自然發(fā)酵與接種發(fā)酵“戶太8號(hào)”葡萄酒品質(zhì)及真菌微生物多樣性分析

文 栩，王志磊，袁佳璐，線芷晨，袁春龍,2,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒實(shí)驗(yàn)示范站，寧夏 永寧 750104）

“戶太8號(hào)”葡萄屬于歐美雜交種，由陜西西安葡萄研究所選育而得，是陜西主栽葡萄品種之一。近年來，陜西“戶太8號(hào)”葡萄的種植面積與產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，存在成熟期集中及季節(jié)性相對(duì)過剩等問題，影響了“戶太 8號(hào)”葡萄種植的經(jīng)濟(jì)效益?！皯籼?號(hào)”作為鮮食葡萄，并不常用來釀酒，梁艷英等[1]以“戶太8號(hào)”作為原料釀造冰酒，但涉及到真菌微生物多樣性方面的發(fā)酵研究很少。使用“戶太8號(hào)”葡萄釀酒既可以避免因滯銷及雨熱同季氣候造成的腐爛浪費(fèi)，又可以增加產(chǎn)品附加值，提高果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。

葡萄酒的發(fā)酵主要有兩種方式：一種是釀造過程中不人為添加商業(yè)酵母、SO2等輔料，依靠葡萄攜帶的本土微生物進(jìn)行發(fā)酵的自然發(fā)酵；以及接種活性酵母進(jìn)行發(fā)酵的控制性發(fā)酵方式。自然發(fā)酵能夠產(chǎn)生具有地域特色的風(fēng)味復(fù)雜的特色葡萄酒，展現(xiàn)葡萄酒的地域風(fēng)格[2]。同時(shí)，自然發(fā)酵也會(huì)給釀造過程帶來不可預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)[3]，且不同的栽培管理方式也會(huì)對(duì)葡萄酒真菌菌落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[4]。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)自然發(fā)酵葡萄酒的研究越來 越多[5]。且研究方向主要集中于揮發(fā)性香氣物質(zhì)[6-7]與真菌菌落組成的關(guān)系[8]。葡萄酒有機(jī)酸通常隨著釀造過程中從葡萄轉(zhuǎn)移至葡萄酒中，其種類、濃度都與葡萄酒品質(zhì)有著很大關(guān)系[9]。本研究以“戶太8號(hào)”葡萄為原料，使用自然發(fā)酵與接種發(fā)酵兩種方式進(jìn)行葡萄酒釀造，研究?jī)煞N發(fā)酵方式“戶太8號(hào)”葡萄酒中基本理化指標(biāo)、有機(jī)酸成分、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和真菌微生物多樣性的變化，深入研究“戶太8號(hào)”發(fā)酵過程中真菌微生物多樣性變化與葡萄酒品質(zhì)的相關(guān)性，旨在為“戶太8號(hào)”葡萄酒發(fā)酵方式選擇及風(fēng)味改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄品種“戶太8號(hào)”，采自陜西西安鄠邑區(qū)崔家灣村（東經(jīng)108.6°，北緯34.1°），采收時(shí)間為2020年 10月，原料含糖量170 g/L，可滴定酸3.60 g/L（以酒石 酸計(jì)）。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014C氣相色譜儀 日本島津公司；1260 infinity II高效液相色譜儀 德國(guó)安捷倫公司；IQ7000超純水機(jī) 密理博中國(guó)有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方法

采用小容器釀造法進(jìn)行葡萄酒的發(fā)酵。將“戶太8 號(hào)” 葡萄除梗破碎，并調(diào)整葡萄醪糖質(zhì)量濃度為216 g/ L，分裝于5 L發(fā)酵罐中分別用于自然發(fā)酵和接種酵母。發(fā)酵罐提前進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，每組用3 個(gè)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。自然發(fā)酵組（記為ZF）：直接進(jìn)行發(fā)酵；接種發(fā)酵組（記為SF）直投接種200 mg/L的商業(yè)酵母（釀酒酵母SY，安琪酵母股份有限公司）進(jìn)行發(fā)酵。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵溫度為20 ℃的葡萄酒表現(xiàn)出良好品質(zhì)，因此確定發(fā)酵溫度為20 ℃。

每天測(cè)定葡萄酒基本理化指標(biāo)以監(jiān)測(cè)葡萄酒發(fā)酵過程。并在兩種發(fā)酵方式的除梗破碎階段、發(fā)酵初期（葡萄醪中糖含量剛開始明顯降低）、發(fā)酵中期（葡萄醪中糖含量變?yōu)樵瓉淼囊话耄?、發(fā)酵末期（葡萄醪中糖質(zhì)量濃度＜4 g/L）進(jìn)行取樣。分別記除梗破碎階段、發(fā)酵初期、發(fā)酵中期、發(fā)酵末期為發(fā)酵0、1、2、3階段，自然發(fā)酵葡萄酒在1、2、3階段的取樣分別記為Z1、Z2、Z3，接種酵母葡萄酒在1、2、3階段的取樣分別記為S1、S2、S3。由于在除梗破碎階段兩種發(fā)酵方式未進(jìn)行差異化處理，因此統(tǒng)一計(jì)為Z0。

取樣前先將每個(gè)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液攪拌混勻，后從發(fā)酵罐上中下3 個(gè)不同位置取15 mL酒樣裝入離心管立刻用液氮冷凍，并貯存于超低溫冰箱中（-80 ℃）用于有機(jī)酸含量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及真菌多樣性測(cè)定。

1.3.2 發(fā)酵過程中葡萄酒樣品的高通量測(cè)序

葡萄酒發(fā)酵過程中真菌微生物的高通量測(cè)序工作委托深圳華大基因股份有限公司完成。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對(duì)應(yīng)的融合引物配制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系，設(shè)置PCR參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

下機(jī)數(shù)據(jù)過濾，剩余高質(zhì)量的clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；將tags聚類成可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）并與數(shù)據(jù)庫比對(duì)、物種注釋；基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析，以及關(guān)聯(lián)分析與模型預(yù)測(cè)等。

序列拼接使用軟件FLASH（v1.3.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的tags。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的tags聚類為OTU。

1.3.3 葡萄酒基本理化指標(biāo)測(cè)定

指標(biāo)測(cè)定基于王華[10]方法，葡萄酒中還原糖含量采用菲林試劑熱滴定法測(cè)定；可滴定酸采用酸堿滴定法測(cè)定；pH值使用pH計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；可溶性固形物采用手持糖量計(jì)進(jìn)行測(cè)定；乙醇體積分?jǐn)?shù)采用SBA-40C生物傳感器測(cè)定。所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.4 發(fā)酵過程中葡萄酒有機(jī)酸的測(cè)定

使用高效液相色譜法。取一定量發(fā)酵液，加入離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液用超純水稀釋至2 倍，過0.22 μm濾膜，并收集濾液進(jìn)行分析。

色譜柱：BIO-RAD Aminex HPX-87H（300 mm× 7.8 mm）；色譜柱溫55 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。流動(dòng)相：5 mmol/L硫酸溶液。

1.3.5 發(fā)酵過程中葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定[11]，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

固相微萃取：將待測(cè)發(fā)酵液10000 r/min離心5 min，取2 mL上清液加入20 mL頂空瓶中，用超純水將發(fā)酵液稀釋4 倍，加入2 g NaCl，再加入40 μg/L 2-辛醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，擰緊瓶蓋，于40 ℃磁力攪拌15 min，然后插入已活化或解析過的萃取頭，于40 ℃攪拌30 min，待揮發(fā)性物質(zhì)在三相（頂空、萃取頭和液體部分）中分布達(dá)到平衡，取下萃取頭，立即送至氣相色譜進(jìn)樣口，230 ℃熱解吸5 min。

色譜條件：載氣為高純度氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min；溫度控制程序?yàn)椋合壬郎刂?0 ℃并持續(xù)5 min，再以2 ℃/min速率升至130 ℃，隨后以5 ℃/min 速率升至220 ℃并持續(xù)10 min。質(zhì)譜條件：采用不分流模式進(jìn)行，電子電離源；全掃描模式，掃描范圍35～350 u；離子源溫度為200 ℃；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；電子能量為70 eV；連接桿溫度為220 ℃。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性及相對(duì)定量：通過與標(biāo)準(zhǔn)品在相同檢測(cè)條件下的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖特征離子對(duì)比，結(jié)合NIST 2017質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定性，并通過內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Mircosoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；IBM SPSS Statistics 26、The Unscramber X 10.4軟件進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析；Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種發(fā)酵方式葡萄酒基本理化指標(biāo)

如表1所示，兩組均可以正常完成乙醇發(fā)酵（總 糖＜4 g/L），達(dá)到干型酒的標(biāo)準(zhǔn)。然而自然發(fā)酵組發(fā)酵時(shí)間為15 d，遠(yuǎn)高于接種酵母組（發(fā)酵時(shí)間為7 d）。自然發(fā)酵組酒樣可滴定酸含量高于接種酵母組，pH值低于接種酵母組。此外，接種酵母組酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.17%，接近潛在酒度12%，然而自然發(fā)酵組酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)為8.33%，表明自然發(fā)酵乙醇發(fā)酵速率及乙醇轉(zhuǎn)化效率均比接種發(fā)酵低。兩組酒樣可溶性固形物含量無顯著差異。

表1 兩種發(fā)酵方式葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 1 Major physicochemical indexes of wine from natural and inoculated fermentation

2.2 兩種發(fā)酵方式的有機(jī)酸含量

葡萄酒中的有機(jī)酸按其來源主要可分為兩大類，一類是來源于葡萄漿果，如蘋果酸、檸檬酸、酒石酸 等[12-13]；一類來源于酵母或細(xì)菌的代謝，如琥珀酸、乳酸和乙酸等[14]。這些有機(jī)酸的含量與組成決定葡萄酒的酸度，對(duì)葡萄酒的口感也存在重要影響[15]。由圖1a可知，采用兩種發(fā)酵方式進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵的過程中，兩組檸檬酸含量均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。接種酵母組在除梗破碎階段及發(fā)酵初期兩個(gè)階段檸檬酸含量下降速率較快，而自然發(fā)酵組則在下個(gè)階段內(nèi)檸檬酸含量下降速度快（即發(fā)酵初期及中期）。發(fā)酵中期后兩組檸檬酸含量無顯著差異。由于接種發(fā)酵組中釀酒酵母是優(yōu)勢(shì)菌種，發(fā)酵過程旺盛，在發(fā)酵初始階段糖可能無法滿足酵母的需要，而檸檬酸作為碳源迅速被微生物代謝，致使檸檬酸含量下降[16]。

圖1 兩種發(fā)酵方式有機(jī)酸含量的變化Fig.1 Changes in organic acid contents in wine during natural and inoculated fermentation

酒石酸作為葡萄和葡萄酒的主要成分對(duì)葡萄酒品質(zhì)可產(chǎn)生較大影響。一些乳酸菌也可以代謝酒石酸，生成乳酸和乙酸[17]。由圖1b可知，在發(fā)酵過程中，酒石酸含量逐漸降低，且在兩種發(fā)酵方式的相同階段含量無顯著差異，變化趨勢(shì)相似。發(fā)酵末期接種酵母組酒石酸含量相對(duì)較高，而自然發(fā)酵組酒石酸含量較低，可能是自然發(fā)酵過程中的雜菌導(dǎo)致酒石酸被分解。

蘋果酸是果汁最重要的組成成分之一，酸性較強(qiáng)，具特殊香氣。但當(dāng)其含量較高的時(shí)候，會(huì)給口腔帶來刺激感。由圖1c可知，待發(fā)酵結(jié)束時(shí)，兩組蘋果酸含量相近。

乳酸是葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，口感柔和，可用于改善葡萄酒的結(jié)構(gòu)感。由圖1d可知，在除梗破碎階段，葡萄醪中未檢測(cè)出乳酸。其中自然發(fā)酵組在發(fā)酵初期乳酸大量生成，而接種酵母組乳酸生成量較少。接種酵母組由于添加了商業(yè)酵母，其快速生長(zhǎng)抑制了乳酸的代謝活動(dòng)菌，如酒酒球菌和乳酸桿菌[18]，同時(shí)，較高水平的乳酸不會(huì)給葡萄酒產(chǎn)生較大問題[19]。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時(shí)，自然發(fā)酵組相較于接種酵母組乳酸含量增加，但蘋果酸含量無明顯差別，可能是因?yàn)榇嬖谔O果酸回補(bǔ)代謝途徑，將丙酮酸或其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為蘋果酸。

琥珀酸是一種口感較復(fù)雜的有機(jī)酸，其來源為酵母菌代謝以及谷氨酸轉(zhuǎn)化，琥珀酸的含量對(duì)葡萄酒口感具有很大影響。由圖1e可知，在葡萄酒發(fā)酵過程中，兩組酒樣琥珀酸的含量逐漸增加，接種發(fā)酵組琥珀酸的增加較為平穩(wěn)，而自然發(fā)酵組則是在發(fā)酵初期及發(fā)酵中期琥珀酸含量有顯著增幅。發(fā)酵中期及發(fā)酵末期，兩種發(fā)酵方式酒樣中琥珀酸含量相似。推測(cè)由于發(fā)酵初期接種酵母組的酵母菌相較于自然發(fā)酵組活躍，因此葡萄酒中琥珀酸產(chǎn)生量大于自然發(fā)酵組。

少量乙酸可豐富葡萄酒的口感，含量過高則會(huì)產(chǎn)生不愉快的氣味。從圖1f可以看出，發(fā)酵過程中自然發(fā)酵組乙酸含量逐漸增加，而接種酵母組酒樣中乙酸含量先有少許降低，后略微增加，發(fā)酵末期乙酸含量是自然發(fā)酵組乙酸含量的48.48%。葡萄酒中理想的乙酸質(zhì)量濃度約為0.1～0.3 g/L?？梢钥闯?，自然發(fā)酵葡萄酒中的乙酸質(zhì)量濃度較高（0.66 mg/L），表明自然發(fā)酵在發(fā)酵過程中存在破敗風(fēng)險(xiǎn)，但未超過GB/T 15037—2006《葡萄酒》的規(guī)定。

2.3 兩種發(fā)酵方式揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

如表2所示，共計(jì)檢測(cè)得到52 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括酯、醇、醛、酮、脂肪酸及其他六大類化合物。其中酯類和醇類是葡萄酒中最主要的風(fēng)味物質(zhì)，酯類25 種，占比48.08%；醇類17 種，占比32.69%；醛類5 種，占比9.6%；酮類和酸類各2 種，占比3.84%。

表2 7 個(gè)樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類Table 2 Changes in types of volatile flavor substances during natural and inoculated wine fermentation

由表2可知，在除梗破碎階段，葡萄醪中存在22 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中青葉醛和苯乙醛為這個(gè)階段葡萄醪中獨(dú)有，發(fā)酵開始后消失。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類逐漸增多。自然發(fā)酵組在發(fā)酵末期存在33 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類16 種，醇類13 種。自然發(fā)酵組發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有8 種，分別為異戊酸乙酯、甲酸丁酯、乙酸庚酯、2-羥基丁酸乙酯、3-羥基十八烷酸甲酯、十四酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、十一烯醇。接種酵母組在發(fā)酵末期存在41 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類22 種、醇類14 種。接種酵母組發(fā)酵過程中產(chǎn)生的特有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有2 種，分別為丙酸乙酯和順-3-壬烯-1-醇。

如圖2所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)開始積累。在發(fā)酵初期，兩組酒樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量相近，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)也較為相似；發(fā)酵中期和發(fā)酵末期，自然發(fā)酵組酯類的相比含量繼續(xù)增加，而組酯類風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量逐漸降低。發(fā)酵末期，自然發(fā)酵組醇類比接種酵母組高了12.5%，主要集中在苯乙醇；而自然發(fā)酵組酯類含量是接種酵母組的10.11 倍；其乙酸乙酯含量是接種酵母組的12.27 倍；自然發(fā)酵組的脂肪酸類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)只有接種酵母組的10.40%。

圖2 不同發(fā)酵方式揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成Fig.2 Changes in contents of volatile flavor compounds during natural and inoculated wine fermentation

對(duì)兩種發(fā)酵方式不同發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果如圖3所示。葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過PCA后提取2 個(gè)PC，這2 個(gè)PC可以反映全部信息的61%?？梢钥闯觯? 個(gè)葡萄醪/酒樣品主要聚為4 部分。自然發(fā)酵組（Z1、Z2、Z3）PC1正方向，接種酵母組（S1、S2、S3）位于PC1負(fù)方向，Z0位于第1坐標(biāo)軸0點(diǎn)附近，差異明顯。在PC2上，未開始發(fā)酵的Z0組位于坐標(biāo)軸正方向，而已經(jīng)開始發(fā)酵的S1、S2、S3、Z2、Z3組位于坐標(biāo)軸負(fù)方向。Z1位于PC20點(diǎn)附近，可能是因?yàn)閆1組自然發(fā)酵剛開始時(shí)發(fā)酵速率較慢，這個(gè)階段產(chǎn)生的新?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較少。圖中可以很明顯區(qū)分開Z0與其他組樣品。此外，在圖中無法區(qū)分S1、S2、S3，說明接種酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較為相似。圖中也無法區(qū)分Z2和Z3，表明在自然發(fā)酵中期和末期，葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較為相似。

圖3 葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA圖Fig.3 PCA plot of volatile flavor compounds in wine

2.4 兩種發(fā)酵方式真菌微生物多樣性的變化

2.4.1 物種豐富度與多樣性分析

表3反映了兩種發(fā)酵方式不同樣品真菌群落多樣性指數(shù)及物種豐富度。覆蓋率為測(cè)序深度指數(shù)，其值越高，則樣品中序列沒有被檢測(cè)出的概率越低?？梢钥闯?，所有樣品的覆蓋率均大于99.98%，表明本次樣品測(cè)序深度足夠，本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣品的真實(shí)情況。

表3 不同樣品真菌物種豐富度及群落多樣性指數(shù)Table 3 Species richness and diversity indexes of fungal community in different wine samples

豐富度指數(shù)不考慮每個(gè)物種的相對(duì)豐度，給予相對(duì)豐度高的物種與相對(duì)豐度低的物種相同權(quán)重[20]。除梗破碎樣品的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)均為最大，說明在除梗破碎時(shí)期，葡萄醪中物種豐富度最高。發(fā)酵起始階段（發(fā)酵1階段），接種酵母組的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)迅速降低為原來的34.38%和35.85%，說明在接種酵母后，酒樣中物種豐富度迅速降低。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，接種發(fā)酵組的物種豐富度逐漸降低，Sobs指數(shù)和Chao指數(shù)均有所下降。自然發(fā)酵組的發(fā)酵初期相較于除梗破碎階段，兩指數(shù)也有所降低，但降幅沒有接種酵母組大，表明在不進(jìn)行認(rèn)為干預(yù)的情況下，葡萄醪中也會(huì)緩慢發(fā)生群落演替。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，與接種發(fā)酵組相似，自然發(fā)酵組的物種豐富度也逐漸降低。但在發(fā)酵結(jié)束階段（發(fā)酵3階段），相較于上一階段，自然發(fā)酵組的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)均有所增加，說明這個(gè)過程中有新的物種出現(xiàn)，這個(gè)現(xiàn)象在接種發(fā)酵組中未觀測(cè)到。

物種多樣性指數(shù)反映物種豐富度和均勻度的綜合狀況，常見的有Shannon、Simpson、Invsimpson指數(shù)等。Shannon指數(shù)反映物種豐富度與不同種類物種豐度的均勻性，而Simpson指數(shù)為在樣本中抽取兩條序列屬于不同種的概率。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，自然發(fā)酵組與接種發(fā)酵組的Shannon指數(shù)均在逐漸降低，Simpson指數(shù)均在逐漸升高，說明發(fā)酵過程中真菌多樣性在逐漸降低，存在優(yōu)勢(shì)物種。而自然發(fā)酵組各階段的Shannon指數(shù)均較接種發(fā)酵組高，Simpson指數(shù)均較接種發(fā)酵組低，說明自然發(fā)酵過程中的真菌多樣性比接種酵母過程更為豐富。

2.4.2 葡萄酒樣品物種分類注釋分析

對(duì)兩種發(fā)酵方式發(fā)酵過程中的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行物種分類注釋，其結(jié)果如表4所示。兩種發(fā)酵方式葡萄酒樣品中共檢測(cè)到2 個(gè)門，分別為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。樣品中的微生物大多屬于子囊菌門，少數(shù)為擔(dān)子菌門。其中除梗破碎階段的子囊菌門相對(duì)豐度最低，為95.27%，而其他幾組子囊菌門的相對(duì)豐度均達(dá)到了98%。除梗破碎共檢測(cè)出41 個(gè)目和59 個(gè)屬，在發(fā)酵初期，自然發(fā)酵組共檢測(cè)出了31 個(gè)科46 個(gè)屬，接種發(fā)酵組檢測(cè)出了24 個(gè)科及27 個(gè)屬。在發(fā)酵末期，自然發(fā)酵組檢測(cè)出了28 個(gè)科32 個(gè)屬，接種發(fā)酵組檢測(cè)出了17 個(gè)科18 個(gè)屬。

表4 兩種發(fā)酵方式葡萄酒樣品物種分類統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of fungal community composition in wine samples from natural and inoculated fermentation

圖4展示了兩種發(fā)酵方式不同階段在屬水平物種分布情況。隨著發(fā)酵進(jìn)程推進(jìn)，兩種方式屬水平數(shù)量都依次減少，其中接種發(fā)酵的屬水平數(shù)量比自然發(fā)酵少。在屬水平，本次測(cè)序所檢出的微生物主要包括鏈格孢屬（Alternaria）、青霉屬（Penicillium）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、枝孢屬（Cladosporium）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、枝頂孢屬（Acremonium）和其他（others）。鏈格孢屬是來自全球不同釀酒地區(qū)主要釀酒葡萄菌群的一部分[21]。作為一種病原體，它有可能在高壓條件下引起葡萄果實(shí)腐爛。此外，據(jù)報(bào)道，鏈格孢菌菌株會(huì)在葡萄上產(chǎn)生AOH和AME真菌毒素[22]，具有潛在的毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。青霉屬一般認(rèn)為是釀酒葡萄的致病因子，是葡萄園中分離出來的最常見屬之一。在葡萄酒釀造過程中，可以產(chǎn)生青霉毒素[23]和異味，如蘑菇味和泥土味[24]。有孢漢遜酵母屬是葡萄酒中常見的非釀酒酵母，通常在發(fā)酵初期占據(jù)優(yōu)勢(shì)，并對(duì)葡萄酒的感官具有顯著影響[25]。有孢漢遜酵母屬可以分泌多種水解酶，增加葡萄酒中乙酸苯乙酯含量[26]，提高香氣含量和復(fù)雜性，但也有可能產(chǎn)生過多的乙酸乙酯[27]。枝孢菌屬是葡萄園中常見的病害微生物，它們以附生植物的形式存在于葡萄藤和其他寄主上，并經(jīng)常出現(xiàn)在空氣中[28]，通常感染可溶性固形物含量大于15%或存在機(jī)械損傷的 葡萄[29]枝孢菌屬感染會(huì)造成葡萄酒的果香（如脂類、內(nèi)酯、酮和醇）損失，并對(duì)葡萄酒顏色造成負(fù)面影響[30]。釀酒酵母屬是葡萄酒發(fā)酵過程中最重要的微生物，它促進(jìn)乙醇發(fā)酵，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，并產(chǎn)生大量副產(chǎn)物[31]。枝頂孢屬是一種常見的真菌，主要為植物寄生、腐生和自生。其次生代謝產(chǎn)物具有良好的生物活性，如枝頂孢素對(duì)葡萄霜霉的孢子萌發(fā)具有抑制作用[32]，枝頂孢屬的枝頂孢（Acremonium coenophilum）對(duì)多種體外培養(yǎng)的農(nóng)作物病原真菌也具有抑制作用[33]。枝頂孢屬真菌在工業(yè)上也常用來生產(chǎn)頭孢菌素C[34]。

圖4 屬水平物種分布柱狀圖Fig.4 Fungal community distribution at the genus level

在除梗破碎葡萄醪中支孢屬和枝頂孢屬的真菌相對(duì)豐度最多，分別為占比30%和50%，釀酒酵母屬僅占0.5%。發(fā)酵過程中接種發(fā)酵組由于人為添加釀酒酵母，釀酒酵母屬相對(duì)豐度最大，占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，發(fā)酵初期、中期、末期分別占比96.80%、98.75%和99.35%。而自然發(fā)酵組中，發(fā)酵初期有孢漢遜酵母屬的相對(duì)豐度最大，為70.55%，其次是枝孢屬，為14.72%，釀酒酵母屬占比1.37%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵中期自然發(fā)酵組有孢漢遜酵母屬相對(duì)豐度降低，為39.20%；逐漸讓位于釀酒酵母屬，釀酒酵母屬相對(duì)豐度增加，為57.04%。在發(fā)酵末期，釀酒酵母屬相對(duì)豐度繼續(xù)增加，達(dá)到75.34%，與接種發(fā)酵組不同，其有孢漢遜酵母屬仍有21.91%的相對(duì)豐度。

在除梗破碎階段，葡萄表面附著的各種微生物進(jìn)入葡萄醪中，其中包括各種霉菌（如鏈格孢屬、青霉屬、枝孢菌屬等）、酵母菌（如有孢漢遜酵母屬、釀酒酵母屬等）以及與對(duì)霉菌有抑制作用的菌類（如枝頂孢屬等）。在接種酵母的過程中，葡萄所攜帶真菌的相對(duì)豐度迅速降低，并隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行其種類和豐度繼續(xù)降低，發(fā)酵醪中以釀酒酵母屬為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌種，占據(jù)主導(dǎo)地位。一方面，引入商業(yè)釀酒酵母后，在適宜的環(huán)境下（葡萄醪中），釀酒酵母大量生長(zhǎng)，擠壓了原始菌群的生活資源；同時(shí)代謝產(chǎn)生乙醇，對(duì)其他菌群產(chǎn)生抑制作用，而自己對(duì)乙醇具有較高耐受性。而自然發(fā)酵葡萄酒在發(fā)酵開始階段，有孢漢遜酵母屬占據(jù)主導(dǎo)地位，因?yàn)槠渚哂休^高的糖耐受性；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，耐乙醇能力強(qiáng)的釀酒酵母豐度逐漸增加，并在發(fā)酵的中后期逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵過程中，沒有哪類菌種具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位（如接種發(fā)酵組所表現(xiàn)），在發(fā)酵初期，枝孢菌屬的相對(duì)豐度仍有14.72%，而在發(fā)酵末期有孢漢遜酵母屬也有21.91%的相對(duì)豐度。這可能是因?yàn)槠咸驯砥y帶的有孢漢遜酵母生存能力強(qiáng)，而其攜帶的釀酒酵母嗜殺性或產(chǎn)乙醇弱（自然發(fā)酵組僅能產(chǎn)生8.33%的乙醇，而接種發(fā)酵組可以產(chǎn)生11.17%的乙醇）。在接種酵母過程中，葡萄所攜帶的霉菌的生長(zhǎng)早早就被抑制，在未發(fā)生大量感染的情況下各種霉菌對(duì)葡萄酒產(chǎn)生的負(fù)面影響較小。而自然發(fā)酵過程中各種霉菌在葡萄醪中有較長(zhǎng)時(shí)間的出現(xiàn)，且不易控制，可能會(huì)對(duì)葡萄酒品質(zhì)有負(fù)面影響，并有可能產(chǎn)生有害物質(zhì)。通過有機(jī)酸測(cè)定，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵葡萄酒樣品中乙酸含量是接種酵母的2.06 倍。因此，需要進(jìn)一步研究以評(píng)估自然發(fā)酵過程中原始菌群對(duì)葡萄酒品質(zhì)及有害物質(zhì)累積的影響。

2.4.3 “戶太8號(hào)”葡萄酒樣品物種β多樣性分析

采取了21 個(gè)樣品的OTU 數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），以研究葡萄酒樣品間真菌群落組成的物種β多樣性。如圖5所示，PCo1貢獻(xiàn)率為77.94%，PCo2貢獻(xiàn)率為23.44%，表明圖有較好的解釋效果。分析PCo1方向上，Z0組與其他處理組可以在PCo1區(qū)分，PCo1反映的因素應(yīng)為發(fā)酵與否，能解釋不同處理組微生物種群差異的77.94%；在PCo2方向，Z0組處于0點(diǎn)附近，S1、S2、S3組樣品主要處于正坐標(biāo)軸方向，Z1、Z2、Z3組樣品主要處于負(fù)坐標(biāo)軸方向，具有較好的區(qū)分，PCo2反映的因素應(yīng)為自然發(fā)酵還是接種酵母，能夠解釋不同處理組微生物種群差異的23.44%。S1、S2、S3組在PCoA圖中聚在一起，表明其組間微生物多樣性差異不顯著。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，自然發(fā)酵組逐漸靠近接種酵母組，其組間微生物種群差異逐漸降低。

圖5 不同發(fā)酵方式樣品的PCoA圖Fig.5 Principal coordinate analysis plot of wine samples from natural and inoculated fermentation

2.4.4 真菌微生物多樣性與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

葡萄酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與葡萄酒釀造過程中微生物的活動(dòng)有很大關(guān)系。選取自然發(fā)酵組與接種發(fā)酵組發(fā)酵結(jié)束階段真菌屬微生物作為自變量X，兩種發(fā)酵方式發(fā)酵結(jié)束階段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)作為因變量Y，利用The Unscramber X 10.4軟件進(jìn)行偏最小二乘（partial least squares，PLS）法分析，結(jié)果如圖6所示。通過軟件分析，選擇兩個(gè)PLS模型預(yù)測(cè)因子，兩因子對(duì)自變量X有81%和12%的解釋率，對(duì)因變量Y有62%和12%的解釋率。變量點(diǎn)基本位于75%～95%方差置信區(qū)間內(nèi)，證明兩因子對(duì)X和Y均有較好的解釋。釀酒酵母與其他菌種分別位于X軸兩側(cè)，表明兩者呈負(fù)相關(guān)。青霉菌屬（Penicillium）位于第1象限，與2-丁烯酸乙酯和乙酸苯乙酯距離較近。有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、鏈格孢屬（Alternaria）、枝頂孢屬（Acremonium）、枝孢屬（Cladosporium）位于第4象限，與乙酸乙酯、順-3-壬烯-1-醇、苯甲醇、苯乙醇、正己醇距離較近，說明其相關(guān)性較強(qiáng)。釀酒酵母屬（Saccharomyces）位于第4象限，與大多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)距離較近，說明酵母菌屬真菌是葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要來源。通過對(duì)葡萄酒進(jìn)行真菌菌群結(jié)構(gòu)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析，可以發(fā)現(xiàn)除酵母菌外大多數(shù)真菌與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的醇類相關(guān)性較強(qiáng)，如苯乙醇、苯甲醇、正己醇以及順-3-壬烯-1-醇。苯甲醇具有花香和柑橘香，苯乙醇具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[35]。除了醇類外，乙酸乙酯也與有孢漢遜酵母屬相關(guān)性強(qiáng)。對(duì)比兩種發(fā)酵方式對(duì)葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，可以發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵末期醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比接種發(fā)酵末期要高，這說明葡萄中攜帶的微生物會(huì)產(chǎn)生更多的醇類物質(zhì)。此外自然發(fā)酵產(chǎn)生乙酸乙酯含量是接種酵母組的12.27 倍，推測(cè)為在自然發(fā)酵階段大量存在的有孢漢遜酵母產(chǎn)生了過量的乙酸乙酯，同時(shí)也消耗了葡萄酒中的酸類成分，導(dǎo)致自然發(fā)酵組酸類揮發(fā)性成分的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于接種發(fā)酵組[36-37]。

圖6 發(fā)酵結(jié)束階段PLS結(jié)果Fig.6 PLS analysis of wine samples at the end of fermentation

3 結(jié)論

無論是自然發(fā)酵與接種酵母，兩種發(fā)酵方式均可完成“戶太8號(hào)”葡萄酒乙醇發(fā)酵過程。然而自然發(fā)酵發(fā)酵周期長(zhǎng)，乙醇發(fā)酵速率及乙醇轉(zhuǎn)化效率較低。酒石酸含量較低，乳酸與乙酸含量較高，自然發(fā)酵過程可能存在破敗風(fēng)險(xiǎn)，因此，在生產(chǎn)過程中自然發(fā)酵不易控制，具有風(fēng)險(xiǎn)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類與總量逐漸增加，兩種發(fā)酵葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異顯著。自然發(fā)酵的醇類與酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均多于接種發(fā)酵。

“戶太8號(hào)”葡萄酒自然發(fā)酵過程中，初期有孢漢遜酵母屬與枝頂孢屬占優(yōu)勢(shì)；中期釀酒酵母屬和有孢漢遜酵母屬占優(yōu)勢(shì)；末期時(shí)釀酒酵母屬與有孢漢遜酵母屬占優(yōu)勢(shì)。在接種發(fā)酵過程中，釀酒酵母屬始終占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。通過PLS模型分析發(fā)現(xiàn)真菌微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性明顯。部分醇類物質(zhì)，如苯乙醇、苯甲醇、正己醇、順-3-壬烯-1-醇以及乙酸乙酯與有孢漢遜酵母屬、鏈格孢屬、枝頂孢屬、枝孢屬具有相關(guān)性。

兩種發(fā)酵方式相比較而言，自然發(fā)酵揮發(fā)性物質(zhì)含量雖然較多，但種類較接種發(fā)酵較少，并且會(huì)產(chǎn)生大量的乙酸乙酯，會(huì)對(duì)香氣產(chǎn)生負(fù)面影響，因此在工業(yè)上大量使用自然發(fā)酵方式釀造“戶太8號(hào)”酒需要謹(jǐn)慎處理。相比之下接種酵母發(fā)酵方式周期較短，效率較高，相對(duì)穩(wěn)定，揮發(fā)性物質(zhì)種類較多。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐推薦采用接種發(fā)酵方式生產(chǎn)“戶太8號(hào)”葡萄酒。