健康產(chǎn)蛋母鴨蛋內(nèi)容物非致病菌與其生殖道和盲腸菌群的相關性分析

盧昌麗，熊香元，陳力力，任佑華，劉 焱，張仁杰

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.清鎮(zhèn)市站街鎮(zhèn)農(nóng)村發(fā)展綜合服務中心，貴州 貴陽 551403；3.湖南文理學院，湖南 常德 415000）

鴨蛋是我國消費者餐桌上除雞蛋外常見的禽蛋，2020年我國鴨蛋產(chǎn)量高達284.66萬 t[1]，鴨蛋不僅可以鮮食，還能加工成咸鴨蛋、皮蛋、糟蛋等蛋制品。消費者對它的需求量也在逐年遞增，因此鮮鴨蛋的質(zhì)量與衛(wèi)生對消費者的食用安全影響廣泛。鮮鴨蛋營養(yǎng)豐富也是細菌生長繁殖的良好基質(zhì)，易受細菌污染而導致保質(zhì)期短，甚至失去食用價值，一般認為剛產(chǎn)出的禽蛋表面天然保護膜對微生物侵染有一定自衛(wèi)能力，蛋內(nèi)容物細菌污染的主要原因在于鴨舍類型、飼養(yǎng)方式、管理模式及氣候條件等環(huán)境因素造成細菌生長繁殖，這些環(huán)境污染細菌通過鴨蛋殼氣孔滲透進入蛋內(nèi)即水平傳播污染[2]；然而，鴨蛋形成的復雜過程也可能是造成蛋內(nèi)容物細菌污染的原因，尤其是散養(yǎng)或圈養(yǎng)的蛋鴨很難做到集約化管理，自然環(huán)境因素使得母鴨體內(nèi)有大量定植的微生物菌群，在鴨蛋形成過程中產(chǎn)生影響，但是目前人們僅開展了母禽體內(nèi)致病菌或獸藥殘留對禽蛋影響的研究，例如，研究表明腸炎沙門菌可通過水平傳播和垂直傳播兩種途徑污染雞蛋，并且能夠利用其獨特的分子調(diào)節(jié)機制逃避蛋清內(nèi)抗菌成分的殺傷，表現(xiàn)出比其他血清型更強的蛋內(nèi)增殖能力[3]。抗生素作為飼料添加劑飼喂產(chǎn)蛋母雞時，不僅促使母禽體內(nèi)細菌產(chǎn)生耐藥性，而且在某一時期可從母體和雞蛋內(nèi)或雞蛋形成的各個階段均檢測到抗生素殘留[4]。對于健康產(chǎn)蛋母鴨是否能通過垂直傳播方式使非致病菌侵染蛋內(nèi)容物，從而對蛋品質(zhì)產(chǎn)生潛在影響鮮見報道。為此，本研究從蛋鴨養(yǎng)殖場隨機挑選健康的產(chǎn)蛋母鴨（麻鴨），無菌解剖采集盲腸組織和生殖道組織以及同批軟殼和硬殼鴨蛋內(nèi)容物為樣品，比較其可培養(yǎng)菌落總數(shù)數(shù)量，未培養(yǎng)菌的多樣性、功能預測以及相關性，探討鴨蛋內(nèi)容物非致病性細菌與母鴨生殖道和盲腸菌群的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從湖南長沙岳麓區(qū)興合村烏泥塘鴨場隨機挑選處于健康產(chǎn)蛋期的產(chǎn)蛋母鴨（麻鴨）6 只，鴨齡6 月，體質(zhì)量（750±50）g，提前1 d分籠飼養(yǎng)。根據(jù)GB 14922.2—2011《實驗動物 微生物學等級及監(jiān)測》取樣要求，無菌操作打開腹腔取出盲腸、生殖道組織以及體腔內(nèi)的軟殼蛋和排出的硬殼蛋4 組樣品，每兩只鴨的相同部位為一份，分別裝入無菌袋，并編號為盲腸樣品MC1、MC2、MC3；生殖道樣品SZ1、SZ2、SZ3；軟殼蛋樣品RD1、RD2和硬殼蛋樣品CD1、CD2。隨后裝入冰盒帶回實驗室冰箱保存，備用。

Tris-飽和酚（pH＞7.8）、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；蛋白酶K、RNaseA酶、LB肉湯培養(yǎng)基 北京康為世紀生物科技有限公司；氯仿、異戊醇、無水乙醇、Tris-HCl、異丙醇 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BioSpectrometer?basic分光光度計 德國艾本德股份公司；JY600C水平電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad 公司；Nano Drop 2000 美國Thermo Fisher公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品可培養(yǎng)細菌菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，盲腸（MC1、MC2、MC3）及生殖道（SZ1、SZ2、SZ3）樣品剪碎后各稱取5 g，軟殼蛋（RD1、RD2）和硬殼蛋（CD1、CD2）內(nèi)容物分別混勻后各稱取5 g，隨后，分別用無菌生理鹽水適當10 倍梯度稀釋，取稀釋樣品懸液混菌法接種至PCA瓊脂培養(yǎng)基平板，放置培養(yǎng)箱（37±1）℃恒溫培養(yǎng)（36±2）h進行可培養(yǎng)菌菌落計數(shù)。

1.3.2 樣品未培養(yǎng)細菌MiSeq高通量測序

采用十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉凍融法提取樣品細菌基因組DNA，每份樣品設定3 個重復，分別編號為MC1-1、MC1-2、MC1-3、SZ1-1、SZ1-2、SZ1-3等。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察及NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計檢測合格后，采用帶有barcode的特異引物進行細菌16S rDNA聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，引物為Primer 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和Primer 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，高通量測序工作由上海美吉生物工程有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析

菌落總數(shù)計數(shù)采用SPSS 21.0和Origin 2018軟件計算數(shù)據(jù)并繪圖。

根據(jù)barcode序列區(qū)分得到各個樣本reads，經(jīng)過處理得到clean reads。用對應的軟件進行細菌可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和聚類分析得到OTU的代表序列（97%相似水平），并以繪制稀釋曲線進行深度驗證。隨后應用Mothur軟件進行α多樣性指數(shù)分析，通過非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析比較群落β多樣性，從不同分類水平分析各樣品的物種組成。通過PICRUSt功能預測軟件分析直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Module以及Pathway不同水平途徑的功能信息，并計算各功能信息豐度。此外，使用BugBase工具進行表型預測，并分析各物種的表型貢獻度。比較共有菌屬在各樣品中的豐度占比，利用線性判別分析Effect Size（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）多級物種差異判別分析顯著豐度差異特征的物種，Network 網(wǎng)絡分析比較各樣品中不同細菌物種的相關性，系統(tǒng)進化樹分析物種之間的親緣和進化關系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品可培養(yǎng)細菌的菌落總數(shù)計數(shù)

樣品可培養(yǎng)菌落總數(shù)計數(shù)結(jié)果見圖1，MC菌落總數(shù)最高，其次為SZ和CR、RD。研究報道[5-6]家禽腸道細菌在機體營養(yǎng)物質(zhì)消化、病原體抑制和與腸道相關免疫系統(tǒng)相互作用方面發(fā)揮著重要作用；近年來人們對人類、畜牧以及雞胚的研究表明[7-8]，早在胚胎時期，胎兒體內(nèi)已經(jīng)具有自己的腸道細菌群落，復雜的微生物組可以從母親腸道向胎兒傳播，并且通過顯微鏡和培養(yǎng)技術得到了驗證，因此認為本研究健康母鴨體內(nèi)軟殼蛋（卵子）內(nèi)的活菌與其盲腸細菌是有關聯(lián)的。由于微生物對人類健康和生育有一定的影響，生殖道細菌及群落也成為了關注的焦點[9]。家禽病理學研究報道致病性大腸桿菌、雞新城疫病毒引起的輸卵管炎，導致蛋雞產(chǎn)蛋量下降及聚集性死亡[10-11]；在雞蛋形成的各個階段中，都有可能產(chǎn)生獸藥殘留[12]；因此，生殖道的定居細菌進入蛋內(nèi)可能發(fā)生。

2.2 樣品測序豐度及多樣性

采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測及OD260nm/OD280nm比值測定，表明各樣品細菌基因組DNA及PCR擴增產(chǎn)物的濃度和純度均符合要求。4 組30 個樣本共得到優(yōu)化序列1411296 條，在97%相似度下聚類共產(chǎn)生4239 個OTU。其中，MC有效序列、OTU數(shù)為448977、634 個，SZ 398383、806 個，RD 283291、2636 個，CD 280645、2293 個。由圖2a可知，所有曲線逐漸平滑直至達到平坦，最終數(shù)據(jù)量已經(jīng)足以覆蓋樣品中的大多數(shù)細菌序列，本實驗結(jié)果能夠進行下一步數(shù)據(jù)分析。圖2b表明，各組樣品的細菌多樣性存在顯著差異（P＜0.05），Shannon指數(shù)多樣性大小為CD＜ RD＜SZ＜MC。圖2c比較了4 組樣品的β多樣性，4 組樣品各點聚集在一定的區(qū)域，SZ組比較分散，說明SZ組內(nèi)樣品細菌組成結(jié)構(gòu)存在一定差異。MC和SZ置信橢圓有相交，RD和CD置信橢圓重疊，其細菌組成結(jié)構(gòu)特征都相似，硬殼蛋是提前1 d裝籠的母鴨所產(chǎn)，排出時間不超過16 h，所受外界環(huán)境污染較小，因此其來源與軟殼蛋相似，其細菌組成以鴨蛋形成過程中的細菌侵染為主。

圖2 樣品序列數(shù)據(jù)的多樣性分析Fig.2 Diversity analysis of sequence data in samples

2.3 樣品物種組成分析

基于OTU注釋結(jié)果，4 組共30 個樣品的細菌分屬于56 個門，從圖3a可知，門水平優(yōu)勢物種主要有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota）以及脫硫桿菌門（Desulfobacterota），其中厚壁菌門中SZ和MC組相對豐度大，分別為（17.33±2.36）%、（14.33±2.35）%；變形菌門中RD與CD的相對豐度占比較大，分別為（23.01±0.92）%和（22.5±0.50）%；擬桿菌門為第三優(yōu)勢菌，在SZ、MC、RD及CD組中相對豐度分別為（9.27±3.35）%、（19.33±3.69）%、（3.40±0.21）%和（3.85±0.05）%。本研究中MC及SZ組物種主要屬于厚壁菌門，分別與楊速等[13]研究蛋鴨盲腸細菌組成以及Su Yuan等[14]研究蛋雞生殖道微生物菌群的結(jié)果相似。RD及CD組物種主要屬于變形菌門，這與丁金梅[15]研究結(jié)果相似。

圖3 樣品不同水平物種組成分析Fig.3 Analysis of bacterial species composition in samples

在檢測到的1319 個細菌屬中，厚壁菌門270 個屬、變形菌門316 個屬、擬桿菌門146 個屬。如圖3b所示，優(yōu)勢菌屬有擬桿菌屬（Bacteroides）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、巨單胞菌屬（Megamonas）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）以及叢毛單胞菌屬（Comamonas）等。雖然α多樣性分析表明RD、CD種群多樣性大于MC、SZ，但相對豐度值排在前48 位的屬水平物種中，MC、SZ均勻度更好。MC中的巨單胞菌屬為一類化能有機營養(yǎng)型細菌，能發(fā)酵各種碳水化合物形成終產(chǎn)物乙酸、丙酸和乳酸等；考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）為專性厭氧和革蘭氏陰性的腸道有益細菌，可利用琥珀酸，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（乙酸鹽和丙酸鹽）；革蘭氏陽性厭氧菌扭鏈瘤胃球菌屬（Ruminococcus torquesgroup）為消化降解的關鍵菌，曾被報道為孵化機孵化仔雞盲腸的優(yōu)勢菌屬[16]；穆齊螺旋菌（Mucispirillum）定植于腸道黏膜層，可抵抗沙門氏菌增殖。SZ中顯著富集的有彎曲桿菌屬、未分類菌屬的毛螺菌科（unclassified Lachnospiraceae）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）和羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）等，大部分為有利于機體正常功能的生殖道定植細菌屬。而RD、CD除假單胞菌屬占總豐度的19.01%（相對豐度分別為21.81%、16.19%）、不動桿菌屬占總豐度的10.01%（相對豐度分別為8.85%、11.05%）、未分類的腸桿菌科以及叢毛單胞菌屬占明顯優(yōu)勢外，其余屬的相對豐度較小，有約47.35%～49.28%的屬水平物種相對豐度小于1%，其中的明串珠菌屬（Trichococcus），可利用多種碳水化合物發(fā)酵，產(chǎn)物主要為乳酸、乙酸和甲酸等，在低溫下也能生長；片球菌屬是人體有益菌，包含的兩個種乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和戊糖片球菌于2010年衛(wèi)生部明確可用于食品的菌種。這說明RD、CD的屬水平物種組成更為復雜。

統(tǒng)計各組樣本種水平上的物種豐度均值，通過熱圖可視化方法直觀研究群落組成，圖3c顯示，種水平總豐度前50的物種和科水平物種層級聚類，左側(cè)不同顏色圖例代表不同的科水平物種。4 組樣品中共檢測到2408 個細菌種，分屬于毛螺菌科62 個種，瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）41 個種，噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）32 個種，厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）28 個種，叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）25 個種，擬桿菌科（Bacteroidaceae）18 個種等。熱圖中60%的物種沒有得到明確的種分類（unclassified）。如圖3c所示，層級聚類分析可將物種分為A、B兩大類，A大類的17 個種主要來源于變形菌門的不同科，RD、CD樣品的豐度值明顯大于SZ和MC，可見他們是影響這些物種聚類結(jié)果的主要因素。縱向觀察熱圖，從條帶顏色由綠色漸變?yōu)榧t色的變化可知，4 組樣品豐度大小的順序為CD＞RD＞ SZ＞MC。將A大類再聚類分為兩個部分，第1部分中包含了14 個細菌種，叢毛單胞菌科有3 個種，其中睪酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）為條件致病菌且具有多重耐藥性，同時對類固醇化合物具有降解作用；毛螺菌科的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）是對人體有益的乳酸菌，潛在生理活性包括抗炎抑菌、抗氧化和降血糖等；根瘤菌科（Rhizobiaceae）馬爾他布魯氏桿菌（Brucella melitensis）為人畜共患致病菌，不耐高溫但傳染性強，布魯氏病已成為我國乙類傳染病，導致長期發(fā)熱乏力、關節(jié)痛等癥狀。第2部分雖然只有3 個種即假單胞菌、不動桿菌和腸桿菌，并且在屬或科水平上均為unclassified，但它們都是各組樣品中豐度值最大的種，尤其在RD、CD中占絕對優(yōu)勢。假單胞菌、不動桿菌和腸桿菌分別屬于變形菌門的假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、莫拉菌科（Moraxellaceae）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae），均為條件性致病菌，當人體機能免疫功能低下時能引起機體感染，同時具有產(chǎn)腐敗酶能力[17]，對鴨蛋品質(zhì)及貨架期有潛在的危害，如假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶及嗜鐵素導致蛋白質(zhì)物質(zhì)腐敗并形成生物膜[18]。B大類包含的細菌種較多，大部分為unclassified或uncultured的物種，并且多為厭氧菌，豐度值表明主要是MC、SZ影響了這些物種的聚類結(jié)果。層級聚類將B大類再分為3 部分時，第1部分僅為加拿大彎曲桿菌（Campylobacter canadensis）1 個種，主要存在于SZ樣品中，研究報道目前彎曲菌屬中已鑒定19 個種，其中以空腸彎曲菌（C.jejuni）和結(jié)腸彎曲菌（C.coli）對人的感染最為普遍，是引起人類細菌性腹瀉的主要原因，為此人們對畜禽腸道內(nèi)彎曲菌特別是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌也進行了研究[19-20]，但加拿大彎曲桿菌鮮見報道。第2部分同樣在SZ樣品中占優(yōu)勢，共包括2 個種，其中的Caecibacterium sporoformans極為少見，是近期報道[21]從肉雞盲腸內(nèi)容物中分離出的新種，為一種嚴格厭氧的革蘭氏染色陰性桿菌，有芽孢、不運動、過氧化氫酶陽性和氧化酶陰性，用梭狀芽孢桿菌增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)產(chǎn)生丁酸作為主要的代謝最終產(chǎn)物，其他生物學特性有待進一步研究；伯克霍爾德氏菌科（Burkholderiaceae）的皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）被稱為環(huán)境中無所不在的水生細菌，經(jīng)馴化對重金屬鎘及苯酚有較強的降解能力[22]，但也是條件致病桿菌，能導致生物機體神經(jīng)源性損害、呼吸困難等。第3部分中種類多且來源復雜，涉及擬桿菌門及厚壁菌門的30 個科，可以進一步層級聚類為多級和多個分支，優(yōu)先聚類的可可拉擬桿菌DSM-17136（Bacteroides coprocolaDSM 17136）和未分類細菌種的副擬桿菌屬（uncultured bacteriumParabacteroides）、未分類種的福涅拉氏菌屬（unclassifiedFournierella）和未分類種的考拉桿菌屬（unclassifiedPhascolarctobacterium）、未分類種的擬桿菌目（uncultured bacterium Bacteroidales）和致命梭桿菌ATCC-9817（Fusobaterium mortiferumATCC 9817），3 組僅6 個細菌種多達11 層級；另外，第3類中MC豐度值最大具有明顯優(yōu)勢，如普雷沃氏菌屬（Prevotella）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）等被稱為腸道重要基石菌屬。物種組成分析結(jié)果表明樣品細菌種群復雜，但絕大部分為非致病性細菌。

2.4 樣品細菌的基因功能預測

使用PICRUSt軟件對4 組樣品16S rDNA測序結(jié)果進行功能預測。根據(jù)抽平后的OTU豐度表，分別從PICRUSt儲存庫中配對其COG家族信息和PICRUSt Module信息并計算功能信息豐度。由圖4a可知，所有樣本的COG功能組成較為相似，主要有氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝（E）、翻譯轉(zhuǎn)錄（K）、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換（C）、碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝（G）、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝（P）和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝（I）等。其中RD和CD樣品涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝（I）、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換（C）以及未知的功能（S）的豐度大，而在CM、SZ中涉及碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝（G）和翻譯轉(zhuǎn)錄（K）的COG功能信息豐度較高。

圖4 COG功能和KEGG Module功能預測Fig.4 COG function and KEGG Module function prediction

根據(jù)KEGG Module數(shù)據(jù)庫中有一系列用大寫字母M和數(shù)字標識的功能單元用于基因組注釋和生物學解釋。圖4b選取了KEGG Module功能信息豐度為前20的功能單元，以氣泡大小表示豐度值大小。可知，4 組樣品有很多功能單元的豐度基本相同，這些共有的功能維持細菌的正常生命活動。例如，糖酵解（M00001）使得大分子物質(zhì)降解，獲得分解產(chǎn)物和能量，組氨酸生物合成（M00026）能為細菌生長提供生長因子，糖異生協(xié)助氨基酸代謝等等，同時他們也會使內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，導致蛋內(nèi)容物腐?。幌鄬Χ?，CD組和RD組比MC組、SZ組的氣泡多氣泡大，表明其功能豐度大，尤其是脂肪酸的生物合成（M00144）、血紅素生物合成（M00121）、醌氧化還原酶（M00374）、二羧酸羥基丁酸酯循環(huán)（M00083）、庚二酰-ACP生物合成（M00572）幾乎是CD組和RD組獨有的功能單元，其中亞鐵血紅素生物（M00121）是病原菌生存所需的主要鐵離子來源。

這些數(shù)據(jù)表明產(chǎn)蛋母鴨內(nèi)組織樣品和所產(chǎn)鴨蛋的功能預測結(jié)果相似，且代謝、遺傳信息是檢測樣品中的主要功能，說明其蛋鴨的內(nèi)環(huán)境功能穩(wěn)態(tài)傳遞到鴨蛋，并影響鴨蛋品質(zhì)或傳遞子代胚胎的內(nèi)環(huán)境中。鑒于PICRUSt功能預測的局限性，4 組樣品的內(nèi)生菌屬基因功能尚未完全清楚，有待進一步探究。

根據(jù)樣品中細菌DNA的有效序列，使用BugBase工具進行表型預測，利用Kruskal-Wallis秩和檢驗比較各組樣品8 大類表型的差異性，進行物種-表型貢獻度分析，圖5分別對8 大類表型貢獻度高的物種逐一比較。革蘭氏陽性主要貢獻度物種為未分類菌屬的毛螺菌科（48.11%）以及扭鏈瘤胃球菌屬、未分類屬的顫螺菌科（unclassified Oscillospiraceae）、塞利單胞菌屬（Sellimonas）等；革蘭氏陰性表型主要貢獻度物種為假單胞菌屬（34.46%）、擬桿菌屬（21.17%）和叢毛單胞菌屬等。MC和SZ組物種厭氧表型豐度高，分別為（43.6±0.95）%和（37.53±2.35）%，主要貢獻度物種與革蘭氏陰性物種相似，且還含有擬桿菌屬和巨單胞菌屬。RD與CD組物種在致病性和氧化脅迫耐受的表型相對豐度較高。圖中顯示對致病性表型貢獻的物種主要為假單胞菌屬、未分類屬的腸桿菌科、叢毛單胞菌屬和羅爾斯通氏菌屬等，與表達氧化脅迫耐受表型的細菌物種組成相似，氧化脅迫會產(chǎn)生活性氧，氧化損傷生物分子，破壞細胞的新陳代謝。RD和CD組不同表型的細菌種類相同且豐度比例相似，另生物膜形成和移動元件表型豐度較高于MC和SZ組樣品BugBase 表型。

圖5 屬水平物種-表型貢獻度柱狀圖Fig.5 Bar graph of genus-level species-phenotype contribution degree

2.5 鴨蛋內(nèi)容物與盲腸和生殖道細菌類群相關性分析

基于屬水平物種繪制?；鶊D（圖6a），結(jié)果顯示MC和SZ對CD和RD種屬的重疊率在13.84%～24.95%之間。RD、CD的占比組成相似，其中SZ與RD和CD分別為23.72%和24.95%，略高于MC，表明SZ菌群比MC菌群對蛋內(nèi)容物（RD、CD）的細菌來源和組成影響更大。

圖6 樣品屬水平物種相關性分析Fig.6 Correlation analysis of genus-level bacteria in samples

4 組樣品擁有102 個共有菌屬，相對豐度前50 位的共有菌屬在各樣品中的占比見圖6b。MC與SZ、RD與CD共有菌屬相對豐度大小的排序相似，MC與SZ中占比最大的是擬桿菌屬，其相對豐度值分別為35.24%和20.08%，擬桿菌屬人和動物腸道的正常菌群與人類具有共生關系，有助于分解食物并產(chǎn)生身體所需的營養(yǎng)和能量，然而，當擬桿菌屬進入到除胃腸區(qū)域以外的身體部位，可造成危害。位居其次的為巨單胞菌屬、未分類屬的顫螺菌科、未分類屬的毛螺菌科和分別排在第5的脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）與罕見小球菌屬。RD與CD中相對豐度占比前3的共有菌屬相同，為變形菌門的假單胞菌屬、不動桿菌屬和厚壁菌門中未分類屬的腸桿菌科，這些物種產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的能力強，有的甚至能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶及磷脂酶，對鴨蛋品質(zhì)及貨架期有潛在的危害。隨后RD組與CD組分別有艱難桿菌屬（Mogibacterium）、擬桿菌屬和乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）相對豐度較高，艱難桿菌屬被報道為與口腔疾病相關的口腔細菌[23]；腸球菌屬是家禽中常見的病原體之一，可感染雞胚和雛雞，也與人類疾病密切相關。另外，相對豐度較小的副擬桿菌屬占比2.19%，可消耗琥珀酸鹽，從而以抑制部分梭菌屬（Clostridium）的生長；而丹毒梭狀芽孢桿菌屬（Erysipelatoclostridium）、塞利單胞菌屬與柯林斯氏菌屬（Collinsella）等在動物腸道和生殖道偶有報道[24]。他們對產(chǎn)蛋鴨的健康和蛋品質(zhì)都有一定的影響。

在屬水平上利用LEfSe得到顯著作用菌屬（LDA值范圍2～5），4 組樣品的1319 個細菌屬中有155 個顯著作用菌屬，其中RD 56 個、CD 58 個、MC 36 個、SZ 52 個。再使用FastTree軟件通過選擇屬水平上分類信息對應序列的堿基，揭示出菌屬進化順序。根據(jù)最大似然法構(gòu)建進化樹與物種豐度組合圖。如圖7所示，左邊為系統(tǒng)發(fā)生進化樹，樹枝長度為兩個物種間的進化距離，右邊柱狀圖展示的是物種在不同分組中的reads占比，不同顏色框內(nèi)為對應樣品的部分顯著作用細菌。可以發(fā)現(xiàn)這些細菌分別分布在不同的分支，分屬于厚壁菌門，變形菌門和擬桿菌門且具有同源性。MC和SZ組中顯著作用細菌主要存在厚壁菌門和不動桿菌門，RD和CD顯著作用菌屬在變形菌門內(nèi)聚集，位于進化分支末端，與組織樣品保持一定的進化關系。樣品細菌菌群中相對豐度占比最高的為擬桿菌屬，位于進化樹前端，說明擬桿菌屬與樣品中其他物種基因序列具有同源性。由此分析，蛋內(nèi)容物的細菌物種與產(chǎn)蛋母鴨具有進化關系。

圖7 物種系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree at the genus level

3 討論

雞鴨等家禽屬于卵生動物，胚胎在卵中發(fā)育，因此雌性家禽的生殖道不是胚胎發(fā)育的場所，而是完整的卵（蛋）或受精卵的形成部位，包括蛋黃（卵巢）、蛋白（膨大部）、蛋殼膜（峽部）和蛋殼（子宮）等結(jié)構(gòu)的形成[25]。病理情況下，侵染生殖道不同部位的致病性細菌菌群可以直接傳遞到蛋黃、蛋白、蛋殼膜和蛋殼中，如Gantois等[26]發(fā)現(xiàn)當沙門氏菌感染雞的子宮、峽部和膨大部后，所形成雞蛋的蛋殼、蛋膜和蛋白中也會存在沙門氏菌。然而，正常情況下是否有非致病性細菌菌群存在于蛋的形成過程中鮮見報道。在人類及哺乳動物生殖道細菌菌群研究中，人們從產(chǎn)后30～50 d健康奶牛子宮頸口采集的黏液中分離純化得到乳酸菌[27]；并報道人、豬、犬、猴生殖道從菌群豐富度和多樣性上均無顯著差異，門水平上主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門[24]；另有研究表明，男女泌尿生殖道中均以乳桿菌屬占優(yōu)勢，而且已經(jīng)明確乳酸桿菌分解陰道上皮細胞中糖原產(chǎn)生乳酸，使陰道的pH值降低起到自凈作用和維持陰道微生態(tài)平衡[28]。生殖道中存在與宿主相互依賴、彼此得益的定居菌群和由非致病性或潛在致病性的細菌菌群所組成的暫居菌群，對宿主的生長繁殖和機體健康產(chǎn)生重要影響。本研究從健康母鴨生殖道樣品的菌落總數(shù)為4.70×107CFU/g，說明鴨蛋不是在無菌環(huán)境中形成，高通量測序分析結(jié)果表明其菌群結(jié)構(gòu)與上述人及哺乳動物的研究報道相似，并非致病性細菌菌群，而且本研究蛋（硬殼蛋＋軟殼蛋）內(nèi)容物及生殖道細菌物種重疊率達24.35%，由此可理解為蛋內(nèi)容物的一部分細菌來源于母體的生殖道。

盲腸菌群是動物消化道內(nèi)各種細菌菌群的復雜生態(tài)系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)和功能對宿主自身營養(yǎng)物質(zhì)的消化、代謝、免疫功能以及生長繁殖都起著重要作用，盲腸菌群的相關研究已經(jīng)成為熱點，開展了人類、實驗動物和豬、牛、禽類等多種食品動物腸道細菌種群多樣性分析、功能預測以及影響因素的研究[29-30]。同時，人們進一步研究認為盲腸菌群定植可能始于宮內(nèi)時期。子代腸道菌群定植過程可能是在生產(chǎn)前由胎盤或羊水中獨特的細菌種群啟動，出生后母體和后代之間通過母乳繼續(xù)維持這種聯(lián)系，從母體轉(zhuǎn)移到嬰兒的細菌種群構(gòu)成了嬰兒最初的胃腸微生物系統(tǒng)[31]。母雞生殖道中一些細菌種群可通過蛋清（卵蛋白）轉(zhuǎn)移到胚胎，構(gòu)成胚胎腸道細菌的大部分種群[32]。通過研究母雞、雞胚和仔雞腸道菌群以及母雞生殖道不同部位的菌群，了解到母體腸道和生殖道細菌種群與胚胎發(fā)育、蛋產(chǎn)量關系密切[33]。另外在前期研究中發(fā)現(xiàn)在鴨蛋殼表面細菌中有腸桿菌屬、腸球菌屬以及梭菌屬等與蛋內(nèi)容物細菌相似[34]。本研究結(jié)果顯示母鴨體內(nèi)軟殼蛋蛋內(nèi)容物中存在大量的細菌基因序列，其中部分細菌種群與母鴨盲腸、生殖道菌群密切相關，物種重疊率分別達13.84%、23.72%。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)鴨蛋內(nèi)容物的顯著作用細菌屬群位于鴨體組織中細菌屬群的進化分支中，具有一定的親緣關系，且均與盲腸的顯著作用菌屬中擬桿菌屬具有同源性。健康產(chǎn)蛋母鴨盲腸、生殖道的細菌是構(gòu)成鴨蛋內(nèi)容物非致病性細菌種群的重要來源之一。

本研究結(jié)果表明健康母鴨蛋內(nèi)容物中含有一定數(shù)量的細菌基因序列，而菌落總數(shù)數(shù)量較少，這可能因為鮮鴨蛋的抑菌物質(zhì)活性強。如果貯藏條件延長或改變，蛋內(nèi)容物中細菌能迅速生長繁殖，導致品質(zhì)下降[35]。另外，本研究得到的細菌中大部分為為非致病性種群，可能對母體甚至受精卵、胚胎不會造成危害，甚至有益無害，因為研究報道在飼料中添加有益菌，能調(diào)節(jié)母禽腸道菌群結(jié)構(gòu)，進而提高禽蛋品質(zhì)，例如張偉等[36]在基礎飼糧中添加含有丁酸梭菌和屎腸球菌的復合微生態(tài)制劑，發(fā)現(xiàn)顯著提高了雞蛋的蛋黃重和哈夫值；張茜等[37]將丁酸梭菌聯(lián)合竹醋液加入飼糧，以改善蛋殼厚度、蛋殼強度和和腸道功能。但是作為食品鴨蛋，由于在貯藏期間這些細菌的大量繁殖將導致蛋品腐敗變質(zhì)，縮短鮮蛋保質(zhì)期；鴨蛋中所含細菌的種類和數(shù)量在加工過程中對其品質(zhì)均有一定的影響。如蛋內(nèi)所含的變形菌門弧菌屬的麥氏弧菌（Vibrio metschnikovii）能在高堿環(huán)境下生長，具有產(chǎn)氣能力，導致皮蛋“爆蛋”[38]。鴨蛋蛋黃所含金屬離子的卵黃高磷蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，當增加腸道有益菌群時，機體合成更多的卵黃蛋白原進入卵子，卵黃高磷蛋白在咸鴨蛋加工過程中與Fe、S2-以及色素的共同作用增加蛋黃黑圈率[39]。因此，要加強對蛋鴨養(yǎng)殖的飼料管理和環(huán)境衛(wèi)生控制，提高蛋鴨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，延長其貯藏期，保障食品的安全。此外，應進一步研究有關鴨蛋內(nèi)容物非致病性細菌的生物學特性，以優(yōu)化鴨蛋制品加工工藝，從而生產(chǎn)出更加優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。

4 結(jié)論

以健康產(chǎn)蛋母鴨及其同批所產(chǎn)鴨蛋為對象開展研究，結(jié)果顯示，產(chǎn)蛋母鴨盲腸和生殖道組織與鴨蛋內(nèi)容物的菌群結(jié)構(gòu)復雜并具有重疊性，蛋內(nèi)容物含有與母鴨盲腸、生殖道相同的細菌菌屬，而體內(nèi)軟殼蛋與排出后硬殼蛋中細菌菌群結(jié)構(gòu)相似。各組樣品的細菌基因組DNA序列表達功能相似，均具有較強的代謝功能，且這些細菌具有一定的親緣關系和同源性。在健康產(chǎn)蛋母鴨組織中大部分細菌為非致病性種群，可能對母體不會造成危害，但是進入鴨蛋后，細菌會迅速生長，造成蛋腐敗變質(zhì)，降低鴨蛋品質(zhì)，縮短貯藏期。本研究表明，鴨蛋不是在無菌環(huán)境中形成，鮮鴨蛋中有細菌存在；健康產(chǎn)蛋母鴨生殖道和盲腸內(nèi)的細菌菌群與鴨蛋內(nèi)容物非致病性細菌來源有關，并對貯藏期鴨蛋腐敗變質(zhì)有 潛在影響。