黨 輝,陳 佩
(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710119;2.陜西開放大學(xué)中瑞旅游與酒店管理學(xué)院,陜西 西安 710119)
醪糟又稱“甜酒”,是一種以糯米為主要原料發(fā)酵而成的傳統(tǒng)美食,其在我國(guó)陜西等地區(qū)自古就有釀造和食用的傳統(tǒng)[1]。禮泉醪糟作為醪糟的典型代表,源于漢而盛于唐,其釀造歷史悠久、口味香甜、酒香醇厚,被譽(yù)為“三秦第一家”[2]。醪糟在發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件上與米酒有異曲同工之妙,均可被稱為“酒釀”或“甜酒”,常被進(jìn)行比較研究[3]。值得注意的是,醪糟和米酒的制作過(guò)程均有微生物參與[4],且兩者發(fā)酵過(guò)程和品質(zhì)形成與微生物之間存在緊密的聯(lián)系[5]。
近年來(lái),國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的學(xué)者針對(duì)醪糟或米酒展開了一系列研究[6]。向凡舒等[7]利用湖北孝感和四川成都地方的米酒曲進(jìn)行了米酒的發(fā)酵制作,并從米酒中分離鑒定出77 株乳酸菌,鑒定發(fā)現(xiàn)其主要隸屬于片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)等。王艷萍等[8]對(duì)荊州米酒中的微生物進(jìn)行了分離純化,發(fā)現(xiàn)毛霉屬(Mucor)和酵母菌屬(Saccharomyces)是米酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。但上述結(jié)論受限于純培養(yǎng)的制約,僅能對(duì)環(huán)境樣本中極少量的微生物進(jìn)行鑒定[9]。而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的迅速降低,人們?cè)絹?lái)越傾向于通過(guò)測(cè)序技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究[10]。Wang Chunxiao等[11]通過(guò)測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同米酒曲中的真菌構(gòu)成存在較大差異,但整體來(lái)說(shuō)均以根霉菌屬(Rhizopus)和Saccharomyces為主;向凡舒等[12]通過(guò)對(duì)宣恩米酒中微生物多樣性進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)其主要以Pediococcus為主,其次依次是芽孢桿菌(Bacillus)和Lactobacillus等。禮泉醪糟作為西北地區(qū)一項(xiàng)傳統(tǒng)的發(fā)酵美食,蘊(yùn)含著豐富的微生物資源,但卻少有研究對(duì)其微生物資源進(jìn)行解析和收集,這可能導(dǎo)致微生物資源的大量丟失。
本研究以陜西咸陽(yáng)禮泉的10 份農(nóng)家自制醪糟為研究對(duì)象,使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行解析,并結(jié)合PICRUSt和BugBase等生物信息學(xué)軟件對(duì)醪糟中細(xì)菌的功能和表型進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)本研究的開展,旨在為禮泉醪糟中微生物資源的搜集提供一定理論依據(jù),并為禮泉醪糟的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。
醪糟 陜西省咸陽(yáng)市禮泉縣的農(nóng)戶。
DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司;dNTPs Mix、5×TransStartTMFastPfuBuffer、FastPfuFly DNA Polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA 1000試劑盒 美國(guó)Agilent公司。
ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司;vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)AB公司;R950機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell公司;MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。
1.3.1 醪糟樣品的采集
從陜西省咸陽(yáng)市禮泉縣的農(nóng)戶家中共收集10 份農(nóng)家自制的醪糟樣本(編號(hào)LQ1~LQ10)。所有醪糟樣本均以糯米為原料,接種自家自制酒曲,于28 ℃左右發(fā)酵2 d左右而成。采用無(wú)菌勺將醪糟攪拌均勻后挖取100 g左右裝入無(wú)菌無(wú)酶的離心管中,封蓋后置于低溫保藏箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 醪糟樣品中宏基因組DNA的提取、擴(kuò)增和測(cè)序
稱取3 g左右醪糟樣本于滅菌的研缽中,充分研磨至糊狀。使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒,對(duì)研磨后醪糟樣本中微生物的宏基因組DNA進(jìn)行提取,并使用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢驗(yàn),將提取合格的DNA(OD260nm/OD280nm值在1.8~2.0)貯存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
使用帶有7 個(gè)堿基核苷酸標(biāo)簽(barcode)的ITS3F/ITS4R和338F/806R引物,參照文獻(xiàn)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增條件和體系對(duì)真菌ITS區(qū)和細(xì)菌16S rRNA V3~V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13-14],使用微量紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。最后,將檢驗(yàn)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,使用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。
1.3.3 生物信息學(xué)分析
根據(jù)雙端序列的重疊區(qū)域?qū)ο聶C(jī)序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控,并基于barcode信息將每條序列分配到不同樣本中以得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)集[15]。本研究基于QIIME(v1.75)平臺(tái)對(duì)醪糟樣本中微生物構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析。首先,參照Yang Chengcong等[9]奶酪中細(xì)菌多樣性的分析步驟對(duì)醪糟樣本中細(xì)菌構(gòu)成和多樣性進(jìn)行分析,接著參照王玉榮等[16]鲊廣椒中真菌多樣性的分析步驟對(duì)醪糟樣本中真菌構(gòu)成和多樣性進(jìn)行分析。本研究將不同數(shù)據(jù)庫(kù)與代表性序列進(jìn)行了同源性比對(duì)[17-18],通過(guò)Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)對(duì)醪糟中微生物的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估,并基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)對(duì)醪糟樣品中微生物的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
依據(jù)Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)高質(zhì)量的16S rRNA序列進(jìn)行聚類和注釋,使用PICRUSt軟件對(duì)禮泉醪糟樣品中細(xì)菌的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè),并參照蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋[19]。將對(duì)構(gòu)建的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)和分組文件上傳在線網(wǎng)站進(jìn)行細(xì)菌表型預(yù)測(cè)(https://bugbase.cs.umn.edu/)[20]。
基于Bray-Curtis距離對(duì)醪糟樣本中微生物群落的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCoA;基于Procrustes分析對(duì)醪糟樣品中細(xì)菌和真菌的一致性進(jìn)行研究;使用Wilcoxon test對(duì)α多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)菌群、細(xì)菌功能和表型之間的差異性進(jìn)行檢驗(yàn);對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬之間的Spearman相關(guān)性進(jìn)行分析。所用分析和可視化均使用R軟件完成。
PCoA作為一種非約束性的數(shù)據(jù)降維方法,常被用來(lái)研究樣本中微生物群落的差異性或相似性。本研究基于Bray-Curtis距離對(duì)醪糟中微生物差異性進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖1所示。
圖1 基于Bray-Curtis距離的PCoA(A)和Procrustes分析(B)Fig.1 Principal coordinate analysis (A) and Procrustes analysis (B) based on Bray-Curtis distance
由圖1A可知,PC1的貢獻(xiàn)率為40.75%,而PC2的貢獻(xiàn)率為35.06%,兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率為75.81%。由此可見,前2 個(gè)PC能夠代表不同樣本間群落結(jié)構(gòu)的大部分差異。同時(shí),不同農(nóng)戶家中自制的醪糟在空間分布上呈現(xiàn)出一定的分離和聚類趨勢(shì)。因此,本研究以PC1為分組依據(jù)將10 份醪糟分為兩組,其中LQ1、LQ2、LQ3、LQ9和LQ10隸屬于A組,而其他樣本則隸屬于B組。通過(guò)Procrustes分析對(duì)醪糟樣本中細(xì)菌和真菌的一致性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖1B),禮泉醪糟中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與真菌群落結(jié)構(gòu)之間不具有顯著一致性(P=0.40)。由此說(shuō)明,醪糟樣本中的細(xì)菌和真菌可能相互影響較小。基于Bray-Curtis距離兩組樣品細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析如圖2所示。
圖2 基于Bray-Curtis距離細(xì)菌(A)和真菌(B)的PCoAFig.2 Principal coordinate analysis of bacterial (A) and fungal (B) communities based on Bray-Curtis distance
由圖2A可知,隸屬于A組的醪糟在4 個(gè)象限均有分布,而隸屬于B組的醪糟樣本則分布在第2、3和4象限,且隸屬于兩組的醪糟樣本在空間上存在較大重合區(qū)域。由此可見,隸屬于不同分組醪糟中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。由圖2B可知,隸屬于A組的醪糟全部位于Y軸正方向,而隸屬于B組的醪糟則全部位于Y軸負(fù)方向,兩組醪糟在空間上具有明顯分離趨勢(shì),這也表明隸屬于不同分組醪糟中真菌的群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。綜上所述,真菌可能是造成醪糟中微生物群落整體結(jié)構(gòu)差異較大的原因之一。在對(duì)醪糟中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對(duì)不同分組中微生物的α多樣性進(jìn)行了比較分析,其α多樣性指數(shù)的比較箱型圖如圖3所示。
由圖3可知,A組醪糟中細(xì)菌的Chao1指數(shù)與B組無(wú)顯著差異(P>0.05),而Shannon指數(shù)卻顯著高于B組(P<0.05);但A組醪糟中真菌的Chao1指數(shù)顯著高于B組(P<0.05),而Shannon指數(shù)與B組無(wú)顯著差異(P>0.05)。Chao1指數(shù)常被用來(lái)評(píng)估環(huán)境中微生物群落的豐富度,而Shannon指數(shù)則常被用來(lái)評(píng)估環(huán)境中微生物群落的均勻度。由此可見,A組醪糟中細(xì)菌的豐富度與B組無(wú)顯著差異(P>0.05),但其細(xì)菌均勻度卻顯著高于B組(P<0.05);而在真菌上則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。
在對(duì)醪糟中微生物多樣性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對(duì)醪糟中優(yōu)勢(shì)菌門和優(yōu)勢(shì)菌屬(平均相對(duì)豐度大于1%)進(jìn)行了比較分析[16],其結(jié)果如表1所示。
表1 醪糟中優(yōu)勢(shì)菌門和菌屬的比較分析Table 1 Comparative analysis of dominant microbial phyla and genera in Laozao
由表1可知,禮泉醪糟中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria),平均相對(duì)豐度分別為97.20%和2.29%,其累計(jì)平均相對(duì)豐度高達(dá)99.49%;而優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有5 個(gè),其分別為L(zhǎng)actobacillus(85.25%)、Pediococcus(5.50%)、明串珠菌屬(Leuconostoc,1.68%)、鏈球菌屬(Streptococcus,1.63%)和乳球菌屬(Lactococcus,1.12%)。由表1 亦可知,禮泉醪糟中的優(yōu)勢(shì)真菌門為毛霉菌門(Mucoromycota)和子囊菌門(Ascomycota),平均相對(duì)含量分別為56.90%和43.10%,其累計(jì)平均相對(duì)豐度高達(dá)99.99%;而優(yōu)勢(shì)真菌屬有4 個(gè),其分別為Rhizopus(56.66%)、Saccharomyces(23.28%)、覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis,12.24%)和假絲酵母屬(Candida,5.35%)。經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Pediococcus、Mucoromycota和Rhizopus在A組醪糟中的相對(duì)豐度顯著高于B組,而Ascomycota則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。由此可見,醪糟中真菌的組間差異明顯大于細(xì)菌。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對(duì)醪糟中微生物的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了分析,其結(jié)果如圖4所示。
圖4 醪糟中優(yōu)勢(shì)菌屬的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of dominant microbial genera in Laozao
由圖4可知,醪糟樣本中微生物之間相關(guān)性關(guān)系整體較弱,其中Lactobacillus和Saccharomycopsis,以及Leuconostoc和Lactococcus之間呈顯著正相關(guān)(r>0.5,P<0.05),而Streptococcus和Saccharomycopsis之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.5,P<0.05)。而值得注意的是,細(xì)菌內(nèi)部之間大多呈正相關(guān),真菌內(nèi)部之間無(wú)顯著相關(guān)性,而細(xì)菌和真菌之間呈負(fù)相關(guān)。
隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,科研人員可以通過(guò)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)環(huán)境樣本中細(xì)菌的功能和表型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。本研究首先使用PICRUSt軟件對(duì)醪糟中細(xì)菌的功能基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并基于直系同源集(Clusters of Orthologous Groups,COG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行注釋。醪糟中細(xì)菌功能類別的比較分析如圖5所示。
圖5 醪糟中細(xì)菌功能類別的比較分析Fig.5 Comparative analysis of bacterial functional genes in Laozao
本研究從禮泉醪糟細(xì)菌中共注釋到4021 個(gè)COG,其分別隸屬于23 個(gè)一級(jí)功能層。由圖5可知,一級(jí)功能層中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝,復(fù)制、重組和修復(fù)在A組醪糟中相對(duì)表達(dá)量顯著低于B組(P<0.05),而轉(zhuǎn)錄在A組醪糟中相對(duì)表達(dá)量顯著低于B組(P<0.05)。而值得注意的是,翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生在醪糟中具有較高表達(dá)量。同時(shí),本研究使用BugBase在線網(wǎng)站對(duì)醪糟中細(xì)菌的表型進(jìn)行了預(yù)測(cè),其結(jié)果如圖6所示。
圖6 醪糟中細(xì)菌表型結(jié)果的比較分析Fig.6 Comparative analysis of bacterial phenotypic data in Laozao
由圖6可知,革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、可移動(dòng)元件和潛在致病性在兩組中存在顯著差異(P<0.05),其中革蘭氏陰性菌和潛在致病性在A組中顯著較高(P<0.05),而革蘭氏陽(yáng)性菌和可移動(dòng)原件在A組中顯著較低(P<0.05)。由此可見,A組和B組醪糟中細(xì)菌在表型上存在較大的差異。
近年來(lái),隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展,越來(lái)越多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品消失在大眾視野之中,而其中所蘊(yùn)含的寶貴微生物資源也隨之消失。受限于傳統(tǒng)的微生物鑒定方法,在對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物構(gòu)成和多樣性進(jìn)行研究時(shí),并不能準(zhǔn)確揭示相關(guān)規(guī)律,這也使得相關(guān)人員無(wú)法準(zhǔn)確解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵機(jī)制。因此,本研究采集了10 份禮泉醪糟,并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,以期為其安全性評(píng)估和工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的理論支持,促進(jìn)我國(guó)相關(guān)食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
禮泉醪糟通常以糯米為主要原料釀制而成,因而其中可能蘊(yùn)含著較為獨(dú)特和多樣的乳酸菌和酵母菌[21]。高通量測(cè)序結(jié)果顯示禮泉醪糟中的細(xì)菌絕大部分隸屬于Firmicutes,且優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus、Pediococcus、Leuconostoc、Streptococcus和Lactococcus,累計(jì)占比高達(dá)95.18%,且優(yōu)勢(shì)菌屬均隸屬于乳酸菌。乳酸菌作為益生菌最大的來(lái)源庫(kù)之一[22],其不僅能將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸,賦予發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味,抑制雜菌和有害菌的生長(zhǎng),且對(duì)于宿主的機(jī)體健康具有重要的意義[23]。王文平等[24]研究發(fā)現(xiàn)南寧地區(qū)米酒曲中以Lactobacillus(占比62.03%)為主,而孝感地區(qū)米酒中則以Weissella(占比50.14%)為主。上述結(jié)果均與本研究存在一定差異,這也說(shuō)明禮泉醪糟具有較為獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu),而制作環(huán)境可能是造成上述菌群差異的主要原因之一[25]。Lactobacillus作為醪糟發(fā)酵過(guò)程中的主要菌屬,不僅將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸,其發(fā)酵過(guò)程還伴隨著乙酸、乙醇和二氧化氮等副產(chǎn)物的產(chǎn)生,賦予禮泉醪糟特殊的口感和風(fēng)味。大量研究證實(shí)了隸屬于Lactobacillus的大量菌株在緩解機(jī)體炎癥和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等方面發(fā)揮著巨大作用[26-27]。在對(duì)醪糟中真菌多樣性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),其優(yōu)勢(shì)真菌屬為Rhizopus、Saccharomyces、Saccharomycopsis和Candida,與大多數(shù)關(guān)于米酒中真菌多樣性研究結(jié)果一致[28]。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)Rhizopus在米酒發(fā)酵過(guò)程中對(duì)淀粉水解起重要作用[29],而酵母菌在酒精產(chǎn)生中十分 重要[30]。由此可見,醪糟中微生物群落在醪糟發(fā)酵和品質(zhì)形成過(guò)程中有重要意義。
通過(guò)對(duì)醪糟中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行降維分析發(fā)現(xiàn)醪糟樣本可明顯劃分為兩個(gè)分組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),兩組中細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異,但真菌的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯分離趨勢(shì),且通過(guò)對(duì)醪糟中優(yōu)勢(shì)菌群的差異分析驗(yàn)證了上述現(xiàn)象。由此可見,禮泉醪糟中細(xì)菌群落的整體結(jié)構(gòu)較為相似,而真菌是造成微生物群落整體差異的主要因素。相關(guān)研究也證實(shí)了真菌可能在醪糟發(fā)酵過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)地位,而細(xì)菌則對(duì)于醪糟的品質(zhì)形成有重要作用。通過(guò)基因功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)A組中細(xì)菌具有較強(qiáng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝能力,這可能會(huì)導(dǎo)致醪糟的整體品質(zhì)存在較大差異[31]。通過(guò)表型預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)A組中細(xì)菌的潛在致病性相對(duì)較高,究其原因可能與農(nóng)家醪糟的制作環(huán)境有關(guān)。綜合采樣信息發(fā)現(xiàn),隸屬于A組醪糟的制作環(huán)境較為開放,主要在陰暗的廚房中發(fā)酵而成,且發(fā)酵過(guò)程中較易受到各種雜菌和有害菌的污染。由此可見,改善傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作環(huán)境,對(duì)產(chǎn)品安全性和優(yōu)良菌株篩選具有重要意義。