禮泉醪糟微生物多樣性分析

黨 輝，陳 佩

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西開放大學(xué)中瑞旅游與酒店管理學(xué)院，陜西 西安 710119）

醪糟又稱“甜酒”，是一種以糯米為主要原料發(fā)酵而成的傳統(tǒng)美食，其在我國陜西等地區(qū)自古就有釀造和食用的傳統(tǒng)[1]。禮泉醪糟作為醪糟的典型代表，源于漢而盛于唐，其釀造歷史悠久、口味香甜、酒香醇厚，被譽為“三秦第一家”[2]。醪糟在發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件上與米酒有異曲同工之妙，均可被稱為“酒釀”或“甜酒”，常被進(jìn)行比較研究[3]。值得注意的是，醪糟和米酒的制作過程均有微生物參與[4]，且兩者發(fā)酵過程和品質(zhì)形成與微生物之間存在緊密的聯(lián)系[5]。

近年來，國內(nèi)越來越多的學(xué)者針對醪糟或米酒展開了一系列研究[6]。向凡舒等[7]利用湖北孝感和四川成都地方的米酒曲進(jìn)行了米酒的發(fā)酵制作，并從米酒中分離鑒定出77 株乳酸菌，鑒定發(fā)現(xiàn)其主要隸屬于片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）等。王艷萍等[8]對荊州米酒中的微生物進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)毛霉屬（Mucor）和酵母菌屬（Saccharomyces）是米酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。但上述結(jié)論受限于純培養(yǎng)的制約，僅能對環(huán)境樣本中極少量的微生物進(jìn)行鑒定[9]。而隨著測序技術(shù)的發(fā)展和測序成本的迅速降低，人們越來越傾向于通過測序技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究[10]。Wang Chunxiao等[11]通過測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同米酒曲中的真菌構(gòu)成存在較大差異，但整體來說均以根霉菌屬（Rhizopus）和Saccharomyces為主；向凡舒等[12]通過對宣恩米酒中微生物多樣性進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)其主要以Pediococcus為主，其次依次是芽孢桿菌（Bacillus）和Lactobacillus等。禮泉醪糟作為西北地區(qū)一項傳統(tǒng)的發(fā)酵美食，蘊含著豐富的微生物資源，但卻少有研究對其微生物資源進(jìn)行解析和收集，這可能導(dǎo)致微生物資源的大量丟失。

本研究以陜西咸陽禮泉的10 份農(nóng)家自制醪糟為研究對象，使用高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行解析，并結(jié)合PICRUSt和BugBase等生物信息學(xué)軟件對醪糟中細(xì)菌的功能和表型進(jìn)行預(yù)測。通過本研究的開展，旨在為禮泉醪糟中微生物資源的搜集提供一定理論依據(jù)，并為禮泉醪糟的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醪糟 陜西省咸陽市禮泉縣的農(nóng)戶。

DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；dNTPs Mix、5×TransStartTMFastPfuBuffer、FastPfuFly DNA Polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 1000試劑盒 美國Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國AB公司；R950機架式服務(wù)器 美國Dell公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 醪糟樣品的采集

從陜西省咸陽市禮泉縣的農(nóng)戶家中共收集10 份農(nóng)家自制的醪糟樣本（編號LQ1～LQ10）。所有醪糟樣本均以糯米為原料，接種自家自制酒曲，于28 ℃左右發(fā)酵2 d左右而成。采用無菌勺將醪糟攪拌均勻后挖取100 g左右裝入無菌無酶的離心管中，封蓋后置于低溫保藏箱中運回實驗室，于-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 醪糟樣品中宏基因組DNA的提取、擴(kuò)增和測序

稱取3 g左右醪糟樣本于滅菌的研缽中，充分研磨至糊狀。使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，對研磨后醪糟樣本中微生物的宏基因組DNA進(jìn)行提取，并使用微量紫外分光光度計對DNA濃度和純度進(jìn)行檢驗，將提取合格的DNA（OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0）貯存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

使用帶有7 個堿基核苷酸標(biāo)簽（barcode）的ITS3F/ITS4R和338F/806R引物，參照文獻(xiàn)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增條件和體系對真菌ITS區(qū)和細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13-14]，使用微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度進(jìn)行檢測。最后，將檢驗合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

根據(jù)雙端序列的重疊區(qū)域?qū)ο聶C序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控，并基于barcode信息將每條序列分配到不同樣本中以得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)集[15]。本研究基于QIIME（v1.75）平臺對醪糟樣本中微生物構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析。首先，參照Yang Chengcong等[9]奶酪中細(xì)菌多樣性的分析步驟對醪糟樣本中細(xì)菌構(gòu)成和多樣性進(jìn)行分析，接著參照王玉榮等[16]鲊廣椒中真菌多樣性的分析步驟對醪糟樣本中真菌構(gòu)成和多樣性進(jìn)行分析。本研究將不同數(shù)據(jù)庫與代表性序列進(jìn)行了同源性比對[17-18]，通過Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)對醪糟中微生物的豐富度和多樣性進(jìn)行評估，并基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）對醪糟樣品中微生物的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

依據(jù)Greengene數(shù)據(jù)庫對高質(zhì)量的16S rRNA序列進(jìn)行聚類和注釋，使用PICRUSt軟件對禮泉醪糟樣品中細(xì)菌的基因功能進(jìn)行預(yù)測，并參照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋[19]。將對構(gòu)建的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和分組文件上傳在線網(wǎng)站進(jìn)行細(xì)菌表型預(yù)測（https://bugbase.cs.umn.edu/）[20]。

1.4 多元統(tǒng)計學(xué)分析

基于Bray-Curtis距離對醪糟樣本中微生物群落的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCoA；基于Procrustes分析對醪糟樣品中細(xì)菌和真菌的一致性進(jìn)行研究；使用Wilcoxon test對α多樣性指數(shù)、優(yōu)勢菌群、細(xì)菌功能和表型之間的差異性進(jìn)行檢驗；對優(yōu)勢菌屬之間的Spearman相關(guān)性進(jìn)行分析。所用分析和可視化均使用R軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 醪糟中微生物多樣性分析

PCoA作為一種非約束性的數(shù)據(jù)降維方法，常被用來研究樣本中微生物群落的差異性或相似性。本研究基于Bray-Curtis距離對醪糟中微生物差異性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 基于Bray-Curtis距離的PCoA（A）和Procrustes分析（B）Fig.1 Principal coordinate analysis (A) and Procrustes analysis (B) based on Bray-Curtis distance

由圖1A可知，PC1的貢獻(xiàn)率為40.75%，而PC2的貢獻(xiàn)率為35.06%，兩者累計貢獻(xiàn)率為75.81%。由此可見，前2 個PC能夠代表不同樣本間群落結(jié)構(gòu)的大部分差異。同時，不同農(nóng)戶家中自制的醪糟在空間分布上呈現(xiàn)出一定的分離和聚類趨勢。因此，本研究以PC1為分組依據(jù)將10 份醪糟分為兩組，其中LQ1、LQ2、LQ3、LQ9和LQ10隸屬于A組，而其他樣本則隸屬于B組。通過Procrustes分析對醪糟樣本中細(xì)菌和真菌的一致性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖1B），禮泉醪糟中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與真菌群落結(jié)構(gòu)之間不具有顯著一致性（P=0.40）。由此說明，醪糟樣本中的細(xì)菌和真菌可能相互影響較小?；贐ray-Curtis距離兩組樣品細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析如圖2所示。

圖2 基于Bray-Curtis距離細(xì)菌（A）和真菌（B）的PCoAFig.2 Principal coordinate analysis of bacterial (A) and fungal (B) communities based on Bray-Curtis distance

由圖2A可知，隸屬于A組的醪糟在4 個象限均有分布，而隸屬于B組的醪糟樣本則分布在第2、3和4象限，且隸屬于兩組的醪糟樣本在空間上存在較大重合區(qū)域。由此可見，隸屬于不同分組醪糟中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)無明顯差異。由圖2B可知，隸屬于A組的醪糟全部位于Y軸正方向，而隸屬于B組的醪糟則全部位于Y軸負(fù)方向，兩組醪糟在空間上具有明顯分離趨勢，這也表明隸屬于不同分組醪糟中真菌的群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。綜上所述，真菌可能是造成醪糟中微生物群落整體結(jié)構(gòu)差異較大的原因之一。在對醪糟中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對不同分組中微生物的α多樣性進(jìn)行了比較分析，其α多樣性指數(shù)的比較箱型圖如圖3所示。

由圖3可知，A組醪糟中細(xì)菌的Chao1指數(shù)與B組無顯著差異（P＞0.05），而Shannon指數(shù)卻顯著高于B組（P＜0.05）；但A組醪糟中真菌的Chao1指數(shù)顯著高于B組（P＜0.05），而Shannon指數(shù)與B組無顯著差異（P＞0.05）。Chao1指數(shù)常被用來評估環(huán)境中微生物群落的豐富度，而Shannon指數(shù)則常被用來評估環(huán)境中微生物群落的均勻度。由此可見，A組醪糟中細(xì)菌的豐富度與B組無顯著差異（P＞0.05），但其細(xì)菌均勻度卻顯著高于B組（P＜0.05）；而在真菌上則呈現(xiàn)相反的趨勢。

2.2 醪糟中微生物構(gòu)成分析

在對醪糟中微生物多樣性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對醪糟中優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬（平均相對豐度大于1%）進(jìn)行了比較分析[16]，其結(jié)果如表1所示。

表1 醪糟中優(yōu)勢菌門和菌屬的比較分析Table 1 Comparative analysis of dominant microbial phyla and genera in Laozao

由表1可知，禮泉醪糟中的優(yōu)勢細(xì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別為97.20%和2.29%，其累計平均相對豐度高達(dá)99.49%；而優(yōu)勢細(xì)菌屬有5 個，其分別為Lactobacillus（85.25%）、Pediococcus（5.50%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，1.68%）、鏈球菌屬（Streptococcus，1.63%）和乳球菌屬（Lactococcus，1.12%）。由表1 亦可知，禮泉醪糟中的優(yōu)勢真菌門為毛霉菌門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量分別為56.90%和43.10%，其累計平均相對豐度高達(dá)99.99%；而優(yōu)勢真菌屬有4 個，其分別為Rhizopus（56.66%）、Saccharomyces（23.28%）、覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis，12.24%）和假絲酵母屬（Candida，5.35%）。經(jīng)Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)，Pediococcus、Mucoromycota和Rhizopus在A組醪糟中的相對豐度顯著高于B組，而Ascomycota則呈現(xiàn)相反的趨勢。由此可見，醪糟中真菌的組間差異明顯大于細(xì)菌。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對醪糟中微生物的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 醪糟中優(yōu)勢菌屬的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of dominant microbial genera in Laozao

由圖4可知，醪糟樣本中微生物之間相關(guān)性關(guān)系整體較弱，其中Lactobacillus和Saccharomycopsis，以及Leuconostoc和Lactococcus之間呈顯著正相關(guān)（r＞0.5，P＜0.05），而Streptococcus和Saccharomycopsis之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r＜-0.5，P＜0.05）。而值得注意的是，細(xì)菌內(nèi)部之間大多呈正相關(guān)，真菌內(nèi)部之間無顯著相關(guān)性，而細(xì)菌和真菌之間呈負(fù)相關(guān)。

2.3 功能和表型預(yù)測

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，科研人員可以通過高通量測序數(shù)據(jù)對環(huán)境樣本中細(xì)菌的功能和表型進(jìn)行預(yù)測分析。本研究首先使用PICRUSt軟件對醪糟中細(xì)菌的功能基因進(jìn)行預(yù)測，并基于直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行注釋。醪糟中細(xì)菌功能類別的比較分析如圖5所示。

圖5 醪糟中細(xì)菌功能類別的比較分析Fig.5 Comparative analysis of bacterial functional genes in Laozao

本研究從禮泉醪糟細(xì)菌中共注釋到4021 個COG，其分別隸屬于23 個一級功能層。由圖5可知，一級功能層中氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝，復(fù)制、重組和修復(fù)在A組醪糟中相對表達(dá)量顯著低于B組（P＜0.05），而轉(zhuǎn)錄在A組醪糟中相對表達(dá)量顯著低于B組（P＜0.05）。而值得注意的是，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生在醪糟中具有較高表達(dá)量。同時，本研究使用BugBase在線網(wǎng)站對醪糟中細(xì)菌的表型進(jìn)行了預(yù)測，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 醪糟中細(xì)菌表型結(jié)果的比較分析Fig.6 Comparative analysis of bacterial phenotypic data in Laozao

由圖6可知，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、可移動元件和潛在致病性在兩組中存在顯著差異（P＜0.05），其中革蘭氏陰性菌和潛在致病性在A組中顯著較高（P＜0.05），而革蘭氏陽性菌和可移動原件在A組中顯著較低（P＜0.05）。由此可見，A組和B組醪糟中細(xì)菌在表型上存在較大的差異。

討論

近年來，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品消失在大眾視野之中，而其中所蘊含的寶貴微生物資源也隨之消失。受限于傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，在對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物構(gòu)成和多樣性進(jìn)行研究時，并不能準(zhǔn)確揭示相關(guān)規(guī)律，這也使得相關(guān)人員無法準(zhǔn)確解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵機制。因此，本研究采集了10 份禮泉醪糟，并結(jié)合高通量測序技術(shù)對其微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以期為其安全性評估和工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的理論支持，促進(jìn)我國相關(guān)食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

禮泉醪糟通常以糯米為主要原料釀制而成，因而其中可能蘊含著較為獨特和多樣的乳酸菌和酵母菌[21]。高通量測序結(jié)果顯示禮泉醪糟中的細(xì)菌絕大部分隸屬于Firmicutes，且優(yōu)勢細(xì)菌屬為Lactobacillus、Pediococcus、Leuconostoc、Streptococcus和Lactococcus，累計占比高達(dá)95.18%，且優(yōu)勢菌屬均隸屬于乳酸菌。乳酸菌作為益生菌最大的來源庫之一[22]，其不僅能將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，賦予發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味，抑制雜菌和有害菌的生長，且對于宿主的機體健康具有重要的意義[23]。王文平等[24]研究發(fā)現(xiàn)南寧地區(qū)米酒曲中以Lactobacillus（占比62.03%）為主，而孝感地區(qū)米酒中則以Weissella（占比50.14%）為主。上述結(jié)果均與本研究存在一定差異，這也說明禮泉醪糟具有較為獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)，而制作環(huán)境可能是造成上述菌群差異的主要原因之一[25]。Lactobacillus作為醪糟發(fā)酵過程中的主要菌屬，不僅將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，其發(fā)酵過程還伴隨著乙酸、乙醇和二氧化氮等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，賦予禮泉醪糟特殊的口感和風(fēng)味。大量研究證實了隸屬于Lactobacillus的大量菌株在緩解機體炎癥和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等方面發(fā)揮著巨大作用[26-27]。在對醪糟中真菌多樣性進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢真菌屬為Rhizopus、Saccharomyces、Saccharomycopsis和Candida，與大多數(shù)關(guān)于米酒中真菌多樣性研究結(jié)果一致[28]。相關(guān)研究已經(jīng)證實Rhizopus在米酒發(fā)酵過程中對淀粉水解起重要作用[29]，而酵母菌在酒精產(chǎn)生中十分 重要[30]。由此可見，醪糟中微生物群落在醪糟發(fā)酵和品質(zhì)形成過程中有重要意義。

通過對醪糟中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行降維分析發(fā)現(xiàn)醪糟樣本可明顯劃分為兩個分組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩組中細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)無顯著差異，但真菌的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯分離趨勢，且通過對醪糟中優(yōu)勢菌群的差異分析驗證了上述現(xiàn)象。由此可見，禮泉醪糟中細(xì)菌群落的整體結(jié)構(gòu)較為相似，而真菌是造成微生物群落整體差異的主要因素。相關(guān)研究也證實了真菌可能在醪糟發(fā)酵過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，而細(xì)菌則對于醪糟的品質(zhì)形成有重要作用。通過基因功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)A組中細(xì)菌具有較強氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝能力，這可能會導(dǎo)致醪糟的整體品質(zhì)存在較大差異[31]。通過表型預(yù)測發(fā)現(xiàn)A組中細(xì)菌的潛在致病性相對較高，究其原因可能與農(nóng)家醪糟的制作環(huán)境有關(guān)。綜合采樣信息發(fā)現(xiàn)，隸屬于A組醪糟的制作環(huán)境較為開放，主要在陰暗的廚房中發(fā)酵而成，且發(fā)酵過程中較易受到各種雜菌和有害菌的污染。由此可見，改善傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作環(huán)境，對產(chǎn)品安全性和優(yōu)良菌株篩選具有重要意義。