茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域醬香大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)性能對(duì)比

陳紹依，郎 瑩，邱樹(shù)毅，吳伯天，胡勝蘭，周鴻翔,

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州王茅酒曲研究院有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550025）

大曲作為白酒糖化發(fā)酵的發(fā)酵劑和主要原料，是經(jīng)過(guò)粉碎、潤(rùn)糧、踩曲以及自然接種發(fā)酵而成[1]，在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中從周?chē)h(huán)境將功能微生物富集并導(dǎo)入最終成品中，在白酒釀造過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[2]。醬香大曲實(shí)則是一種高溫大曲，其獨(dú)特的微生物結(jié)構(gòu)及代謝活動(dòng)，決定了醬香白酒風(fēng)味的形成[3]。

茅臺(tái)鎮(zhèn)盛產(chǎn)醬香白酒，也是優(yōu)質(zhì)醬香大曲的主要生產(chǎn)地，其大曲的微生物組成和生產(chǎn)性能在一定程度上使醬香白酒具有風(fēng)味醇厚、口感細(xì)膩、醬香突出、空杯留香等特點(diǎn)[4]，而影響大曲微生物結(jié)構(gòu)的因素包括原料、環(huán)境、工藝、生產(chǎn)季節(jié)、貯藏期等[5-7]。近年來(lái)，大曲的微生物群落構(gòu)成已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，如Hu Yunan等[8]采用核磁共振和高通量測(cè)序分析3 種清香型大曲的微生物菌群，研究顯示3 種大曲中均以乳桿菌（Lactobacillus）、魏斯氏菌（Weissella）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，畢赤酵母屬（Pichia）、覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）為優(yōu)勢(shì)真菌。Yao Jin等[9]研究14 種醬香大曲的微生物群落多樣性與揮發(fā)性成分的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)酒廠曲樣的含氮化合物與芽孢桿菌（Bacillus）和曲霉（Aspergillus）豐度呈正相關(guān)，而其他樣品的酯類(lèi)與乳桿菌和曲霉豐度相關(guān)。吳樹(shù)坤等[10]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)四川不同區(qū)域濃香大曲的微生物菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)瀘州和宜賓曲樣具有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)，以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、魏斯氏菌屬、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）為優(yōu)勢(shì)菌屬，而遂寧的兩個(gè)曲樣的微生物群落結(jié)構(gòu)更相似，以芽孢桿菌屬、曲霉屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）為優(yōu)勢(shì)菌屬。

有研究表明，位于茅臺(tái)鎮(zhèn)不同主釀區(qū)的茅臺(tái)、釣魚(yú)臺(tái)、國(guó)臺(tái)醬香白酒特征風(fēng)味物質(zhì)存在較大差異[11]，而醬香大曲決定醬香型白酒的風(fēng)格和品質(zhì)，故研究茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域醬香大曲的微生物構(gòu)成與生產(chǎn)性能對(duì)醬香型白酒的發(fā)展有一定推動(dòng)意義。采用第3代Nanopore測(cè)序平臺(tái)分析茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域醬香大曲的微生物構(gòu)成，并分析優(yōu)勢(shì)微生物與微生物、生產(chǎn)性能和特征風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，旨在為醬香大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及個(gè)性化和后期研究大曲功能性微生物提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

TS、WS、WM、MH、DJ成品曲均為貯存3 個(gè)月以上的陳曲，分別由茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域的酒廠提供，若以茅臺(tái)鎮(zhèn)人民政府為起始點(diǎn)，5 種大曲的生產(chǎn)位置與起始點(diǎn)直線距離和地理描述如表1、圖1所示。大曲樣品從企業(yè)采樣后經(jīng)粉碎混勻后裝入無(wú)菌密封袋置于4 ℃冰箱備用。

圖1 不同醬香大曲采樣分布圖Fig.1 Sampling distribution of five Daqu samples

表1 5 種大曲樣品地理描述Table 1 Geographical description of five Daqu samples

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、硫酸（均為分析純）重慶川東化工有限公司；葡萄糖（分析純）天津市永大化學(xué)試劑有限公司；己酸（分析純）、標(biāo)準(zhǔn)品（2-戊醇、異戊醇、正戊醇、2-壬醇、1,2-丙二醇、糠醇、壬醇、苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、丙酸、戊酸、己酸、癸酸、苯甲醛、苯乙醛、2-壬酮、苯乙酮、愈創(chuàng)木酚、2-乙酰基呋喃、5-甲基-2-乙?；秽┥虾Ｒ锥骰瘜W(xué)技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸（分析純）、2,3-丁二醇、壬酸乙酯 上海麥克林生化科技有限公司；乙酸鈉（分析純）成都金山化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉（優(yōu)級(jí)純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、辛醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸異戊酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、乙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、乙縮醛、乙偶姻、4-乙基愈創(chuàng)木酚、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、叔戊醇（內(nèi)標(biāo)）上海阿拉丁生化科技有限公司；2-甲基丁酸乙酯 上海賢鼎生物科技有限公司；乙醛 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；以上標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純且純度不小于97.0%。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；81-2 恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、7890A GC儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲樣品總DNA的提取和質(zhì)檢

使用OMEGA DNA提取試劑盒直接提取大曲樣品總DNA，然后采用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA片段大小分布，使用NanoDrop儀器進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，當(dāng)所提DNA的熒光強(qiáng)度比值A(chǔ)260nm/A280nm在2.0～2.2范圍內(nèi)時(shí)，即認(rèn)為所提DNA的質(zhì)量達(dá)到測(cè)序要求。

1.3.2 高通量測(cè)序

將提取合格的曲樣DNA送至上海派森諾生物科技有限公司，利用Ampure XP beads純化DNA后，使用LSK109連接試劑盒中接頭進(jìn)行連接反應(yīng)，然后用Qubit檢測(cè)建好的DNA文庫(kù)并定量，最后在Oxford Nanopore PromethION測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 大曲理化指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵力根據(jù)呂亞楠等[12]的方法測(cè)定，其他理化指標(biāo)依照QB/T 4257—2011《釀酒酒曲通用分析方法》進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 特征風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)1.3.4.1 曲樣預(yù)處理

根據(jù)蘇寧等[13]方法處理并稍作修整：準(zhǔn)確量取45 mL體積分?jǐn)?shù)25%乙醇溶液，加入10.00 g曲樣于100 mL三角瓶中，超聲30 min后，7000 r/min離心5 min，將上層清液過(guò)0.22 μm濾膜，吸取990 μL濾液和10 μL內(nèi)標(biāo)（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸，體積分?jǐn)?shù)為1%）至頂空瓶中，供GC-MS、GC分析。

1.3.4.2 GC-MS定性

色譜條件：SHIMADZU 221-75893-30 SH-Rtx-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃；高純氮?dú)猓?9.999%）；空氣流量300 mL/min，氫氣流量30 mL/min，尾吹氣流量 30 mL/min；升溫程序：初始溫度為30 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升溫至180 ℃，再以15 ℃/min升溫至210 ℃，保持8 min；分流進(jìn)樣，分流比30∶1。

質(zhì)譜條件：電子電離源；全掃描模式（分子質(zhì)量范圍35.0～550.0 u）；離子源溫度230 ℃；電離能量70 eV；四極桿溫度150 ℃。

1.3.4.3 GC定量

根據(jù)張曉婕等[14]方法對(duì)大曲風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量，GC條件如下：SHIMADZU 221-75893-30 SH-Rtx-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃；高純氮?dú)猓?9.999%）；空氣流量300 mL/min，氫氣流量30 mL/min，尾吹氣流量30 mL/min；升溫程序：初始溫度為30 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升溫至180 ℃，再以15 ℃/min升溫至210 ℃，保持8 min；分流進(jìn)樣，分流比30∶1。定量方法：以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的含量比為橫坐標(biāo)，峰面積比為縱坐標(biāo)，建立各揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1.3.4.1節(jié)方法處理曲樣，采用內(nèi)標(biāo)法定量曲樣中各揮發(fā)性物質(zhì)的含量，所有曲樣重復(fù)測(cè)定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

使用Flye（version：v2.8）對(duì)三代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組拼接，同時(shí)Flye會(huì)對(duì)原始拼接結(jié)果進(jìn)行5 輪糾錯(cuò)，得到最終的拼接結(jié)果，然后按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)，使用NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)捎肐BM SPSS Statistics 23對(duì)理化指標(biāo)做單因素方差分析。

1.4.2 數(shù)據(jù)繪圖

采用USEARCH軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)；Origin 2018繪制堆積圖；Gephi0.9.2繪制網(wǎng)絡(luò)圖，Venn圖和冗余分析（redundancy analysis，RDA）分別于http://www.cloud.biomicroclass.com/、https://hiplot-academic.com網(wǎng)站上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲微生物構(gòu)成及多樣性分析

α多樣性的Chao1、ACE指數(shù)和Shannon、Simpson指數(shù)分別反映微生物物種的豐富度和多樣性，指數(shù)越高表示物種的豐富度和多樣性越好。由表2可知，5 種醬香大曲的覆蓋率均為100%，表示本次測(cè)序結(jié)果能真實(shí)反映曲樣的微生物結(jié)構(gòu)；DJ細(xì)菌的Chao1、ACE指數(shù)最高，說(shuō)明DJ細(xì)菌豐富度最好；TS細(xì)菌的Shannon、Simpson指數(shù)最高，即TS細(xì)菌多樣性最好。WM真菌的Shannon、Simpson指數(shù)最高，說(shuō)明WM真菌多樣性最好；而MH真菌的豐富度和多樣性最低，可能與該酒企制曲工藝、生產(chǎn)原料、周?chē)h(huán)境有關(guān)[15]，或在生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)菌群替代非功能菌種[16]。

表2 大曲樣品α多樣性分析結(jié)果Table 2 Results of microbial α-diversity analysis of Daqu samples

5 種大曲在細(xì)菌屬水平上共檢測(cè)到1093 個(gè)OTU，在真菌屬水平上共檢測(cè)到281 個(gè)OTU，根據(jù)分類(lèi)注釋到的OTU繪制Venn圖，可直觀展示不同醬香大曲共有和特有的OTU。共有OTU是引起大曲共性的重要原因，而特有OTU是引起大曲差異的重要菌群。如圖2a所示，在細(xì)菌屬水平上5 種大曲含有457 個(gè)相同的OTU，OTU數(shù)依次為T(mén)S（728）＞MH（706）＞DJ（691）＞W(wǎng)S（626）＞W(wǎng)M（618），說(shuō)明TS、MH、DJ細(xì)菌多樣性較好，與表2結(jié)果一致；5 種大曲特有OTU數(shù)及其占比分別為70和9.92%（MH）、21和3.35%（WS）、19和2.61%（TS）、10和1.62%（WM）、6和0.87%（DJ）。如圖2b所示，在真菌屬水平上5 種大曲含有171 個(gè)相同的OTU，OTU數(shù)依次為：TS（264）＞W(wǎng)M（259）＞W(wǎng)S（255）＞DJ（215）＞MH（172），說(shuō)明TS、WM、WS的真菌豐度較好，與表2結(jié)果一致；5 種大曲特有OTU數(shù)及其占比分別為4和1.57%（WS）、3和1.14%（TS）、1和0.47%（DJ）、1和0.39%（WM）、0和0.00%（MH）。MH特有70 種細(xì)菌物種，沒(méi)有特性真菌，說(shuō)明MH的70 種特性細(xì)菌是引起MH特征差異的重要微生物。

圖2 不同醬香大曲OTU分布圖Fig.2 Venn diagrams showing shared and unique OTUs between Daqu samples

2.2 不同醬香大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

醬香大曲作為一種高溫大曲，其細(xì)菌占據(jù)相對(duì)的優(yōu)勢(shì)，是使酒體醬香風(fēng)味突出的重要原因[17]。如圖3所示，MH、DJ位于赤水河右岸，以細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度在79.89%以上，是典型的醬香大曲；TS、WM位于赤水河左岸，其細(xì)菌的相對(duì)豐度略高于真菌的相對(duì)豐度；WS位于赤水河右岸，真菌豐度的占比最高，其原因可能是距離中心區(qū)域最遠(yuǎn)，及其所處的微環(huán)境引起。

圖3 不同醬香大曲屬水平總體微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Microbial community structure at the genus levels in Daqu

根據(jù)屬水平分類(lèi)注釋的OTU結(jié)果，選取細(xì)菌、真菌相對(duì)豐度前20的OTU分別繪制百分比堆積柱狀圖。如圖4a所示，細(xì)菌相對(duì)豐度較高的物種是芽孢桿菌屬（Bacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）。芽孢桿菌屬分別占MH、DJ細(xì)菌屬總豐度的64%、31%，表明芽孢桿菌屬是MH、DJ的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，與其他學(xué)者研究的芽孢桿菌屬是醬香大曲中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)果一致[18-19]。高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）在TS、WM、MH、DJ、WS的相對(duì)豐度依次為14.55%、5.64%、0.91%、0.10%、0.74%，在地理位置上，表明高溫放線菌屬可作為茅臺(tái)鎮(zhèn)赤水河左岸的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，而在高度上，高溫放線菌屬更適合生存在茅臺(tái)鎮(zhèn)高海拔地區(qū)。魏斯氏菌屬的相對(duì)豐度在5 種曲樣順序?yàn)門(mén)S（12.84%）＞W(wǎng)M（9.97%）＞MH（3.72%）＞DJ（2.11%）＞W(wǎng)S（0.62%），在地域上呈現(xiàn)出赤水河左岸＞赤水河右岸、距茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域較近＞茅臺(tái)鎮(zhèn)核心區(qū)域較遠(yuǎn)、海拔高度高＞海拔高度低規(guī)律。

圖4 不同醬香大曲屬水平前20群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Top 20 most abundant microbial genera in Daqu

大曲優(yōu)勢(shì)菌群的代謝活動(dòng)是醬香白酒風(fēng)味產(chǎn)生的關(guān)鍵，芽孢桿菌屬是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中最重要的功能菌[20]，在大曲貯藏過(guò)程中能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等酶類(lèi)[21-22]，是醬香大曲代謝生產(chǎn)吡嗪類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)等多種風(fēng)味化合物的重要菌屬[23]。有研究表明，溫度是影響芽孢桿菌屬數(shù)量的重要因素[24]，適度高溫會(huì)促進(jìn)芽孢桿菌屬等耐熱微生物的生長(zhǎng)，抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，而MH和DJ的芽孢桿菌屬高可能與環(huán)境及其生產(chǎn)控制工藝有關(guān)。高溫放線菌屬與芽孢桿菌屬均屬于耐熱微生物，均能分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶[25]，多存在于高溫大曲中，對(duì)醬香白酒的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)，有研究表明高溫放線菌菌株不僅能生產(chǎn)其他吡嗪類(lèi)化合物，還能生產(chǎn)具有醬香風(fēng)味的愈創(chuàng)木酚[26]。魏斯氏菌屬是產(chǎn)酸細(xì)菌，在大曲發(fā)酵過(guò)程中能夠生產(chǎn)乙酸、乳酸合成乙酸乙酯、乳酸乙酯等特征風(fēng)味物質(zhì)[10,27]。有關(guān)魏斯氏菌屬在大曲中的報(bào)道較多，Yao Su等[28]研究發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬是芝麻香型白酒高溫大曲發(fā)酵過(guò)程中的第二優(yōu)勢(shì)菌屬，在發(fā)酵過(guò)程中呈先增后降的趨勢(shì)。Deng Yuke等[29]也發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬是大曲發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，與本研究結(jié)果一致。乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬（Pediococcus）均屬乳酸菌[28,30]，在本研究均被檢測(cè)到，已有研究證實(shí)乳酸菌為中高溫大曲發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[28,31]。

如圖4b所示，5 種大曲相對(duì)豐度均大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌屬有曲霉屬（Aspergillus）、紅曲霉屬（Monascus）、青霉屬（Penicillium）、拉薩姆氏菌屬（Rasamsonia）、籃狀菌屬（Talaromyces），曲霉屬、青霉屬為大曲的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌。橫梗霉屬（Lichtheimia）、覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）在TS、WM、MH中的比例明顯高于DJ、WS，在地域上呈現(xiàn)為茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域特有的優(yōu)勢(shì)真菌，在海拔上呈現(xiàn)為茅臺(tái)鎮(zhèn)較高海拔區(qū)域特有的優(yōu)勢(shì)真菌，已有研究表明橫梗霉屬、覆膜孢酵母屬是茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型大曲不同主釀區(qū)的優(yōu)勢(shì)真菌群[32-33]。曲霉屬、青霉屬是高溫大曲普遍存在的優(yōu)勢(shì)真菌屬[34]，能夠生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶[35]，對(duì)大曲的液化力、糖化力和酯化力起重要作用[36]。Xia Yu等[37]在研究醬香大曲與濃香大曲的淀粉酶活性相關(guān)蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)相比濃香大曲，醬香大曲上調(diào)表達(dá)的淀粉酶蛋白主要取決于曲霉屬。橫梗霉屬在醬香大曲中具有較高的耐熱性，能夠高產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶[37-38]，是醬香大曲必不可少的優(yōu)勢(shì)菌群。有研究表明大曲發(fā)酵過(guò)程中，微生物菌群是由乳酸菌代謝驅(qū)動(dòng)的自我馴化過(guò)程，而橫梗霉屬是中溫大曲酸化后最豐富的優(yōu)勢(shì)菌群，其原因是橫梗霉屬具有將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽的潛力，干擾乳酸菌的正反饋回路，使其能在一定濃度的乳酸環(huán)境下生存，從而成為優(yōu)勢(shì)菌群[30]。覆膜孢酵母屬是茅臺(tái)風(fēng)味大曲常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌群[39]，在大曲發(fā)酵過(guò)程中可以影響其他優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)，有助于醇類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)風(fēng)味化合物的形成[40]。

2.3 不同醬香大曲微生物相關(guān)性分析

在制曲過(guò)程中，大曲中的微生物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、共生及拮抗等關(guān)系相互影響從一個(gè)相對(duì)不穩(wěn)定的狀態(tài)逐漸形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微生物群落，為探究茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域5 種醬香大曲中優(yōu)勢(shì)微生物之間的關(guān)系，本研究基于Spearman相關(guān)系數(shù)（|r|＞0.7，P＜0.01）對(duì)5 種醬香大曲的優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析，平均度越大、連接線越多則節(jié)點(diǎn)越大。如圖5所示，5 種大曲正相關(guān)比例為56.88%～99.05%，負(fù)相關(guān)比例為0.95%～43.12%，距茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域較近的TS、WM、MH其正負(fù)相關(guān)較適中，而距茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域較遠(yuǎn)的DJ、WS其正相關(guān)遠(yuǎn)大于負(fù)相關(guān)。位于茅臺(tái)鎮(zhèn)赤水河右岸的MH、DJ、WS的邊緣明顯高于赤水河左岸的TS、WM的邊緣，并且具有更高的連接性（即平均程度），表明赤水河右岸曲樣微生物間的相互作用更強(qiáng)[41]。除DJ曲樣外，其他曲樣網(wǎng)絡(luò)圖分為三大模塊，梭菌屬（Clostridium）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）、擬青霉屬（Penicilliopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）均在5 種大曲中連接點(diǎn)最多的模塊，說(shuō)明這4 類(lèi)微生物菌群是5 種大曲共有的關(guān)鍵微生物菌群，對(duì)其他微生物菌群影響較大。值得關(guān)注的是，在DJ曲樣中，酵母屬（Saccharomyces）與其他優(yōu)勢(shì)微生物負(fù)相關(guān)；在WS曲樣中，高溫放線菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）與其他優(yōu)勢(shì)微生物負(fù)相關(guān)；在MH曲樣中，糖多孢菌屬、魏斯氏菌屬、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、高溫放線菌屬、擬青霉屬、覆膜孢酵母屬與其他優(yōu)勢(shì)微生物負(fù)相關(guān)，這些菌群對(duì)大曲微生物間的調(diào)控至關(guān)重要。而TS、WM的負(fù)相關(guān)的微生物較為混雜，這可能與地域和所處的微環(huán)境有關(guān)。圖5列出了各種曲樣優(yōu)勢(shì)菌屬之間的相互關(guān)系，雖然從現(xiàn)有結(jié)果中很難分析出優(yōu)勢(shì)菌屬之間關(guān)系的內(nèi)在原因，但可為進(jìn)一步研究菌種之間的相互作用提供依據(jù)。就目前結(jié)果看，梭菌屬、慢生芽孢桿菌屬、擬青霉屬、畢赤酵母屬與多種菌屬之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，以及在各曲樣中，與其他優(yōu)勢(shì)菌屬存在負(fù)相關(guān)的菌屬可以作為后續(xù)研究的重點(diǎn)微生物。

圖5 不同醬香大曲微生物共生網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Microbial cooccurrence networks of Daqu

2.4 不同醬香大曲微生物與理化相關(guān)性分析

大曲理化指標(biāo)中的水分、酸度、淀粉含量可在一定程度上反映大曲的質(zhì)量，液化力、糖化力、酯化力則反映大曲的酶系功能，而發(fā)酵力可反映大曲中某些微生物生長(zhǎng)情況。5 種大曲理化指標(biāo)均有顯著差異，如表3所示，大曲水分和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在9.12%～11.87%、55.50%～61.54%之間，水分越低即揮發(fā)程度越好，說(shuō)明大曲的成熟度越好，而淀粉含量體現(xiàn)在制曲過(guò)程中糖化酶對(duì)淀粉的消耗[42]。WS酸度最高為（2.17±0.02）mmol/10 g，顯著高于其他高溫大曲，說(shuō)明其內(nèi)部產(chǎn)酸微生物代謝及產(chǎn)酸代謝比較旺盛，當(dāng)酸度水平較高時(shí)，乳酸菌會(huì)成為大曲的優(yōu)勢(shì)菌群[30]。發(fā)酵力反映大曲中的某些微生物利用基質(zhì)生產(chǎn)酒精的能力，WM、DJ的發(fā)酵力明顯低于其他曲樣。糖化力、酯化力、液化力的大小可反映大曲中淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶的酶活大小，有研究表明芽孢桿菌屬和霉菌是影響大曲酶活性的因 素[21,33]，其中MH有較高的糖化力（251.13±4.10）U，WM有較高的酯化力（313.66±4.84）U，而DJ、WS均表現(xiàn)較低的液化力和糖化力。

表3 大曲樣品理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 3 Physicochemical indexes of Daqu samples

采用RDA研究?jī)?yōu)勢(shì)菌群與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，其中兩因素間的夾角為銳角時(shí)，表示存在正相關(guān)，反之為負(fù)相關(guān)，兩因素投影到另一個(gè)因素的長(zhǎng)度越長(zhǎng)則相關(guān)性越大。如圖6a所示，細(xì)菌中的葡萄球菌屬、假單胞菌屬、埃希氏桿菌屬、梭菌屬與水分和酸度呈正相關(guān)；高溫放線菌屬、尿素芽孢桿菌屬（Ureibacillus）、魏斯氏菌屬、糖多孢菌屬與淀粉含量、糖化力、液化力和酯化力呈正相關(guān)，其中，魏斯氏菌屬是影響大曲糖化力、液化力和酯化力的主要菌群，這與劉慧等[42]的研究結(jié)果一致。如圖6b所示，酵母屬、橫梗霉屬與發(fā)酵力呈正相關(guān)，且橫梗霉屬與糖化力相關(guān)性大于與液化力相關(guān)性，有研究表明橫梗霉屬與糖化酶系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白有關(guān)[37]。覆膜孢酵母屬、嗜熱真菌屬與酯化力、淀粉含量、糖化力、液化力呈正相關(guān)，而覆膜孢酵母屬是WM的優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明覆膜孢酵母屬是引起WM高酯化力的關(guān)鍵菌群。

圖6 不同醬香大曲微生物與理化指標(biāo)的RDAFig.6 Redundancy analysis of correlation between microbial communities and physicochemical indexes of Daqu

2.5 不同醬香大曲微生物與特征風(fēng)味的相關(guān)性分析

大曲的風(fēng)味物質(zhì)可直接或間接影響白酒發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的形成，對(duì)白酒終產(chǎn)品的復(fù)雜香氣具有重要的影響。本研究采用張曉婕等[14]的方法對(duì)大曲特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量，如表4所示，共檢測(cè)到45 種揮發(fā)性化合物。為了進(jìn)一步探究引起茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域醬香大曲特征風(fēng)味差異的微生物，選取14 種特征差異物質(zhì)和15 種優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行RDA。

如圖7a所示，芽孢桿菌屬與四甲基吡嗪、丙酸、異戊酸、鄰苯二甲酸二丁酯、2,3-丁二醇、苯乙醛呈正相關(guān)，已有研究報(bào)道芽孢桿菌屬是生產(chǎn)四甲基吡嗪、2,3-丁二醇的重要微生物[43-44]。魏斯氏菌屬與乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、正戊醇呈正相關(guān)；葡萄球菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬與2-甲基丁酸乙酯、正丁醇、乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚呈正相關(guān)。

如圖7b所示，曲霉屬與正丁醇、2-甲基丁酸乙酯呈正相關(guān)；青霉屬、嗜熱子囊菌屬與丙酸、4-乙基愈創(chuàng)木酚呈正相關(guān)；酵母屬與四甲基吡嗪呈正相關(guān)；橫梗霉屬是引起多種風(fēng)味物質(zhì)差異的關(guān)鍵菌群，與乙酸、異戊酸、2,3-丁二醇、苯乙醛、鄰苯二甲酸二丁酯呈正相關(guān)；覆膜孢酵母屬與乙酸乙酯呈正相關(guān)。綜上，細(xì)菌中的芽孢桿菌屬和真菌中的橫梗霉屬是引起大曲風(fēng)味物質(zhì)差異的優(yōu)勢(shì)菌群，覆膜孢酵母屬是乙酸乙酯的關(guān)鍵菌群，這與上述WM酯化力高相符合。

高溫大曲中的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量直接影響碳水化合物和氨基酸的運(yùn)輸和代謝[45]，芽孢桿菌屬作為高溫大曲的優(yōu)勢(shì)菌群，其數(shù)量與種類(lèi)直接影響大曲的特征風(fēng)味。有研究表明，可通過(guò)高溫壞境影響芽孢桿菌屬的生長(zhǎng)，促進(jìn)吡嗪類(lèi)、酸類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)化合物的生成[24,33,46]。橫梗霉屬是中高溫大曲產(chǎn)生酶和風(fēng)味前體化合物的潛在優(yōu)勢(shì)菌群，據(jù)報(bào)道在大曲酸化后成為最豐富的真菌，與苯乙酮、苯甲醇、丁酸等風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)[30]。覆膜孢酵母屬可提高淀粉酶活，增加物種豐富度，促進(jìn)醇類(lèi)、酯類(lèi)化合物的生成，對(duì)糖化酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味代謝物有積極的影響，與本研究結(jié)果一致[40,47]。

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)分析比較茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域醬香大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，并結(jié)合RDA法研究微生物與微生物、理化因子、特征風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，在細(xì)菌屬水平上，位于茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域的MH與同為赤水河右岸的DJ具有相似細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，芽孢桿菌屬是MH、DJ的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，而位于赤水河左岸的TS與WM的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似，魏斯氏菌屬與高溫放線菌屬在TS、WM的占比遠(yuǎn)高于MH、DJ、WS；在真菌屬水平上，DJ與WS具有相似的真菌群落結(jié)構(gòu)，而TS與WM的真菌結(jié)構(gòu)更相似，此外，橫梗霉屬、覆膜孢酵母屬在與茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域距離較近的TS、WM、MH中比例明顯高于茅臺(tái)鎮(zhèn)中心區(qū)域外的DJ、WS。網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性表明距茅臺(tái)鎮(zhèn)中心較遠(yuǎn)的DJ、WS優(yōu)勢(shì)微生物間的正相關(guān)遠(yuǎn)大于距茅臺(tái)鎮(zhèn)中心較近的TS、WM、MH；位于赤水河右岸的MH、DJ、WS優(yōu)勢(shì)微生物間相互作用更強(qiáng)。RDA發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬、橫梗霉屬與大曲的生產(chǎn)性能有較大相關(guān)性，而覆膜孢酵母屬可明顯影響大曲的酯化力；芽孢桿菌屬、橫梗霉屬是引起特征風(fēng)味物質(zhì)差異的主要菌群，覆膜孢酵母屬是產(chǎn)生乙酸乙酯的關(guān)鍵菌群。

茅臺(tái)鎮(zhèn)不同區(qū)域醬香大曲的微生物結(jié)構(gòu)、理化指標(biāo)以及風(fēng)味物質(zhì)各有差異，同時(shí)存在一定的相關(guān)性，本研究可為醬香白酒行業(yè)提供理論依據(jù)，同時(shí)為后續(xù)研究大曲的功能微生物及代謝提供一定參考。