復(fù)合香型白酒糧醅機(jī)械化和傳統(tǒng)堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析

程 偉，陳雪峰，陳興杰，周 端，李 娜，潘天全，薛錫佳

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236023；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710021）

糧醅的高溫堆積是醬香、芝麻香等香型白酒重要的釀造工藝，堆積過(guò)程可網(wǎng)羅和富集釀造環(huán)境中的微生物，并形成獨(dú)特且豐富的微生物菌群，進(jìn)而產(chǎn)生多種酶類和風(fēng)味及其前體物質(zhì)。高溫堆積過(guò)程可通過(guò)美拉德反應(yīng)或微生物代謝形成并積累特殊香氣成分，進(jìn)而形成酒體的“醬香、芝麻香”等香氣特征[1]。糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中富集的各類微生物對(duì)白酒釀造均具有重要作用；其中，細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶可分解蛋白質(zhì)及淀粉，為美拉德反應(yīng)提供前體物質(zhì)，對(duì)酒體“焦香”的形成具有重要作用[2]；酵母菌主要產(chǎn)乙醇、酯類及其他多種風(fēng)味物質(zhì)；霉菌可產(chǎn)生糖化酶、液化酶等酶類，有利于原料的利用和特殊產(chǎn)香微生物的生長(zhǎng)[3]。對(duì)糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究有利于明確固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中特殊產(chǎn)香微生物的菌群來(lái)源，對(duì)優(yōu)化糧醅堆積發(fā)酵工藝具有重要意義。傳統(tǒng)白酒釀造的機(jī)械化是白酒行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)白酒傳統(tǒng)和機(jī)械化釀造在微生物多樣性、風(fēng)味差異等方面的解析，有助于實(shí)現(xiàn)白酒機(jī)械化釀造的穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。

近年來(lái)，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較多研究[4-5]。如張瀚之等[6]采用高通量測(cè)序及其數(shù)理分析對(duì)醬香型白酒機(jī)械化釀造7 個(gè)輪次堆積發(fā)酵酒醅的真菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Torulaspora、Byssochlamys、Candida和Wickerhamomyces是醬香型白酒機(jī)械化堆積過(guò)程中重要的真菌屬。復(fù)合香等香型白酒的釀造也普遍采用糧醅堆積發(fā)酵工藝[7]；然而，關(guān)于復(fù)合香型白酒糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究還鮮有報(bào)道，尤其是關(guān)于糧醅機(jī)械化和傳統(tǒng)堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)特征的比較研究較少。本研究以復(fù)合香型白酒機(jī)械化和傳統(tǒng)堆積發(fā)酵過(guò)程中的糧醅為樣品，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，全面解析機(jī)械化堆積發(fā)酵過(guò)程中糧醅微生物群落結(jié)構(gòu)和主導(dǎo)菌群的變化特征，有利于揭示糧醅機(jī)械化堆積的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及差異，旨在為持續(xù)優(yōu)化復(fù)合香型白酒的機(jī)械化釀造工藝及原酒品質(zhì)提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糧醅樣品：分別取自安徽金種子酒業(yè)股份有限公司的機(jī)械化和傳統(tǒng)釀酒車間，在糧醅堆積過(guò)程中的0（堆積開(kāi)始）、12、24 h和48 h（堆積結(jié)束）分為表層和內(nèi)部分別取樣，同時(shí)檢測(cè)不同取樣點(diǎn)的溫度并取平均值；其中，機(jī)械化堆積的表層樣品命名為AS1、AS2、AS3和AS4，內(nèi)部樣品命名為AI1、AI2、AI3和AI4；傳統(tǒng)堆積的表層樣品命名為TS1、TS2、TS3和TS4，內(nèi)部樣品命名為TI1、TI2、TI3和TI4。

環(huán)境及工藝條件：于2022年5月中旬進(jìn)行并取樣，釀酒廠區(qū)的環(huán)境溫度在18～30 ℃左右，環(huán)境濕度在50%～60%左右。在用糧和用曲的質(zhì)量、種類和比例以及配糟和蒸煮等工藝條件均基本相同的情況下，糧醅在機(jī)械化車間進(jìn)行配料、蒸煮、攤涼并加曲后，再分別進(jìn)行機(jī)械化堆積（機(jī)械化釀酒車間）和傳統(tǒng)堆積（轉(zhuǎn)運(yùn)到傳統(tǒng)釀酒車間），其堆積時(shí)間均為48 h。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）天津市永大化學(xué)試劑有限公司；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）-Na2、十六烷基三甲基溴化銨（cetrimonium bromide，CTAB）（均為分析純）北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Qiagen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20M高速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MX.S型可調(diào)式混勻儀 美國(guó)SCILOGEX公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；QuantiFluor型-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

在糧醅堆表層（3～5 cm）和內(nèi)部（80～100 cm）的5 個(gè)不同位置分別取樣后混合，并隨機(jī)取3 個(gè)平行樣本，再平均分別分為兩份；其中1 份在無(wú)菌環(huán)境下將3 個(gè)平行樣品分別單獨(dú)等量混合后，保存于無(wú)菌袋中，置于-80 ℃冰箱備微生物群落結(jié)構(gòu)分析；另1 份將3 個(gè)平行樣品分別保存于普通樣品袋中，置于4 ℃冰箱備理化指標(biāo)檢測(cè)。

如圖1所示，機(jī)械化堆積明顯區(qū)別于傳統(tǒng)堆積，機(jī)械化堆積的糧醅置于堆積床內(nèi)相對(duì)密閉的空間，糧醅與車間環(huán)境的接觸較少（堆積高度100 cm，寬度120 cm，長(zhǎng)度660 cm）；傳統(tǒng)堆積將糧醅置于車間空曠的場(chǎng)地內(nèi)進(jìn)行堆積（堆積高度150 cm，底部四周寬度280 cm，頂部四周寬度120 cm）。

1.3.2 DNA提取

糧醅微生物總DNA 提取的前處理方法與參照 文獻(xiàn)[4,8]，參考土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說(shuō)明書進(jìn)行糧醅總DNA的提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，最后向離心管中加入200 μL無(wú)菌雙蒸水使DNA沉淀溶解，并貯于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增定量：以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物（Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer: New England Biolabs）和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。細(xì)菌多樣性鑒定：正向引物515F（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和反向引物806R（GGACTACNVGGGTWTCTAAT）擴(kuò)增16S V3～V4（b）序列結(jié)構(gòu)域。真菌多樣性鑒定：正向引物ITS5-1737F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和反向引物ITS2-2043R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）擴(kuò)增ITS1（a）序列區(qū)域。

PCR 條件：將樣品均勻稀釋至20 n g/μ L，當(dāng)樣品不足時(shí)直接使用原溶液；同時(shí)，根據(jù)樣品的實(shí)際情況進(jìn)行稀釋調(diào)整；擴(kuò)增體系（25 μ L）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，F(xiàn)orward primer（10 μmol/L）1 μL，Reverse primer（10 μmol/L）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL；放大參數(shù)：98 ℃初始變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃滾轉(zhuǎn)30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃最終延伸5 min，10 ℃保持25～30 個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物的純化和混樣：PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化；采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.4 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)試

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。建庫(kù)與測(cè)序在上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.5 理化指標(biāo)的測(cè)定

糧醅的水分測(cè)定采用烘干法，酸度測(cè)定采用酸堿滴定法，淀粉和還原糖的測(cè)定采用斐林試劑法，具體參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》。

1.4 數(shù)據(jù)處理及繪圖

高通量測(cè)序完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與序列優(yōu)化，將序列相似性大于等于97%分歸為同一分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU），將所有序列與Silva（SILVA_138.1）庫(kù)比對(duì)，得到序列的分類學(xué)信息?；贗llumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)中的R語(yǔ)言繪制群落組成圖和Heatmap圖。通過(guò)計(jì)算微生物之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，再選取|ρ|＞0.8且P＜0.05的作為互作對(duì)象，然后使用Cytoscape 3.4.0（http://www.cytoscape.org）對(duì)微生物與微生物之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，以表征微生物與微生物之間的共現(xiàn)性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)及溫度變化分析

對(duì)不同堆積方式而言，開(kāi)始堆積時(shí)糧醅表層和內(nèi)部的理化指標(biāo)及溫度基本相同。如圖2所示，不同堆積方式下，堆積過(guò)程中糧醅的水分、酸度和還原糖均有平緩增加的趨勢(shì)，淀粉含量有減小的趨勢(shì)；其中，機(jī)械化堆積過(guò)程中，水分含量的增加較為平緩，酸度的增加明顯高于傳統(tǒng)堆積，這可能與機(jī)械化密閉式的堆積環(huán)境明顯區(qū)別于傳統(tǒng)開(kāi)放式的堆積環(huán)境有關(guān)。機(jī)械化堆積方式下，糧醅堆積48 h后表層的水分、酸度、淀粉和還原糖分別為50.12%、1.97 nmol/10 g、19.62%、2.74%，堆積內(nèi)部的水分、酸度、淀粉和還原糖分別為50.58%、2.02 nmol/10 g、18.53%、2.89%，這可能是由于堆積過(guò)程中糧醅表層和內(nèi)部環(huán)境條件、微生物菌群等因素的不同所導(dǎo)致。

糧醅酸度主要來(lái)源于產(chǎn)酸菌的有機(jī)酸代謝，有機(jī)酸在防止雜菌污染的同時(shí)，可作為白酒的主要風(fēng)味物質(zhì)及生成酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)[9]。糧醅理化參數(shù)在影響微生物群落演替的同時(shí)也受到微生物代謝的影響。糧醅的淀粉含量變化能有效反映出原料淀粉是否利用及糧醅是否進(jìn)行初步發(fā)酵。還原糖由淀粉酶、糖化酶等分解淀粉而生成，是微生物發(fā)酵的主要能量來(lái)源，堆積糧醅中還原糖的含量變化在一定程度上可以反映堆積發(fā)酵情況。綜上表明，不同堆積方式下，糧醅中淀粉均得到一定程度的利用，同時(shí)糧醅的堆積有利于為固態(tài)發(fā)酵提供有機(jī)酸、還原糖等物質(zhì)基礎(chǔ)。

不同堆積方式下，糧醅表層和內(nèi)部的溫度均有不同程度的升高（圖2e、f），其中糧醅堆積48 h后內(nèi)部的溫度均高于表層。機(jī)械化堆積方式下，糧醅堆積48 h后表層和內(nèi)部的溫度分別為54.8 ℃和56.9 ℃，明顯低于傳統(tǒng)堆積方式的56.3 ℃和58.6 ℃，這可能與機(jī)械化堆積糧醅的高度低于傳統(tǒng)堆積等因素有關(guān)。研究表明，糧醅堆積過(guò)程的高溫是功能微生物代謝活動(dòng)旺盛的表現(xiàn)，更是堆積過(guò)程中微生態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)整的推動(dòng)力[10]。另外，傳統(tǒng)堆積的表面積大于機(jī)械化堆積，糧醅與車間環(huán)境接觸較多，并受環(huán)境溫度、濕度和通風(fēng)等因素的影響較大，因此糧醅表層各局部整體上接觸（接種）環(huán)境微生物的面積也較大。

2.2 糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 序列統(tǒng)計(jì)、有效性與α多樣性分析

對(duì)各樣品的DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾后分別得到95111～121170 條細(xì)菌的有效序列，其平均長(zhǎng)度為101～374 bp，聚類分析共產(chǎn)生7620 個(gè)OTU分類；測(cè)序序列經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾后分別得到58636～96930 條真菌的有效序列，其平均長(zhǎng)度為17～438 bp，聚類分析共產(chǎn)生1504 個(gè)OTU分類。α多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性[11]，由圖3α多樣性指數(shù)可知，各組樣品的覆蓋率均大于0.999，Chao1指數(shù)的P值分別為0.018和0.33。綜上表明，本次測(cè)序各樣品文庫(kù)的覆蓋率較高，樣品序列基本被完全測(cè)出，各樣品的測(cè)序結(jié)果較可靠。

圖3 不同堆積方式下糧醅微生物的α多樣性分析Fig.3 Analysis of microbial α-diversity in fermented grains

覆蓋率在99%的OTU水平進(jìn)行Chao1指數(shù)計(jì)算以估計(jì)物種數(shù)目（即OTU數(shù)目）。由圖3a可知，AI組的Chao1指數(shù)高于其他樣品組，表明AI組的細(xì)菌物種總數(shù)高于其他樣品組；同樣，由圖3b可知，TI組的Chao1指數(shù)高于其他樣品組，表明TI組的真菌物種總數(shù)高于其他樣品組。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均能表現(xiàn)出樣品中物種的多少、均勻度及多樣性[12]。由圖3a可知，AI組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于其他樣品組，表明AI組細(xì)菌物種的均勻度及多樣性高于其他樣品組；同樣，由圖3b可知，TI組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于其他樣品組，表明TI組的真菌物種的均勻度及多樣性高于其他樣品組。對(duì)不同堆積方式而言，由圖3a可知，AS組和AI組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均分別高于TS組和TI組；由圖3b可知，AS組和AI組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均低于TS組和TI組；綜上表明，機(jī)械化堆積方式下，糧醅的細(xì)菌多樣性明顯高于傳統(tǒng)堆積，而糧醅的真菌多樣性明顯低于傳統(tǒng)堆積。另外，由圖3a可知，AS組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均低于AI組；由圖3b可知，AS組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于AI組；綜上表明，機(jī)械化堆積方式下，糧醅表層的細(xì)菌多樣性低于糧醅內(nèi)部，而糧醅表層的真菌多樣性高于糧醅內(nèi)部。

2.2.2 OTU分布的Venn分析

對(duì)不同堆積方式下糧醅微生物的OTU進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，并對(duì)不同樣品組之間相對(duì)共有及獨(dú)有的OTU數(shù)進(jìn)行疊加，有利于直觀地比較OTU數(shù)目組成，并可以推測(cè)樣品組中的微生物多樣性及豐度[13]。由圖4a可知，不同樣品組的共有細(xì)菌OTU為191 個(gè)，占樣品組總OTU的6.00%；其中，AI組的特有OTU數(shù)最大為1156 個(gè)，占樣品組總OTU的36.30%，表明AI組的細(xì)菌多樣性最高。另外，AS組的細(xì)菌OTU數(shù)低于AI組，表明機(jī)械化堆積方式下，糧醅表層的細(xì)菌多樣性低于糧醅內(nèi)部，這與Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的分析結(jié)果一致。由圖4b可知，不同樣品組的共有真菌OTU為64 個(gè)，占樣品組總OTU的14.48%；其中，TI組的特有OTU數(shù)最大為112 個(gè)，占樣品組總OTU的25.34%，表明TI組的真菌多樣性最高。

圖4 不同堆積方式下糧醅微生物OTU分布的Venn分析Fig.4 Venn analysis of microbial OTUs in fermented grains between mechanized and traditional stack fermentation

2.2.3 基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

將各類OTU的代表序列與Unite的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到每個(gè)OTU在不同分類水平的物種分類信息。高通量測(cè)序顯示所有糧醅中的細(xì)菌種群可歸屬于21 個(gè)門，如圖5a所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 4 個(gè)主要細(xì)菌門，其相對(duì)豐度均大于1.00%；其中，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria的相對(duì)豐度均大于22.00%，是堆積糧醅中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。不同堆積方式下，糧醅表層和內(nèi)部的微生物基于門水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布差異并不明顯，同樣以上述4 個(gè)細(xì)菌門為主。

圖5 不同堆積方式下糧醅微生物基于門水平的群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.5 Microbial community structure at the phylum level in fermented grains

高通量測(cè)序顯示所有糧醅中的真菌種群可歸屬于10 個(gè)門，如圖5b所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Ascomycota和Mucoromycota 2 個(gè)主要真菌門，其相對(duì)豐度均大于1.00%；其中，Ascomycota為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌門，其在不同樣品中的相對(duì)豐度均大于60.00%。另外，堆積結(jié)束后糧醅中Ascomycota的相對(duì)豐度均大于95.00%（AS4、AI4、TS4和TI4）。研究表明，Ascomycota是醬香[14]、清香[15]、濃香[16]等香型白酒酒醅中的主要真菌門，該菌門是白酒發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵真菌門。不同堆積方式下，糧醅表層和內(nèi)部基于門水平的真菌群落結(jié)構(gòu)分布有所差異，尤其是堆積結(jié)束后糧醅的真菌群落結(jié)構(gòu)明顯差異于堆積前。

2.2.4 基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

如圖6a所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Bacillus、Weissella、Acetobacter和Ralstonia4 個(gè)主要細(xì)菌屬，其相對(duì)豐度均大于1.00%。其中，Bacillus具有較強(qiáng)的分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶能力，具有耐高溫、產(chǎn)酶、產(chǎn)香的功能，其主要代謝產(chǎn)物包括吡嗪類、酮類、丙酸、1,3-丁二醇、乙酸、甲酯等風(fēng)味物質(zhì)[17]。Weissella在白酒發(fā)酵過(guò)程中可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，Acetobacter在白酒發(fā)酵過(guò)程中能將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，酸類物質(zhì)是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)及酯類合成的前體物質(zhì)。不同堆積方式下，堆積結(jié)束后糧醅內(nèi)部Bacillus相對(duì)豐度明顯高于糧醅表層，這可能與糧醅堆內(nèi)部的溫度高于表層有關(guān)。與機(jī)械化堆積方式相比，傳統(tǒng)堆積糧醅Acetobacter相對(duì)豐度明顯較高；同時(shí)，傳統(tǒng)堆積糧醅表層Acetobacter相對(duì)豐度明顯高于內(nèi)部，這可能與糧醅表層的溫度低于內(nèi)部有關(guān)。

圖6 不同堆積方式下糧醅微生物基于屬水平的群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.6 Microbial community structure at the genus level in fermented grains

如圖6 b 所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Aspergillus、Lichtheimia、Candida、Pichia、Wickerhamomyces、Saccharomyces6 個(gè)主要真菌屬，其相對(duì)豐度均大于1.00%；同時(shí)，隨著堆積時(shí)間延長(zhǎng)，Pichia和Saccharomyces相對(duì)豐度逐漸增高。機(jī)械化堆積過(guò)程中Aspergillus的相對(duì)豐度逐漸降低，Pichia相對(duì)豐度逐漸增高；同樣，傳統(tǒng)堆積也表現(xiàn)出相似的規(guī)律。堆積結(jié)束后糧醅中Pichia相對(duì)豐度均大于54.00%（AS4、AI4、TS4和TI4），其在糧醅表層和內(nèi)部的相對(duì)豐度差異不明顯。機(jī)械化堆積方式下，堆積結(jié)束后糧醅表層和內(nèi)部Pichia相對(duì)豐度均大于90.00%（AS4、AI4），明顯高于傳統(tǒng)堆積。傳統(tǒng)堆積方式下，堆積結(jié)束后糧醅表層和內(nèi)部Wickerhamomyces相對(duì)豐度均大于2.00%（TS4、TI4）并明顯高于機(jī)械化堆積，Saccharomyces相對(duì)豐度均明顯高于機(jī)械化堆積。研究表明，Wickerhamomyces和Pichia在釀酒中主要起到產(chǎn)香的作用，同時(shí)具有產(chǎn)酒代謝能力，Saccharomyces是酒醅中主要的產(chǎn)酒酵母[18]。

2.3 基于物種分類屬水平的微生物群落演替Heatmap分析

糧醅堆積過(guò)程中大曲、糧醅和環(huán)境微生物相互影響，不同堆積深度的溫度、空氣、糧醅營(yíng)養(yǎng)狀況等均存在差異；同時(shí)，機(jī)械化堆積環(huán)境相對(duì)封閉，導(dǎo)致不同堆積時(shí)間或深度的優(yōu)勢(shì)菌群存在差異。如圖7所示屬水平上豐度前20的微生物群落Heatmap圖，顏色越接近綠色表示該菌屬的相對(duì)豐度越高，顏色越接近棕色表示該菌屬的相對(duì)豐度越低。

圖7 不同堆積方式下糧醅微生物基于屬水平的Heatmap圖Fig.7 Heatmap of microbial community at the genus level in fermented grains

由圖7a可知，機(jī)械化堆積方式下，AS1、AS2、AS3、AS4區(qū)域中相對(duì)豐度大于1.00%的微生物分別對(duì)應(yīng)有9、12、12、13 種。不同堆積方式下，不同堆積時(shí)間的糧醅中沒(méi)有共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其中至少有2 個(gè)區(qū)域相對(duì)豐度均較高的細(xì)菌屬，包括Lactobacillus、Sphingomonas、Acinetobacter、Rhodococcus和Pseudomonas。Bacillus在AS1、AS2、AS3、AS4區(qū)域中的相對(duì)豐度均較高，分別為 18.1%、19.46%、22.59%、7.47%；同樣，Bacillus在TS1、TS2、TS3、TS4區(qū)域中的相對(duì)豐度也較高，分別為 11.87%、18.51%、17.45%、4.69%。綜上表明，由于細(xì)菌類群的耐受性、適應(yīng)性更強(qiáng)，對(duì)糧醅表面而言，機(jī)械化堆積方式下Bacillus的相對(duì)豐度均高于傳統(tǒng)堆積；對(duì)糧醅內(nèi)部而言，Bacillus、Weissella、Ralstonia3 個(gè)細(xì)菌屬在AI4的相對(duì)豐度均大于TI4。

由圖7b可知，機(jī)械化堆積方式下，AS1、AS2、AS3、AS4區(qū)域中相對(duì)豐度大于1.00%的微生物分別對(duì)應(yīng)有5、4、5、3 種。不同堆積方式下，不同堆積時(shí)間的糧醅中沒(méi)有共有的優(yōu)勢(shì)真菌屬，其中至少有2 個(gè)區(qū)域相對(duì)豐度均較高的真菌屬有Pichia、Aspergillus、Rhizopus、Lichtheimia和Candida。在TS1、TS2、TS3、TS4區(qū)域中分別對(duì)應(yīng)有9、8、10、6 種相對(duì)豐度大于1.00%的真菌屬，其中至少有2 個(gè)區(qū)域相對(duì)豐度均較高的真菌屬有Pichia、Aspergillus、Rhizopus、Saccharomyces、Byssochlamys、Thermomyces、Lichtheimia、Millerozyma、Wickerhamomyces、Candida和Rhizomucor，上述真菌屬是復(fù)合香型糧醅機(jī)械化堆積過(guò)程中的重要真菌屬。其中，Aspergillus能產(chǎn)生多種酶類，對(duì)大曲和酒醅的糖化力、酯化力、液化力等起到積極的調(diào)控作用；同時(shí)，該菌屬可通過(guò)代謝有機(jī)酸和脂肪酸，以促成芳香酯類物質(zhì)的生成，有利于提升和改善酒體風(fēng)味[19-20]。

對(duì)糧醅內(nèi)部而言，Pichia、Byssochlamys在AI4的相對(duì)豐度明顯大于TI4；同時(shí)，Saccharomyces、Hyphopichia、Millerozyma、Dipodascus、Wickerhamomyces5 個(gè)真菌屬在AI4的相對(duì)豐度均低于TI4。研究表明，Wickerhamomyces是重要的生香酵母，其具有耐高酸度和產(chǎn)酯能力強(qiáng)的特點(diǎn)，發(fā)酵糧醅中該菌屬主要來(lái)源于大曲的添加[6]。多種酵母菌屬能在酯酶的作用下合成酯類及其他風(fēng)味物質(zhì)，從而賦予酒體濃郁的芳香，對(duì)酒體的豐滿也具有重要作用，該菌屬是影響白酒風(fēng)味和質(zhì)量的重要因素[21]。綜上表明，堆積過(guò)程中存在釀酒微生物的交換、演替和富集，具有網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中酵母菌的作用，同時(shí)還可能直接產(chǎn)生豐富的呈香呈味物質(zhì)及其前體物質(zhì)。有研究表明，在堆積發(fā)酵過(guò)程中控制適宜的微生物種類和數(shù)量對(duì)出酒率和原酒質(zhì)量都具有重要影響[22]；同時(shí)，穩(wěn)定有效地調(diào)控糧醅堆積過(guò)程，有利于為入窖發(fā)酵提供合適的微生物及代謝產(chǎn)物基礎(chǔ)；因此，糧醅微生物的富集情況、相互作用及環(huán)境因素影響還需要深入研究。

2.4 基于物種分類屬水平的微生物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析主要用于尋找特定微生物群落在時(shí)空變化或環(huán)境過(guò)程驅(qū)動(dòng)下所呈現(xiàn)的共現(xiàn)或互斥的固有模式，進(jìn)而分析環(huán)境差異或?qū)嶒?yàn)處理所導(dǎo)致的群落物種裝配差異，并尋找撬動(dòng)群落組成變化的關(guān)鍵菌群或物 種[23]。如圖8所示，其中節(jié)點(diǎn)代表樣本中的擴(kuò)增子序列變異或OTU，節(jié)點(diǎn)大小與其豐度呈正比，選擇按物種組成比例注釋節(jié)點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)間連線表示被連接的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在相關(guān)性，紅色線條表示不同物種之間存在負(fù)相關(guān)，綠色線條表示不同物種之間存在正相關(guān)。

圖8 不同堆積方式下糧醅微生物基于屬水平的共現(xiàn)性關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 Cooccurrence network diagram of microbial communities at the genus level in fermented grains

在白酒固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，核心及關(guān)鍵微生物菌群的結(jié)構(gòu)組成及其功能決定了白酒的風(fēng)格及品質(zhì)[14,24]。由圖8a可知，Bacillus、Lactobacillus、Staphylococcus等細(xì)菌屬與其他細(xì)菌屬的正相關(guān)性比較密切，屬于堆積糧醅中的核心細(xì)菌菌群；同時(shí)，Bacillus和Lactobacillus之間存在明顯的負(fù)相關(guān)。由圖8b可知，Aspergillus、Pichia、Lichtheimia等真菌屬與其他真菌屬的正相關(guān)性比較密切，屬于堆積糧醅中的核心真菌菌群；同時(shí)，Lichtheimia和Saccharomyces之間以及Pichia和Saccharomyces、Thermomyces之間均存在明顯的正相關(guān)。綜上表明，上述6 個(gè)菌屬所組成的核心微生物菌群是糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵菌群。

機(jī)械化堆積方式對(duì)環(huán)境因子的影響以及微生物的相互作用，導(dǎo)致了真菌類群在種類和相對(duì)豐度上的差異，如Pichia、Aspergillus等真菌屬得以富集；同樣，對(duì)細(xì)菌類群也存在一定影響，如Bacillus、Weissella等細(xì)菌屬得以富集。糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的Pichia主要來(lái)源于釀造環(huán)境，其具有較好的熱耐受性及較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)[25]。研究表明，酸度、還原糖和溫度是釀造過(guò)程中細(xì)菌群落變化的決定因素，在真菌群落演替過(guò)程中釀酒酵母占據(jù)主導(dǎo)地位[26]。傳統(tǒng)堆積方式下，糧醅堆積過(guò)程中微生物得以不斷馴化和富集，如Acetobacter等細(xì)菌屬，Saccharomyces、Byssochlamys、Wickerhamomyces等真菌屬，其中的Saccharomyces與主要醇類、酯類和醛類的含量密切相關(guān)[27]。由于稻殼、大曲、糧食（堆積糧醅）等的不斷補(bǔ)充和循環(huán)發(fā)酵，導(dǎo)致白酒發(fā)酵體系內(nèi)外存在微生物的交換、演替和富集，并且空氣流動(dòng)、配糟發(fā)酵、物料交換等因素也導(dǎo)致不同釀造環(huán)節(jié)之間的微生物相互影響[7]。糧醅堆積過(guò)程中形成了獨(dú)特的微生物菌群結(jié)構(gòu)，富集的微生物菌群代謝產(chǎn)生豐富的發(fā)酵酶類和風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)酒體風(fēng)味的形成具有重要作用[28-29]。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)解析糧醅機(jī)械化和傳統(tǒng)堆積發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，得到的結(jié)論主要有：1）不同堆積方式下的糧醅微生物可歸為Bacillus、Weissella、Acetobacter和Ralstonia4 個(gè)主要細(xì)菌屬，Aspergillus、Lichtheimia、Candida、Pichia、Wickerhamomyces和Saccharomyces6 個(gè)主要真菌屬；2）機(jī)械化堆積方式下，細(xì)菌屬的多樣性明顯高于傳統(tǒng)堆積，真菌屬的多樣性明顯低于傳統(tǒng)堆積；同時(shí)，糧醅表層的細(xì)菌多樣性低于糧醅內(nèi)部，而糧醅表層的真菌多樣性高于糧醅內(nèi)部；3）不同堆積方式下，不同堆積時(shí)間的優(yōu)勢(shì)微生物類群存在差異，堆積過(guò)程中存在釀酒微生物的交換、演替和富集；4）Bacillus、Lactobacillus、Staphylococcus細(xì)菌屬，以及Aspergillus、Pichia、Lichtheimia真菌屬，上述6 個(gè)菌屬所組成的核心微生物菌群是糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵菌群。

糧醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的內(nèi)源性理化因子，如乙醇、水分、酸度以及溫度等因素都會(huì)由于發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝方式或活性的改變而發(fā)生改變，進(jìn)而影響微生物的群落組成[30]。由于糧醅堆積表層和內(nèi)部存在空氣、溫度及濕度等條件的差異，同時(shí)糧醅堆積表面積不同導(dǎo)致糧醅與環(huán)境微生物的交換情況也存在差異，均有可能導(dǎo)致不同堆積方式下糧醅表層和內(nèi)部微生物種類及豐度的差異。機(jī)械化車間和傳統(tǒng)車間在使用年限、車間環(huán)境等方面的不同導(dǎo)致環(huán)境微生物存在差異[31]，同時(shí)糧醅堆積過(guò)程中差異性地網(wǎng)羅了環(huán)境中的功能優(yōu)勢(shì)菌屬[32]，也是導(dǎo)致堆積糧醅微生物結(jié)構(gòu)差異的重要原因。環(huán)境微生物是發(fā)酵菌群的重要來(lái)源，在驅(qū)動(dòng)白酒發(fā)酵微生物的演替和代謝過(guò)程中具有重要作用[33]。本研究有利于揭示糧醅機(jī)械化堆積的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及差異，為持續(xù)優(yōu)化復(fù)合香型白酒的機(jī)械化釀造工藝提供依據(jù)。由于機(jī)械化堆積和傳統(tǒng)堆積在工藝和環(huán)境等方面的差異，導(dǎo)致糧醅微生物多樣性及優(yōu)勢(shì)微生物菌群的篩選、富集也有所差異。本研究中發(fā)現(xiàn)的糧醅差異微生物菌屬，對(duì)釀造環(huán)境的應(yīng)答特性、遷移規(guī)律以及對(duì)白酒釀造的影響最終會(huì)影響原酒感官品質(zhì)，因此還需后續(xù)進(jìn)一步深入分析和跟蹤研究。