碎樣品的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)均為最大，說明在除梗破碎時期，葡萄醪中物種豐富度最高。發(fā)酵起始階段（發(fā)酵1階段），接種酵母組的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)迅速降低為原來的34.38%和35.85%，說明在接種酵母后，酒樣中物種豐富度迅速降低。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，接種發(fā)酵組的物種豐富度逐漸降低，Sobs指數(shù)和Chao指數(shù)均有所下降。自然發(fā)酵組的發(fā)酵初期相較于除梗破碎階段，兩指數(shù)也有所降低，但降幅沒有接種酵母組大，表明在不進(jìn)行認(rèn)為干預(yù)的情況下，葡萄醪中也會緩慢發(fā)生群落演替。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，與接種發(fā)酵組相似，自然發(fā)酵組的物種豐富度也逐漸降低。但在發(fā)酵結(jié)束階段（發(fā)酵3階段），相較于上一階段，自然發(fā)酵組的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)均有所增加，說明這個過程中有新的物種出現(xiàn)，這個現(xiàn)象在接種發(fā)酵組中未觀測到。

物種多樣性指數(shù)反映物種豐富度和均勻度的綜合狀況，常見的有Shannon、Simpson、Invsimpson指數(shù)等。Shannon指數(shù)反映物種豐富度與不同種類物種豐度的均勻性，而Simpson指數(shù)為在樣本中抽取兩條序列屬于不同種的概率。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，自然發(fā)酵組與接種發(fā)酵組的Shannon指數(shù)均在逐漸降低，Simpson指數(shù)均在逐漸升高，說明發(fā)酵過程中真菌多樣性在逐漸降低，存在優(yōu)勢物種。而自然發(fā)酵組各階段的Shannon指數(shù)均較接種發(fā)酵組高，Simpson指數(shù)均較接種發(fā)酵組低，說明自然發(fā)酵過程中的真菌多樣性比接種酵母過程更為豐富。

2.4.2 葡萄酒樣品物種分類注釋分析

對兩種發(fā)酵方式發(fā)酵過程中的樣品進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行物種分類注釋，其結(jié)果如表4所示。兩種發(fā)酵方式葡萄酒樣品中共檢測到2 個門，分別為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。樣品中的微生物大多屬于子囊菌門，少數(shù)為擔(dān)子菌門。其中除梗破碎階段的子囊菌門相對豐度最低，為95.27%，而其他幾組子囊菌門的相對豐度均達(dá)到了98%。除梗破碎共檢測出41 個目和59 個屬，在發(fā)酵初期，自然發(fā)酵組共檢測出了31 個科46 個屬，接種發(fā)酵組檢測出了24 個科及27 個屬。在發(fā)酵末期，自然發(fā)酵組檢測出了28 個科32 個屬，接種發(fā)酵組檢測出了17 個科18 個屬。

表4 兩種發(fā)酵方式葡萄酒樣品物種分類統(tǒng)計Table 4 Statistics of fungal community composition in wine samples from natural and inoculated fermentation

圖4展示了兩種發(fā)酵方式不同階段在屬水平物種分布情況。隨著發(fā)酵進(jìn)程推進(jìn)，兩種方式屬水平數(shù)量都依次減少，其中接種發(fā)酵的屬水平數(shù)量比自然發(fā)酵少。在屬水平，本次測序所檢出的微生物主要包括鏈格孢屬（Alternaria）、青霉屬（Penicillium）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、枝孢屬（Cladosporium）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、枝頂孢屬（Acremonium）和其他（others）。鏈格孢屬是來自全球不同釀酒地區(qū)主要釀酒葡萄菌群的一部分[21]。作為一種病原體，它有可能在高壓條件下引起葡萄果實腐爛。此外，據(jù)報道，鏈格孢菌菌株會在葡萄上產(chǎn)生AOH和AME真菌毒素[22]，具有潛在的毒理學(xué)風(fēng)險。青霉屬一般認(rèn)為是釀酒葡萄的致病因子，是葡萄園中分離出來的最常見屬之一。在葡萄酒釀造過程中，可以產(chǎn)生青霉毒素[23]和異味，如蘑菇味和泥土味[24]。有孢漢遜酵母屬是葡萄酒中常見的非釀酒酵母，通常在發(fā)酵初期占據(jù)優(yōu)勢，并對葡萄酒的感官具有顯著影響[25]。有孢漢遜酵母屬可以分泌多種水解酶，增加葡萄酒中乙酸苯乙酯含量[26]，提高香氣含量和復(fù)雜性，但也有可能產(chǎn)生過多的乙酸乙酯[27]。枝孢菌屬是葡萄園中常見的病害微生物，它們以附生植物的形式存在于葡萄藤和其他寄主上，并經(jīng)常出現(xiàn)在空氣中[28]，通常感染可溶性固形物含量大于15%或存在機(jī)械損傷的 葡萄[29]枝孢菌屬感染會造成葡萄酒的果香（如脂類、內(nèi)酯、酮和醇）損失，并對葡萄酒顏色造成負(fù)面影響[30]。釀酒酵母屬是葡萄酒發(fā)酵過程中最重要的微生物，它促進(jìn)乙醇發(fā)酵，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，并產(chǎn)生大量副產(chǎn)物[31]。枝頂孢屬是一種常見的真菌，主要為植物寄生、腐生和自生。其次生代謝產(chǎn)物具有良好的生物活性，如枝頂孢素對葡萄霜霉的孢子萌發(fā)具有抑制作用[32]，枝頂孢屬的枝頂孢（Acremonium coenophilum）對多種體外培養(yǎng)的農(nóng)作物病原真菌也具有抑制作用[33]。枝頂孢屬真菌在工業(yè)上也常用來生產(chǎn)頭孢菌素C[34]。

圖4 屬水平物種分布柱狀圖Fig.4 Fungal community distribution at the genus level

在除梗破碎葡萄醪中支孢屬和枝頂孢屬的真菌相對豐度最多，分別為占比30%和50%，釀酒酵母屬僅占0.5%。發(fā)酵過程中接種發(fā)酵組由于人為添加釀酒酵母，釀酒酵母屬相對豐度最大，占據(jù)絕對優(yōu)勢，發(fā)酵初期、中期、末期分別占比96.80%、98.75%和99.35%。而自然發(fā)酵組中，發(fā)酵初期有孢漢遜酵母屬的相對豐度最大，為70.55%，其次是枝孢屬，為14.72%，釀酒酵母屬占比1.37%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵中期自然發(fā)酵組有孢漢遜酵母屬相對豐度降低，為39.20%；逐漸讓位于釀酒酵母屬，釀酒酵母屬相對豐度增加，為57.04%。在發(fā)酵末期，釀酒酵母屬相對豐度繼續(xù)增加，達(dá)到75.34%，與接種發(fā)酵組不同，其有孢漢遜酵母屬仍有21.91%的相對豐度。

在除梗破碎階段，葡萄表面附著的各種微生物進(jìn)入葡萄醪中，其中包括各種霉菌（如鏈格孢屬、青霉屬、枝孢菌屬等）、酵母菌（如有孢漢遜酵母屬、釀酒酵母屬等）以及與對霉菌有抑制作用的菌類（如枝頂孢屬等）。在接種酵母的過程中，葡萄所攜帶真菌的相對豐度迅速降低，并隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行其種類和豐度繼續(xù)降低，發(fā)酵醪中以釀酒酵母屬為絕對的優(yōu)勢菌種，占據(jù)主導(dǎo)地位。一方面，引入商業(yè)釀酒酵母后，在適宜的環(huán)境下（葡萄醪中），釀酒酵母大量生長，擠壓了原始菌群的生活資源；同時代謝產(chǎn)生乙醇，對其他菌群產(chǎn)生抑制作用，而自己對乙醇具有較高耐受性。而自然發(fā)酵葡萄酒在發(fā)酵開始階段，有孢漢遜酵母屬占據(jù)主導(dǎo)地位，因為其具有較高的糖耐受性；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，耐乙醇能力強(qiáng)的釀酒酵母豐度逐漸增加，并在發(fā)酵的中后期逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。同時也發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵過程中，沒有哪類菌種具有絕對的優(yōu)勢地位（如接種發(fā)酵組所表現(xiàn)），在發(fā)酵初期，枝孢菌屬的相對豐度仍有14.72%，而在發(fā)酵末期有孢漢遜酵母屬也有21.91%的相對豐度。這可能是因為葡萄表皮攜帶的有孢漢遜酵母生存能力強(qiáng)，而其攜帶的釀酒酵母嗜殺性或產(chǎn)乙醇弱（自然發(fā)酵組僅能產(chǎn)生8.33%的乙醇，而接種發(fā)酵組可以產(chǎn)生11.17%的乙醇）。在接種酵母過程中，葡萄所攜帶的霉菌的生長早早就被抑制，在未發(fā)生大量感染的情況下各種霉菌對葡萄酒產(chǎn)生的負(fù)面影響較小。而自然發(fā)酵過程中各種霉菌在葡萄醪中有較長時間的出現(xiàn)，且不易控制，可能會對葡萄酒品質(zhì)有負(fù)面影響，并有可能產(chǎn)生有害物質(zhì)。通過有機(jī)酸測定，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵葡萄酒樣品中乙酸含量是接種酵母的2.06 倍。因此，需要進(jìn)一步研究以評估自然發(fā)酵過程中原始菌群對葡萄酒品質(zhì)及有害物質(zhì)累積的影響。

2.4.3 “戶太8號”葡萄酒樣品物種β多樣性分析

采取了21 個樣品的OTU 數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），以研究葡萄酒樣品間真菌群落組成的物種β多樣性。如圖5所示，PCo1貢獻(xiàn)率為77.94%，PCo2貢獻(xiàn)率為23.44%，表明圖有較好的解釋效果。分析PCo1方向上，Z0組與其他處理組可以在PCo1區(qū)分，PCo1反映的因素應(yīng)為發(fā)酵與否，能解釋不同處理組微生物種群差異的77.94%；在PCo2方向，Z0組處于0點附近，S1、S2、S3組樣品主要處于正坐標(biāo)軸方向，Z1、Z2、Z3組樣品主要處于負(fù)坐標(biāo)軸方向，具有較好的區(qū)分，PCo2反映的因素應(yīng)為自然發(fā)酵還是接種酵母，能夠解釋不同處理組微生物種群差異的23.44%。S1、S2、S3組在PCoA圖中聚在一起，表明其組間微生物多樣性差異不顯著。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，自然發(fā)酵組逐漸靠近接種酵母組，其組間微生物種群差異逐漸降低。

圖5 不同發(fā)酵方式樣品的PCoA圖Fig.5 Principal coordinate analysis plot of wine samples from natural and inoculated fermentation

2.4.4 真菌微生物多樣性與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

葡萄酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與葡萄酒釀造過程中微生物的活動有很大關(guān)系。選取自然發(fā)酵組與接種發(fā)酵組發(fā)酵結(jié)束階段真菌屬微生物作為自變量X，兩種發(fā)酵方式發(fā)酵結(jié)束階段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)作為因變量Y，利用The Unscramber X 10.4軟件進(jìn)行偏最小二乘（partial least squares，PLS）法分析，結(jié)果如圖6所示。通過軟件分析，選擇兩個PLS模型預(yù)測因子，兩因子對自變量X有81%和12%的解釋率，對因變量Y有62%和12%的解釋率。變量點基本位于75%～95%方差置信區(qū)間內(nèi)，證明兩因子對X和Y均有較好的解釋。釀酒酵母與其他菌種分別位于X軸兩側(cè)，表明兩者呈負(fù)相關(guān)。青霉菌屬（Penicillium）位于第1象限，與2-丁烯酸乙酯和乙酸苯乙酯距離較近。有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、鏈格孢屬（Alternaria）、枝頂孢屬（Acremonium）、枝孢屬（Cladosporium）位于第4象限，與乙酸乙酯、順-3-壬烯-1-醇、苯甲醇、苯乙醇、正己醇距離較近，說明其相關(guān)性較強(qiáng)。釀酒酵母屬（Saccharomyces）位于第4象限，與大多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)距離較近，說明酵母菌屬真菌是葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要來源。通過對葡萄酒進(jìn)行真菌菌群結(jié)構(gòu)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析，可以發(fā)現(xiàn)除酵母菌外大多數(shù)真菌與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的醇類相關(guān)性較強(qiáng)，如苯乙醇、苯甲醇、正己醇以及順-3-壬烯-1-醇。苯甲醇具有花香和柑橘香，苯乙醇具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[35]。除了醇類外，乙酸乙酯也與有孢漢遜酵母屬相關(guān)性強(qiáng)。對比兩種發(fā)酵方式對葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，可以發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵末期醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比接種發(fā)酵末期要高，這說明葡萄中攜帶的微生物會產(chǎn)生更多的醇類物質(zhì)。此外自然發(fā)酵產(chǎn)生乙酸乙酯含量是接種酵母組的12.27 倍，推測為在自然發(fā)酵階段大量存在的有孢漢遜酵母產(chǎn)生了過量的乙酸乙酯，同時也消耗了葡萄酒中的酸類成分，導(dǎo)致自然發(fā)酵組酸類揮發(fā)性成分的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于接種發(fā)酵組[36-37]。

圖6 發(fā)酵結(jié)束階段PLS結(jié)果Fig.6 PLS analysis of wine samples at the end of fermentation

3 結(jié)論

無論是自然發(fā)酵與接種酵母，兩種發(fā)酵方式均可完成“戶太8號”葡萄酒乙醇發(fā)酵過程。然而自然發(fā)酵發(fā)酵周期長，乙醇發(fā)酵速率及乙醇轉(zhuǎn)化效率較低。酒石酸含量較低，乳酸與乙酸含量較高，自然發(fā)酵過程可能存在破敗風(fēng)險，因此，在生產(chǎn)過程中自然發(fā)酵不易控制，具有風(fēng)險。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類與總量逐漸增加，兩種發(fā)酵葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異顯著。自然發(fā)酵的醇類與酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均多于接種發(fā)酵。

“戶太8號”葡萄酒自然發(fā)酵過程中，初期有孢漢遜酵母屬與枝頂孢屬占優(yōu)勢；中期釀酒酵母屬和有孢漢遜酵母屬占優(yōu)勢；末期時釀酒酵母屬與有孢漢遜酵母屬占優(yōu)勢。在接種發(fā)酵過程中，釀酒酵母屬始終占據(jù)絕對優(yōu)勢。通過PLS模型分析發(fā)現(xiàn)真菌微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性明顯。部分醇類物質(zhì)，如苯乙醇、苯甲醇、正己醇、順-3-壬烯-1-醇以及乙酸乙酯與有孢漢遜酵母屬、鏈格孢屬、枝頂孢屬、枝孢屬具有相關(guān)性。

兩種發(fā)酵方式相比較而言，自然發(fā)酵揮發(fā)性物質(zhì)含量雖然較多，但種類較接種發(fā)酵較少，并且會產(chǎn)生大量的乙酸乙酯，會對香氣產(chǎn)生負(fù)面影響，因此在工業(yè)上大量使用自然發(fā)酵方式釀造“戶太8號”酒需要謹(jǐn)慎處理。相比之下接種酵母發(fā)酵方式周期較短，效率較高，相對穩(wěn)定，揮發(fā)性物質(zhì)種類較多。因此，在生產(chǎn)實踐推薦采用接種發(fā)酵方式生產(chǎn)“戶太8號”葡萄酒。