枯草芽孢桿菌PW2產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)赭曲霉的抑制作用

余 璐，魏 琛，張凱歌，林親錄，王青云

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

赭曲霉（Aspergillus ochraceus）廣泛生長(zhǎng)在糧食、水果、咖啡、油料、茶葉等[1]食品原料及其加工產(chǎn)品。赭曲霉產(chǎn)孢能力很強(qiáng)，其孢子散落在空氣中能夠誘導(dǎo)兒童哮喘[2]和人類(lèi)肺病[3]。其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是一種腎毒性真菌毒素，具有致癌、致畸、遺傳毒性和免疫抑制作用[4]。OTA經(jīng)由胃腸道吸收后，經(jīng)血液流到腎臟，且在人或動(dòng)物體內(nèi)不易代謝消除，易在血液及消化組織器官中累積，可引發(fā)亞急性或慢性中毒[5]。OTA在1993年被國(guó)際癌癥研究會(huì)定為2B組致癌物質(zhì)[6]。目前，物理防霉方法常用氣調(diào)控制和低溫控制，但能耗費(fèi)用高，輔助設(shè)施不成熟[7]；傳統(tǒng)的化學(xué)熏蒸法中常使用磷化鋁、氯化苦、環(huán)氧乙烷等，其對(duì)環(huán)境造成的負(fù)面影響和對(duì)人類(lèi)健康的威脅問(wèn)題日益突 出[8]。因此，探尋低毒高效的綠色防霉劑已成為當(dāng)今食品防霉的必然需求。

芽孢桿菌（Bacillus）對(duì)真菌的抑制作用多是源于其產(chǎn)生的抗菌蛋白[9]、脂肽類(lèi)[10]及揮發(fā)性物質(zhì)（volatile compounds，VC）[11-12]，其中抗菌蛋白和脂肽類(lèi)的研究已比較成熟，而具有抗霉活性的VC開(kāi)始成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究表明，芽孢桿菌所產(chǎn)具有抗霉活性的揮發(fā)性復(fù)合物的主要成分有醇、醛、酮、酸、酚類(lèi)化合物及硫化物等[13-14]；枯草芽孢桿菌（B.subtilis）KA9產(chǎn)生的揮發(fā)性復(fù)合物不僅對(duì)辣椒植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，還對(duì)青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）有生防效果[15]；貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）所產(chǎn)揮發(fā)性復(fù)合物能夠抑制番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等病原真菌的菌絲生長(zhǎng)[16]；解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）T-5產(chǎn)生的揮發(fā)性復(fù)合物能顯著抑制引起番茄青枯病的青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)[17]。芽孢桿菌所產(chǎn)揮發(fā)性復(fù)合物不僅可抑制上述田間型植物病原真菌，還可用于采后儲(chǔ)藏期間的生物防治。甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（B.methylotrophicus）BCN2和蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）BCN10產(chǎn)生的揮發(fā)性復(fù)合物可以抑制從枇杷果實(shí)中分離的5 種采后病原菌生 長(zhǎng)[18]；巨大芽孢桿菌（B.megaterium）產(chǎn)生的揮發(fā)性復(fù)合物明顯抑制了稻谷中霉菌總數(shù)的增加，顯著降低了稻谷中黃曲霉毒素的含量[19]。然而，關(guān)于芽孢桿菌所產(chǎn)VC對(duì)赭曲霉的抑制作用迄今鮮見(jiàn)研究報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)室在前期研究中從稻谷中分離出1 株產(chǎn)抗霉VC的枯草芽孢桿菌PW2[20]，本實(shí)驗(yàn)以其所產(chǎn)VC為研究對(duì)象，鑒定其組分，測(cè)定所鑒定出單個(gè)化合物標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的抑制效果，從中篩選出關(guān)鍵抗霉揮發(fā)性物質(zhì)（key antifungal volatile compound，KAVC），研究KAVC對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的抑制效果，并探討其抗霉作用機(jī)理，旨在為探尋新型的食品用防霉熏蒸劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌PW2菌株由本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中從市售秈稻中分離、鑒定并保存；赭曲霉 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

異辛醇（純度≥99.5%）、2-壬酮（純度99%）、異丁酸（純度99%）、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（純度98.5%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二醇（純度98%）Sigma Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；赭曲霉毒素酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、瓊脂（生物試劑）北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生物試劑）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、葡萄糖（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯霉素（純度98%）上海麥克林生化科技股份有限公司。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6；營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：NA配方中不加瓊脂；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，氯霉素0.3 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值；馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：PDA配方中不加瓊脂；沙氏葡萄糖肉湯（sabouraud dextrose broth，SDB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，蒸餾水1000 mL。以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-54 A 型滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；Airtech SW-CJ-1 FD 型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）型萃取頭 美國(guó)Supelco公司；7890B-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；MJX-250B型霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Moleculer Devices公司；Quanta FEG250型掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司；Ni-U型正置熒光微分干涉顯微鏡 尼康儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赭曲霉孢子菌懸液制備

用含0.05%（V/V）吐溫80的無(wú)菌水沖洗PDA斜面上的赭曲霉孢子，4 層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度至1×106個(gè)/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。之后提到的赭曲霉孢子懸液，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為按此方法制備的孢子懸液。

1.3.2 PW2所產(chǎn)VC成分鑒定

取1 環(huán)PW2斜面菌種接到裝有10 mL NB培養(yǎng)基的頂空瓶中，以相同條件下不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[21]對(duì)PW2菌株所產(chǎn)VC進(jìn)行成分鑒定。采用峰面積歸一法計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

1.3.3 VC中抑制赭曲霉生長(zhǎng)的KAVC篩選

根據(jù)VC成分鑒定結(jié)果，選取鑒定出的單個(gè)成分并購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)品，采用平板對(duì)扣法[22]測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的抑制作用。平板對(duì)扣法的操作為：取5 μL赭曲霉孢子懸浮液接種于PDA平板中央，另一平板中放入含20 μL單個(gè)待測(cè)化合物的濾紙片，立即用保鮮膜繞皿口3 圈進(jìn)行密封。以相同條件下不加化合物的處理作為對(duì)照。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，對(duì)照組的菌落生長(zhǎng)完全，便停止培養(yǎng)。觀察記錄平板中赭曲霉的生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落直徑（cm），按下式計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)赭曲霉菌落生長(zhǎng)的抑制率。對(duì)比分析抑制率的高低，找出抑制赭曲霉生長(zhǎng)的KAVC。

1.3.4 倍半稀釋法測(cè)定KAVC在接觸條件下對(duì)赭曲霉的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）

取1 mL赭曲霉孢子懸液加到含有9 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中并搖勻，取190 μL加入96 孔板的第1列孔中，第2～9列孔中均加入100 μL，然后在第1列孔中加入KAVC 10 μL，采用倍半稀釋法[23]進(jìn)行連續(xù)稀釋。在第10列孔中加入不含孢子的PDB培養(yǎng)基100 μL，第11列孔中加入含孢子的PDB培養(yǎng)基100 μL，蓋上蓋子用保鮮膜纏繞3 圈封口，置于30 ℃，培養(yǎng)5 d后對(duì)照組菌絲正常生長(zhǎng)并產(chǎn)孢。在每孔加入1 mg/mL刃天青溶液10 μL，混勻，30 ℃孵育12 h，霉菌生長(zhǎng)較多的孔中刃天青藍(lán)色褪去，轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色甚至無(wú)色。通過(guò)目視觀察，將刃天青顏色無(wú)明顯變化的孔對(duì)應(yīng)的KAVC的最低濃度定義為MIC值。在后續(xù)機(jī)理研究的實(shí)驗(yàn)中異辛醇的劑量均基于此實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 平板對(duì)扣法測(cè)定KAVC在揮發(fā)條件下對(duì)赭曲霉的MIC和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）

平板對(duì)扣法操作如1.3.3節(jié)所述，濾紙片上KAVC添加量設(shè)置為0、10、20、30、40、50、60 μL，對(duì)應(yīng)的頂空含量分別為0、56、112、169、225、281 μL/L和337 μL/L（皿內(nèi)徑為9 cm，高2.8 cm，容積為0.178 L）。30 ℃培養(yǎng)7 d后以肉眼觀察PDA平板上赭曲霉無(wú)生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)接至新鮮PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)5 d后可以恢復(fù)生長(zhǎng)處理對(duì)應(yīng)的最低濃度為MIC，不能恢復(fù)生長(zhǎng)處理對(duì)應(yīng)的最低濃度為MBC。

1.3.6 KAVC對(duì)赭曲霉產(chǎn)毒的影響

在10 mL PDB培養(yǎng)基中接入100 μL赭曲霉孢子懸液，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，在無(wú)菌條件下加入KAVC，使之劑量分別為0、1/4 MIC、1/2 MIC和MIC，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后用Whatman No.1濾紙過(guò)濾，采用酶聯(lián)免疫吸附法[24-25]測(cè)定濾液中OTA的含量。

1.3.7 KAVC抑制赭曲霉生長(zhǎng)作用機(jī)理分析1.3.7.1 掃描電鏡觀察

用SDB培養(yǎng)基替代1.3.1節(jié)無(wú)菌水制備含1×107個(gè)/mL赭曲霉孢子的SDB培養(yǎng)基，取3 mL加入EP管中，再加入KAVC使之劑量分別為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 h，將孢子培養(yǎng)物5000×g離心5 min，棄去上清液，收集赭曲霉孢子，通過(guò)掃描電鏡[26]觀察KAVC對(duì)赭曲霉孢子形態(tài)的影響。

1.3.7.2 KAVC對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

赭曲霉孢子培養(yǎng)方法、KAVC 劑量分別為0、MIC、2 MIC、4 MIC，培養(yǎng)時(shí)間為12 h。將孢子培養(yǎng)物5000×g離心5 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，用5 μg/mL PI對(duì)孢子樣品染色，37 ℃、150 r/min孵育30 min，再用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的PI后，吸取20 μL在干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用正置熒光微分干涉顯微鏡[27]拍照觀察。

1.3.7.3 麥角甾醇含量的測(cè)定

取15 mL赭曲霉孢子懸液加入135 mL PDB培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，收集菌絲，稱(chēng)取1 g菌絲球分別放入異辛醇劑量為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC的無(wú)菌水中，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，過(guò)濾，將菌絲球放入試管中，加入5 mL 25 g/100 mL KOH-乙醇溶液，混合3 min，在85 ℃水浴中孵育4 h，冷卻，加入5 mL正庚烷和2 mL無(wú)菌水，然后強(qiáng)力旋流攪拌3 min，靜置1 h，取上層正庚烷用掃描分光光度計(jì)在230～300 nm范圍內(nèi)掃描，計(jì)算菌絲球中麥角甾醇含量[23]。

式中：A282nm、A230nm分別為樣品在282、230 nm處的吸光度；290和518分別為麥角甾醇和24（28）DHE% 的E值。

1.3.7.4 胞內(nèi)物質(zhì)泄漏測(cè)定

如1.3.7.3節(jié)收集菌絲，稱(chēng)取1 g菌絲球分別放入異辛醇劑量為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC的無(wú)菌水中，于30 ℃、150 r/min分別培養(yǎng)2、4、6、8 h，過(guò)濾，取濾液。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[28]分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，并用SPSS Statistics 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，分析各組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性（P＜0.05，差異顯著），用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PW2所產(chǎn)VC的成分組成

PW2所產(chǎn)VC共鑒定出41 種組分（表1），主要有酯、醛、烷烴、醇、酮、酸、烯烴等化合物。所鑒定出揮發(fā)性成分中，2-壬酮已被報(bào)道可有效抑制水果中灰葡萄孢菌（B.cinerea）等腐敗真菌的生長(zhǎng)，且已被作為水果的抗真菌劑使用[29]；十二醇能有效防治黃瓜霜霉?。≒seudoperonospora cubensis）[30]；異辛醇能降低柑橘采后被指狀青霉（Penicillium digitatum）感染的機(jī)率[31]；異丁酸可有效抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumfsp.lactucae）菌絲生長(zhǎng)[32]。雖然這些成分已被證明對(duì)植物病原菌具有抗霉活性，但其對(duì)赭曲霉的抑制作用鮮見(jiàn)報(bào)道。選取上述4 種成分和在VC中含量相對(duì)較高的2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯，購(gòu)買(mǎi)這5 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步研究其對(duì)赭曲霉的抑制作用。

表1 PW2所產(chǎn)VC的固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定結(jié)果Table 1 SPME-GC-MS identification of VC produced by strain PW2

2.2 KAVC的確定

通過(guò)平板對(duì)扣法測(cè)定5 種化合物標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果如圖1所示。30 ℃培養(yǎng)7 d后，對(duì)照組赭曲霉菌落生長(zhǎng)正常，十二醇對(duì)赭曲霉菌落生長(zhǎng)的抑制不顯著（P＞0.05），其他4 種化合物對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)都有顯著抑制作用，其中異辛醇對(duì)赭曲霉的抑菌活性最強(qiáng)。因此，將異辛醇確定為KAVC并進(jìn)行下一步的研究。

圖1 不同揮發(fā)性化合物處理對(duì)赭曲霉菌落形態(tài)（A）和菌落直徑、生長(zhǎng)抑制率（B）的影響Fig.1 Effects of different volatile compound treatments on colony morphology (A),colony diameter and growth inhibition rate (B) of A.ochraceus

2.3 異辛醇對(duì)赭曲霉的MIC及MBC

2.3.1 倍半稀釋法測(cè)定異辛醇在接觸條件下對(duì)赭曲霉的MIC

如圖2所示，能維持刃天青不變色的異辛醇最低劑量為1562.5 μL/L，在此劑量下對(duì)應(yīng)的孔中未見(jiàn)赭曲霉菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)劑量低于1562.5 μL/L時(shí)，對(duì)應(yīng)孔中指示劑變?yōu)闇\粉色或無(wú)色，肉眼可觀察到孔內(nèi)有菌絲體長(zhǎng)出。因此，接觸條件下異辛醇對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的MIC為1562.5 μL/L。

圖2 倍半稀釋法測(cè)定異辛醇對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的MICFig.2 Determination of the MIC of isooctanol against A.ochraceus by the sesqui-dilution method

2.3.2 平板對(duì)扣法測(cè)定異辛醇在揮發(fā)條件下測(cè)得異辛醇對(duì)赭曲霉的MIC和MBC

如圖3A所示，對(duì)照皿中赭曲霉正常生長(zhǎng)，劑量為56 μL/L的異辛醇處理組赭曲霉有少量生長(zhǎng)，而其他處理組中赭曲霉均未見(jiàn)生長(zhǎng)，將未見(jiàn)生長(zhǎng)的赭曲霉孢子轉(zhuǎn)接至新鮮PDA平板上培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接后的生長(zhǎng)情況如圖3B所示，觀察到112、169、225 μL/L的處理組均恢復(fù)生長(zhǎng)，而281 μL/L和337 μL/L的處理組均未恢復(fù)生長(zhǎng)，可知異辛醇對(duì)赭曲霉的MIC和MBC分別為112 μL/L和281 μL/L。

圖3 平板對(duì)扣法測(cè)定異辛醇對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的MIC（A）和MBC（B）Fig.3 Determination of MIC (A) and MBC (B) of isooctanol against A.ochraceus by plate buckling method

2.4 異辛醇對(duì)赭曲霉產(chǎn)毒的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，各處理組的OTA產(chǎn)量均顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)異辛醇劑量為MIC時(shí)，赭曲霉產(chǎn)生OTA量最低，與對(duì)照組相比其抑制率為23.67%。異辛醇可以有效降低OTA的產(chǎn)生，其抑制率隨異辛醇劑量增加而增高。

圖4 不同劑量異辛醇處理對(duì)赭曲霉產(chǎn)OTA的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of different doses of isooctanol on the production of ochratoxin A by A.ochraceus

2.5 異辛醇抑制赭曲霉生長(zhǎng)的作用機(jī)制

2.5.1 異辛醇對(duì)赭曲霉孢子形態(tài)的影響

由圖5可知，未經(jīng)異辛醇處理的赭曲霉孢子形態(tài)完整、表面光滑，而經(jīng)異辛醇處理后部分孢子出現(xiàn)凹陷，隨著異辛醇劑量的增加出現(xiàn)凹陷孢子增多，凹陷程度也在增加，且當(dāng)異辛醇為2 MIC時(shí)孢子還出現(xiàn)干癟，褶皺的現(xiàn)象。推測(cè)可能是異辛醇處理導(dǎo)致孢子內(nèi)容物流失，從而在外形上出現(xiàn)干癟和凹陷。

圖5 不同劑量異辛醇處理對(duì)赭曲霉孢子形態(tài)的影響（×20000）Fig.5 Effects of different doses of isooctanol on the morphology of A.ochraceus spores (× 20000)

2.5.2 異辛醇對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

PI是一種核酸染料，不能透過(guò)正常完整的細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜破損時(shí)，PI能透過(guò)破損的細(xì)胞膜繼而與DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光，從而用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性[33]。如圖6所示，明場(chǎng)下觀察，對(duì)照組的孢子體積明顯膨大，而異辛醇處理組的孢子未出現(xiàn)體積膨大；暗場(chǎng)下觀察，對(duì)照組孢子沒(méi)有產(chǎn)生紅色熒光，而異辛醇處理組產(chǎn)生紅色熒光，還觀察到異辛醇劑量為4 MIC時(shí)大量孢子被異辛醇包裹著且產(chǎn)生紅色熒光。結(jié)果說(shuō)明異辛醇處理后的赭曲霉孢子細(xì)胞膜完整性喪失。

圖6 不同劑量異辛醇對(duì)赭曲霉孢子細(xì)胞膜完整性的影響Fig.6 Effects of different doses of isooctanol on cell membrane integrity of A.ochraceus spores

2.5.3 異辛醇對(duì)赭曲霉麥角甾醇含量的影響

麥角甾醇是真菌中一種獨(dú)特的甾醇，是細(xì)胞膜的主要成分，主要保持細(xì)胞完整性和膜流動(dòng)性[34]。如圖7所示，與對(duì)照組相比較，在1/4 MIC、1/2 MIC和MIC的異辛醇作用下各處理組赭曲霉的麥角甾醇含量分別降低了42.68%、65.08%和65.40%。說(shuō)明異辛醇導(dǎo)致赭曲霉細(xì)胞膜中麥角甾醇含量降低，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞。這與2.5.2節(jié)中PI染色的觀察結(jié)果一致。

圖7 不同劑量異辛醇對(duì)赭曲霉的麥角甾醇紫外吸收?qǐng)D譜（A）及 含量（B）的影響Fig.7 Effects of different doses of isooctanol on the ultraviolet spectrum (A) and content (B) of ergosterol from A.ochraceus

2.5.4 異辛醇對(duì)赭曲霉胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的影響

如圖8所示，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的核酸和蛋白含量均增加，且處理組與對(duì)照組之間差異也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸顯著（P＜0.05）。說(shuō)明異辛醇對(duì)赭曲霉核酸和蛋白泄漏情況受處理時(shí)間的影響，且其作用效果存在劑量依賴性。異辛醇可能通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性[22]，使赭曲霉的核酸和蛋白泄漏，從而導(dǎo)致赭曲霉的生長(zhǎng)被抑制。

圖8 不同劑量異辛醇處理不同時(shí)間對(duì)赭曲霉核酸（A）和蛋白（B）泄漏的影響Fig.8 Effects of different doses of isooctanol on nucleic acid (A) and protein leakage (B) from A.ochraceus at different treatment times

3 討論

本研究結(jié)果表明枯草芽孢桿菌PW2所產(chǎn)具有抗霉活性的VC中含有酯、醛、烷烴、醇、酮、酸、烯烴類(lèi)等41 種成分，從這些成分中初步篩選出5 種單體化合物，購(gòu)買(mǎi)其標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)定它們對(duì)赭曲霉的抗霉活性，發(fā)現(xiàn)異辛醇對(duì)赭曲霉的抗霉活性最強(qiáng)。異辛醇，又名2-乙基己醇，是GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許使用的一種食品用合成香料。異辛醇還作為一種風(fēng)味物質(zhì)廣泛存在于小麥面包[35]、初榨橄欖油[36]、白酒大曲[37]和發(fā)酵泡菜[38]等食品中。亞慢性吸入毒性研究表明，質(zhì)量濃度為120 mg/L的異辛醇對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠在體質(zhì)量、死亡率、器官質(zhì)量、臨床生化和血液學(xué)參數(shù)方面均未觀察到不良反應(yīng)[39]。早在2009年就有研究報(bào)道了芽孢桿菌產(chǎn)生的異辛醇可以完全抑制黃瓜菌核病菌的菌絲生長(zhǎng)[40]，后續(xù)也有研究表明異辛醇可以參與植物生長(zhǎng)調(diào)控及病害防治[41]，可以防治甘蔗的紅腐病[42]，還能抑制草莓灰霉病菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[43]。最近研究發(fā)現(xiàn)水稻根際細(xì)菌釋放的包含異辛醇在內(nèi)的VC對(duì)引起水稻紋枯病的病原菌生長(zhǎng)有抑制作用[44]。說(shuō)明異辛醇具有抗真菌活性和值得信賴的安全性，其揮發(fā)性質(zhì)易于擴(kuò)散到食物中，有望成為食物防霉的新資源，但其抗霉的作用機(jī)制還有待研究。

本研究測(cè)得異辛醇對(duì)赭曲霉有顯著抗菌活性，且呈劑量依賴關(guān)系，不管是在揮發(fā)條件下還是接觸條件下，赭曲霉的生長(zhǎng)隨著異辛醇劑量的增高而逐漸被抑制。異辛醇在接觸條件下對(duì)赭曲霉的MIC值遠(yuǎn)高于揮發(fā)條件。這一結(jié)果與有些研究結(jié)果一致，Li Yanjun等[45]在研究山蒼子精油對(duì)黃曲霉的抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在揮發(fā)條件下抑制菌絲生長(zhǎng)和黃曲霉毒素B1合成所需要的用量比接觸條件下低；Wang Yanzhen等[46]發(fā)現(xiàn)，橙花醇在揮發(fā)條件下對(duì)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果大于接觸條件；Niu Ajuan等[47]也發(fā)現(xiàn)肉桂醛在揮發(fā)條件下的MIC遠(yuǎn)小于接觸條件。異辛醇在揮發(fā)條件下對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的MIC值為112 μL/L，與互葉白千層精油（2.5 mL/L）[48]和檸檬醛（200 μL/L）[49]對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的MIC值相比較，異辛醇對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)的MIC值低得多。因此與直接加入原料中相比，揮發(fā)條件下的抑制效果更好，異辛醇更適合以熏蒸劑的形式使用。使用熏蒸處理是防止食品腐敗的理想方法，快速有效，而且殘留少[47]。

本研究異辛醇處理后的赭曲霉孢子外形出現(xiàn)干癟和凹陷，赭曲霉細(xì)胞膜完整性被破壞，麥角甾醇含量降低以及胞內(nèi)物質(zhì)泄露均可推測(cè)異辛醇對(duì)赭曲霉的作用機(jī)制可能是與破壞其細(xì)胞膜有關(guān)[50-51]，目前的研究報(bào)道中丙酮酸乙酯通過(guò)破壞草酸青霉（Penicillium oxalicum）孢子的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而抑制草酸青霉的生長(zhǎng)[52]；橙花醇對(duì)黑曲霉（A.niger）的抑制研究表明，橙花醇抑制了黑曲霉麥角甾醇的合成，從而破壞了黑曲霉的膜完整性，引起膜的通透性發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[46]；ε-聚-L-賴氨酸可通過(guò)降解擴(kuò)展青霉菌（P.expansum）孢子的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致大量細(xì)胞物質(zhì)泄露，進(jìn)而減少或抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[53]。異辛醇作為親脂性化合物可能會(huì)聚集在細(xì)胞膜上，可以推測(cè)異辛醇很可能與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)及功能[46]，從而影響赭曲霉正常生長(zhǎng)和代謝并殺死赭曲霉。

由于VC具有高揮發(fā)性在應(yīng)用中會(huì)受到限制，目前對(duì)VC用于防霉的應(yīng)用研究中基本是將VC包埋在載體上，有將精油通過(guò)殼聚糖納米乳劑的包埋[54]，有將反式肉桂醛、甲基丁香酚和雌二醇等VC復(fù)合包埋在殼聚糖納米生物聚合物中[55]，也有將茴香精油包埋在殼聚糖納米聚合物中[56]，提高VC的穩(wěn)定性和有效性以應(yīng)用于食品防腐。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌PW2所產(chǎn)具有抗霉活性的VC中異辛醇對(duì)赭曲霉生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，異辛醇作為熏蒸劑使用時(shí)具有更低的MBC，其抑殺赭曲霉的作用機(jī)理與破壞細(xì)胞膜完整性有關(guān)。目前還鮮見(jiàn)對(duì)于異辛醇應(yīng)用于防霉的研究，而異辛醇作為VC，具有高揮發(fā)性和不穩(wěn)定性，后續(xù)研究可以將其采用納米包埋的方式，提高異辛醇的穩(wěn)定性和有效性，以此開(kāi)發(fā)安全、高效的新型防霉熏蒸劑。異辛醇用于食品熏蒸防霉其殘留量、安全性及系統(tǒng)的抗霉機(jī)理等問(wèn)題有待進(jìn)一步研究探討。