鴨蛋及黑黃咸蛋殼外細(xì)菌多樣性及PICRUSt基因功能預(yù)測分析

孫 靜，楊 雪，彭 旭，盧立志，曾 濤，單雨萌，周 彬，梁振華，賈 鳴，申 杰,，杜金平,

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430064）

鴨蛋含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等[1-2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為鴨蛋滋陰補(bǔ)腎，能夠提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)健康。鴨蛋作為咸蛋加工原料，其新鮮、潔凈、無暗紋無破損是保障加工品質(zhì)量的重要前提。限于我國以地面平養(yǎng)、網(wǎng)養(yǎng)為主的蛋鴨養(yǎng)殖現(xiàn)狀，鴨蛋常沾有羽毛、泥糞污等，臟蛋多，這種鴨蛋潔凈程度很難滿足加工高品質(zhì)咸蛋的需求[3]。一般認(rèn)為，被污染蛋殼表層的微生物會透過蛋殼滲入蛋內(nèi)而造成鴨蛋內(nèi)容物的污染[4-5]。有研究表明，由于蛋體表面的微生物數(shù)目增加，導(dǎo)致蛋體中微生物滲入污染鴨蛋的內(nèi)容物，特別是腸桿菌科的污染。細(xì)菌進(jìn)入蛋殼，不但會導(dǎo)致蛋殼內(nèi)部的結(jié)構(gòu)形式發(fā)生變化，還會破壞蛋殼中的主要營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致蛋殼蛋白變稀，系帶液化斷裂，蛋黃膜失去彈性斷裂；蛋清和蛋黃混合在一起會產(chǎn)生大量的硫化氫等難聞的氣味，從而導(dǎo)致蛋殼的保質(zhì)期受到影響。因此臟鴨蛋載菌，給鴨蛋加工及食品安全帶來極大隱患；同時，鴨蛋上附著的污物風(fēng)干后難以清洗，加大了生產(chǎn)難度，使產(chǎn)品質(zhì)量下降，影響成品風(fēng)味。原料鴨蛋的清潔程度即載菌量與加工效果關(guān)系密切[6]。

石一等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鮮雞蛋殼外細(xì)菌以厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）為主，葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢菌屬。盧昌麗等[8]通過對不同季節(jié)鴨蛋表面菌群多樣性分析得出，鴨蛋殼表面主要為厚壁菌門和放線菌門，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬和埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）為優(yōu)勢菌屬。因鴨雞的生活習(xí)慣、養(yǎng)殖場的環(huán)境不同，2 種禽類的蛋殼受污染的菌群存在差異[9]。目前已有研究并未探明新鮮鴨蛋表面微生物種類和數(shù)量對鴨蛋后續(xù)加工中品質(zhì)產(chǎn)生異變的影響，未能闡明鴨蛋加工前進(jìn)行潔凈處理的必要性。因此，理清鴨蛋載菌情況、鴨蛋載菌對加工的影響是解決臟鴨蛋加工的理論基礎(chǔ)課題。本研究選取不同潔凈程度的鴨蛋，測定鴨蛋的菌落總數(shù)，采用16S rDNA基因檢測分析鴨蛋的載菌組成，以分析比較鴨蛋載菌的表型及功能差異，以期為鴨蛋清潔生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨蛋來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所金水家禽養(yǎng)殖基地，相同日齡農(nóng)湖2號蛋鴨，分別采集蛋殼表面無明顯臟污蛋（CE）與有明顯臟污蛋（DE）及實(shí)驗(yàn)室腌制黑黃咸蛋（BSE）各200 枚。

RNasea、1×TE Biosharp生物科技有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 上海金畔生物科技有限公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit9 上海懋康生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國ABI公司；FLX800T酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；DYY-6C電泳儀 北京六一公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng) 北京百晶生物技術(shù)有限公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina 公司；Scilogex CF1524R常溫離心機(jī) 北京奧利賽克生物科技有限公司；K1302半微量凱氏定氮儀 上海君翼儀器設(shè)備有限公司；AD200L-H均質(zhì)機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鴨蛋分組與鴨蛋殼外菌液樣品的采集

按照莊宇[10]提出的抽樣工作要點(diǎn)，隨機(jī)選取CE、DE及BSE各40 枚。各組鴨蛋整蛋用無菌生理鹽水，常溫條件下置于超聲波清洗器中清洗，收集洗蛋水混合液作為CE、DE、BSE的殼外菌液樣本；在無菌環(huán)境下剝開蛋殼，分離蛋殼與殼膜，用200 mL無菌生理鹽水浸泡殼膜并蘸取擦拭蛋殼內(nèi)表面，收集該混合液作為CE、DE、BSE的殼內(nèi)菌液樣本；無菌條件下收集蛋白和蛋黃，混合均質(zhì)得到內(nèi)容物菌液樣本。無菌條件下收集蛋白和蛋黃，混合均質(zhì)得到內(nèi)容物菌液樣本。上述殼外、殼內(nèi)、內(nèi)容物樣本均分為2 份，分別用來測定菌落總數(shù)和MiSeq高通量測序。

1.3.2 菌落總數(shù)的測定

參照GB/T 4789.19—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 蛋與蛋制品檢驗(yàn)》[11]方法測定；微生物限量標(biāo)準(zhǔn)參照GB 2749—2015《蛋與蛋制品》[12]。

1.3.3 菌落多樣性的測定分析

由MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA（步驟參照試劑盒說明書）。對提取好的DNA樣品進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小判斷，利用紫外分光光度計(jì)對DNA進(jìn)行定量。過濾總序列中不合格的DNA模板，對合格的文庫根據(jù)Illumina MiSeq測序區(qū)域（V3＋V4），采用合成帶有barcode的特異引物進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。

根據(jù)barcode序列區(qū)分各個樣本reads，去除嵌合序列后得到有效數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。對細(xì)菌可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）在100%相似水平下進(jìn)行聚類分析，繪制稀釋曲線；通過α多樣性指數(shù)分析，即菌群豐度指數(shù)Chao和ACE、菌群多樣性指數(shù)Shannon和Simpson，評價測序深度指數(shù)覆蓋率，驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析的合理性，對這些α多樣性指數(shù)的計(jì)算方法詳見http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.html#module-skbio.diversity.alpha。以Venn圖形式表現(xiàn)多個樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，分析門和屬水平上物種多樣性及其對應(yīng)豐度，將聚類后屬水平上的數(shù)據(jù)以熱圖形式表示，物種分塊聚集后群落組成的相似性和差異性，顏色梯度代表差異大小。

1.3.4 菌落表型功能分析

利用BugBase軟件[13]預(yù)測細(xì)菌組表型，并按革蘭氏陰陽性、氧氣消耗、生物膜、潛在致病力等對鑒定到的微生物進(jìn)行組間差異分類。

1.3.5 菌落PICRUSt基因功能預(yù)測分析

PICRUSt是根據(jù)微生物群落的豐富度與數(shù)據(jù)庫比，在無法觀察的條件下，就可以推斷出生物群落的功能。通過高通量測序技術(shù)和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫比對，賦予基因信息生物學(xué)意義?；谝褱y細(xì)菌的測序數(shù)據(jù)，對樣本中微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)，結(jié)果以圖表形式表示。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.00軟件作圖，方差分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較分析，P＜0.05，差異顯著。相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)測定結(jié)果

如圖1所示，DE殼外菌落總數(shù)顯著高于CE，菌落總數(shù)差異顯著，殼內(nèi)菌落總數(shù)差別不大。BSE的殼內(nèi)及內(nèi)容物菌落總數(shù)大幅增加，DE和CE內(nèi)容物未檢出?？梢钥闯觯珼E攜帶的細(xì)菌水平顯著高于CE，DE更容易受到細(xì)菌污染；而BSE殼內(nèi)及內(nèi)容物攜帶細(xì)菌水平較高，BSE明顯腐敗變質(zhì)，不能繼續(xù)食用。

圖1 臟污鴨蛋、干凈鴨蛋和BSE殼外、殼內(nèi)及內(nèi)容物載菌數(shù)Fig.1 Number of bacteria on eggshell surface and shell membrane and in contents of stained duck eggs,clean duck eggs and BSE duck eggs

2.2 Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)與質(zhì)量控制

采用合成帶有barcode的特異引物進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3＋V4區(qū)PCR擴(kuò)增，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Illumina MiSeq測序，CE組獲得101215 條有效序列信息，DE組獲得51044 條優(yōu)化序列信息，BSE組獲得118059 條優(yōu)化序列信息。CE和DE組序列平均長度為402.86 bp和415.87 bp，CE和DE組樣品的檢出有效序列條數(shù)相差2 倍，差異顯著，說明兩個樣品間具有顯著差異。

以CE、DE、BSE 3 組洗蛋水混合液作為樣品，提取基因組DNA，樣品濃度與純度均符合PCR擴(kuò)增的要求。稀釋曲線可以反映檢測樣品中新物種的出現(xiàn)速度，曲線上某一點(diǎn)的斜率越大，表示出現(xiàn)新物種被檢測的速率越快，斜率越小則表示新物種出現(xiàn)的速率越慢。如圖2 所示，樣品測序量低于20000時，OTU數(shù)量還有明顯增加，說明此時樣品中還有較多物種沒有被檢測。當(dāng)測序量繼續(xù)增加時，大部分樣品的OTU雖仍有增加，但是趨勢平緩，細(xì)菌的多樣性增加已經(jīng)不明顯，則說明測序數(shù)量充分且合理，可用于進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。

圖2 各樣品的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial sample

2.3 鴨蛋表面菌落α多樣性分析

CE、DE、BSE殼外微生物α多樣性分析見表1。覆蓋率即各組分樣品中序列被測出的概率，均達(dá)到99%以上，因此測序深度足夠、該組數(shù)據(jù)可有效表示樣本中微生物多樣性的真實(shí)情況，測序可信度高。

表1 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical analysis of α diversity indexes

Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Faith_pd指數(shù)均可用來評估不同潔凈程度鴨蛋的物種豐富度，Chao指數(shù)越大，表明樣本豐度指數(shù)越高，Shannon指數(shù)越大，表明樣本多樣性越高，F(xiàn)aith_pd指數(shù)差異越大，說明細(xì)菌物種差異越顯著。從表1可以看出，DE組的Chao指數(shù)大于CE組，Shannon指數(shù)和Faith_pd指數(shù)CE組大于DE組，物種均勻度CE組大于DE組。DE組微生物豐度高于CE組，而CE組微生物多樣性更豐富、均勻度更高，兩個樣品Shannon指數(shù)相差1 倍左右，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BSE殼外微生物豐度，多樣性、均勻度均小于CE，推測咸蛋腌制時高鹽高滲的環(huán)境抑制了BSE殼表面微生物的生長[14]。

2.4 鴨蛋表面菌落組分OTU Venn圖分析

按100%的相似度聚類后歸為935 個OTU，包括 18 個門，256 個屬。由圖3可看出，BSE組與正常咸蛋（NBSE）組樣品殼內(nèi)共有OTU數(shù)為152 個，占NBSE組OTU數(shù)的10.71%，占BSE組OTU數(shù)的19.26%。由此可以看出NBSE組較BSE組殼內(nèi)細(xì)菌多樣性更豐富，可能是BSE中主要優(yōu)勢菌落為某種或幾種致黑類菌落，細(xì)菌種類多樣性不如NBSE。CE、DE和BSE組樣品殼外共有OTU有19 個，共有OTU分別占CE組4.50%，DE組3.42%，BSE組9.84%，各組重疊部分較小。由此可知，在不同分類水平上，不同潔凈程度的鴨蛋及BSE細(xì)菌水平均存在數(shù)量上的差異。DE組獨(dú)有的OTU數(shù)量多于CE組，說明DE組具有大量CE組沒有的微生物。在DE組獨(dú)有的OTU中占比最大為變形菌門（Proteobacteria）的嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），盧昌麗等[8]不同季節(jié)鴨蛋的表面細(xì)菌多樣性分析得出，不同季節(jié)的溫度、氣候環(huán)境對鴨蛋表面菌群多樣性有很大影響。楊伊磊等[9]研究表明，除了家禽的健康狀況差，禽蛋產(chǎn)出過程會受到污染外，養(yǎng)殖場的土壤、墊草、飼料、空氣、糞便等的衛(wèi)生狀況都會造成蛋殼表面細(xì)菌污染，因此導(dǎo)致DE比CE攜帶的細(xì)菌種群更為復(fù)雜多樣。BSE與DE組比BSE與CE組共有的OTU數(shù)少，但BSE組與DE組共有OTU相對豐度大，BSE組與CE組共有OTU相對豐度小、絕對含量也少。

圖3 不同樣品組分共有或獨(dú)有OTU數(shù)Venn圖Fig.3 Venn diagram showing shared and unique OTUs between bacterial samples

2.5 微生物種類分布比較

在門水平上對樣品進(jìn)行注釋分析，如圖4所示，BSE組優(yōu)勢菌占比較高的為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，分別為72.20%、16.13%和4.30%；NBSE組優(yōu)勢菌門則只有變形菌門，占比為82.83%，厚壁菌門和放線菌門占比僅2.09%和1.75%。CE優(yōu)勢菌占比較高的為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，分別為34.35%、27.25%和17.28%，擬桿菌門（Bacteroidetes）占比較少為8.29%；而DE優(yōu)勢菌占比較高的是變形菌門為89.01%，厚壁菌門和放線菌門分別占6.16%和3.98%。BSE組優(yōu)勢菌占比較高的是變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門，分別為76.50%、8.00%、6.76%、5.43%。結(jié)果表明，DE組和BSE組殼外變形菌門的豐度大幅增加，為核心優(yōu)勢菌門，CE組殼外變形菌門、厚壁菌門和放線菌門均為優(yōu)勢菌門，NBSE組殼內(nèi)變形菌門為核心優(yōu)勢菌門。由此可見，腌制過后NBSE和BSE殼內(nèi)優(yōu)勢菌門存在顯著差異，BSE殼內(nèi)外細(xì)菌相對豐度較高的都有厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，但各個菌門的相對豐度并不相同。研究表明，變形菌門是胃腸道中一類適應(yīng)性強(qiáng)、具有潛在致病性的常見菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌等病原菌，其豐度變化可直接對宿主健康產(chǎn)生影響[15]。大部分變形菌門的細(xì)菌都會導(dǎo)致肺炎、泌尿道等多種傳染病的癥狀[16-17]。劉肖利等[18]的研究表明，變形菌門為牛乳房炎的優(yōu)勢菌門。變形菌屬會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、卵磷脂分解，產(chǎn)H2S，蛋白呈暗褐色、蛋黃呈褐色或黑色[19]。由此可見：DE及BSE攜帶致病菌及導(dǎo)致鴨蛋變質(zhì)的腐敗菌的豐度高于CE，DE和BSE受污染程度大大增加。根據(jù)謝雨衡[20]的研究可知，變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門微生物能夠促進(jìn)致黑臭物質(zhì)H2S的產(chǎn)生，張伯涵[21]研究也證明了以上種類微生物對水體的致黑致臭有巨大作用，根據(jù)BSE和NBSE內(nèi)部優(yōu)勢菌門差異推測，咸蛋黑黃形成原因與內(nèi)部厚壁菌門和變形菌門豐度差異存在一定關(guān)系，當(dāng)厚壁菌門相對豐度過高時會產(chǎn)生致黑致臭物質(zhì)。

圖4 殼內(nèi)外微生物門水平相對豐度比較Fig.4 Comparison of relative abundance of bacteria at the phylum between the inside and the outside of duck eggshells

在屬水平上，圖5顯示相對豐度前10的菌屬，其他菌屬歸類為others。BSE殼內(nèi)優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）占46.04%，蒂西耶氏菌屬（Tissierella）占22.60%，羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）占4.50%，假單胞菌屬（Pseudomonas）占3.43%；NBSE殼內(nèi)優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬占50.80%，羅爾斯通氏菌屬占20.27%，貪銅菌屬（Cupriavidus）占2.45%。可以看出，與NBSE組相比，BSE假單胞菌屬和羅爾斯通氏菌屬相對豐度驟減，而芽孢桿菌屬、蒂西耶氏菌屬等菌屬相對豐度則有不同程度的上升。CE殼外優(yōu)勢菌屬為涅斯特捷科氏菌屬（Nesterenkonia）占9.08%、彎曲桿菌屬（Campylobacter）占7.91%、鏈球菌屬（Streptococcus）占3.41%、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）占2.92%、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）占2.65%和乳桿菌屬（Lactobacillus）占2.27%；DE殼外優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌（Psychrobacter）占86.01%、不動桿菌屬（Acinetobacter）占2.20%；BSE組殼優(yōu)勢菌屬為羅爾斯通氏菌屬占22.91%，沙雷氏菌屬（Serratia）占5.05%，放線菌屬（Actinomyces）占3.32%。在DE組中占絕對優(yōu)勢的嗜冷桿菌屬豐度占比高達(dá)85.99%，而CE組（籠養(yǎng)蛋）蛋殼表面嗜冷桿菌屬豐度占比小于1%。DE組中占2.20%的不動桿菌屬也是一種常見腐敗菌。研究表明，嗜冷桿菌屬Psychrobactersp.ZY214菌具有產(chǎn)脂肪酶的功能[22]，嗜冷桿菌屬是引起冷鮮雞冷藏保存過程中腐敗變質(zhì)的主要菌屬之一[23]，低溫冷藏鯧魚腐敗過程中，嗜冷桿菌屬與不動桿菌屬起到重要作用[24]。寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.sp3菌在25 ℃、微堿性條件下可以起到氧化水中S2-的功能，從而達(dá)到抑制水體黑臭的作用[25]。CE組中優(yōu)勢菌屬彎曲桿菌屬（豐度占比為7.94%）和涅斯特連科氏菌屬（豐度占比為8.87%）在DE組中豐度占比均小于1%。CE組中相對豐度為2.92%的寡養(yǎng)單胞菌屬，在DE中未檢出。BSE組中的第1優(yōu)勢菌屬是導(dǎo)致菌血癥感染的條件致病菌，還會對蛋清凝膠性、疏水性、色度改變等劣變品質(zhì)有較大影響[26]；第2優(yōu)勢菌屬沙雷氏菌屬屬于兼性厭氧菌，有研究指出該菌是腐敗變質(zhì)冰鮮鴨的第2優(yōu)勢菌種[27]。干凈鴨蛋菌群多種多樣，并且只有一小部分是致病菌，臟污鴨蛋的腐敗菌占很大優(yōu)勢，而能抑制鴨蛋腐敗變質(zhì)的菌群豐度很小，且未檢出。由此推測，DE比DE更容易腐敗變質(zhì)。因此鴨蛋產(chǎn)出后經(jīng)過清洗、消毒對減少腐敗菌、致病菌很有必要。

圖5 殼內(nèi)外微生物屬水平相對豐度比較Fig.5 Comparison of relative abundance of bacteria at the genus level between the inside and the outside of duck eggshells

為進(jìn)一步探究咸蛋異變的原因，對NBSE和BSE樣品的微生物進(jìn)行種水平的檢測，2 組樣品在種水平上豐度前10的微生物如圖6所示，其他菌種微生物被歸類為others。BSE組的優(yōu)勢菌種為皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）占4.50%，產(chǎn)氮假單胞菌（Pseudomonas azotoformans）占2.27%，偶發(fā)貪銅菌（Cupriavidus pauculus）占1.78%，清酒廣布乳桿菌（Lactobacillus sakei）占1.57%；NBSE組的優(yōu)勢菌種為產(chǎn)氮假單胞菌占50.46%，皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）占20.27%，偶發(fā)貪銅菌（Cupriavidus pauculus）占2.45%。吳彩葉等[28]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氮假單胞菌具有較強(qiáng)的組胺降解能力，能夠有效抑制組胺的生成并減少食品中原有的組胺含量，并且不會產(chǎn)生組胺，該菌具有一定程度的耐鹽性，但鹽濃度過高時會抑制其生長和酶活性。皮氏羅爾斯通氏菌則具有良好的苯酚降解能力，同時還具有一定的重金屬耐受能力[29]。這兩種菌在NBSE組中都有很高的豐度占比，但在BSE中相對豐度明顯減少，符合與前面屬水平相對豐度的檢測結(jié)果中NBSE組假單胞菌屬和羅爾斯通氏菌屬相對豐度驟減的現(xiàn)象。值得注意的是，在BSE組屬水平上占有優(yōu)勢地位的芽孢桿菌屬在種水平上并未有豐度前10的菌種存在，僅有清酒廣布乳桿菌與其同屬芽孢桿菌綱（Bacilli），因此可以推測，BSE存在許多歸屬于芽孢桿菌屬的不同微生物種類，朱天傲[30]在研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和淀粉液化芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）為醬制品中主要的潛在產(chǎn)生物胺菌，其分離菌株中大部分含鳥氨酸脫羧酶和精氨酸脫羧酶基因，這兩種酶都參與腐胺的生成；通過對豆瓣醬發(fā)酵環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽含量為5%或pH 5時，發(fā)酵液中生物胺含量會達(dá)到最高值；淀粉液化芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌，當(dāng)氧含量不足時會通過產(chǎn)胺進(jìn)行質(zhì)子跨膜運(yùn)輸獲得能量。結(jié)合咸蛋腌制環(huán)境看，咸蛋腌制時腌制液鹽含量在5%左右，且咸蛋腌制時鴨蛋處于與空氣隔絕的狀態(tài)下，這種環(huán)境可能會對鴨蛋中生物胺的產(chǎn)生起到促進(jìn)作用。

圖6 BSE和NBSE殼內(nèi)微生物種水平比較Fig.6 Comparison of relative abundance of bacteria at the species level between the inside of BSE and that of NBSE

2.6 鴨蛋殼外微生物表型分析

通過BugBase預(yù)測得到細(xì)菌群落表型分析示例[31]，圖7展示了樣本細(xì)菌群落在需氧性、革蘭氏染色陰陽性、氧化脅迫耐受性和致病性等表型上的相對豐度差異。

圖7 CE、DE和BSE組微生物表型預(yù)測Fig.7 Prediction of microbial phenotypes in CE,DE and BSE

綜合比較圖7A、B，CE微生物以厭氧為主，厭氧菌（主要為厚壁菌門）略多于需氧菌（為變形桿菌門、放線菌門），BSE微生物以需氧為主，厭氧的厚壁菌門在BSE樣品中豐度大幅降低、而需氧的變形桿菌門豐度大幅升高，推測鮮鴨蛋中厚壁菌門有一定的氧化脅迫耐受力，可在鹽漬時缺氧環(huán)境下發(fā)揮作用，當(dāng)“黑黃”產(chǎn)生時變形桿菌門又可大量增殖使蛋黃“黑化”程度加劇。這一現(xiàn)象與南寧市黑臭水體中變形桿菌門、厚壁菌門在黑臭生成階段與黑臭生成后的變化規(guī)律一致[21]。

綜合比較圖7C、D，NBSE微生物以革蘭氏陽性菌為主。圖7F表明新鮮鴨蛋具致病性的微生物主要為變形桿菌門，且相對豐度較低，而BSE致病性微生物變形菌門的豐度大幅增加，變形桿菌是廣泛分布于自然界及人和動物腸道中的致病菌[32]，由變形桿菌引起的食物中毒事件屢有報道[33-34]。由圖7E可知，CE的變形桿菌氧化脅迫耐受力較低，且相對豐度顯著低于BSE，說明鮮鴨蛋上承載的變形桿菌門可采用具有一定氧化性的清洗劑去除。

2.7 功能預(yù)測

圖8～10分別展示了BSE、CE、DE微生物涉及的功能通路，主要包括細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)、信息儲存和處理和新陳代謝，包含25 個代謝通路。從圖9、10可以看出，DE組在碳水化合物運(yùn)輸和代謝通路上的豐度遠(yuǎn)大于CE組，由此可看出，DE碳水化合物分解能力強(qiáng)于CE，發(fā)現(xiàn)微生物在脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝以及次級代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝通路上的微生物豐度DE＞CE。對比發(fā)現(xiàn)DE微生物致脂質(zhì)氧化分解成次級代謝物的能力強(qiáng)，推測DE微生物在脂質(zhì)代謝通路的活躍度明顯高于CE，脂質(zhì)氧化形成次級代謝物的能力也強(qiáng)于CE，而臟污鴨蛋在經(jīng)歷氧化劣變等一系列物化反應(yīng)后其脂質(zhì)氧化趨于平緩。在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝及無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝通路上微生物豐度CE＞DE，CE微生物在氨基酸及無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝通路上均活躍，推測微生物對CE氨基酸與無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝影響較大。輔酶運(yùn)輸和代謝通路上微生物豐度也呈現(xiàn)DE＞CE的規(guī)律，也說明DE中輔酶參與的生化反應(yīng)更為活躍。BSE微生物在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝通路上相對豐度最高，說明BSE微生物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝最為活躍；BSE在次級代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝通路上微生物豐度高于CE和DE，推測微生物對BSE脂質(zhì)氧化分解成次級代謝物的影響較大。雖然不同潔凈程度鴨蛋樣本預(yù)測的主要功能基因類別基本無差異，但豐度具有差異。DE碳水化合物以及脂質(zhì)代謝通路豐度高于CE，而CE氨基酸與無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝通路表現(xiàn)出較高的豐度。碳水化合物是微生物生長繁殖的基本營養(yǎng)物質(zhì)，這與DE微生物豐度高于CE的結(jié)果相符。由此推測，不同潔凈程度的鴨蛋殼外細(xì)菌發(fā)揮各自的功能基因影響鴨蛋殼外微生物合成代謝途徑，從而形成了DE容易腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。

圖8 BSE微生物代謝通路情況Fig.8 Microbial metabolic pathways in BSE

圖9 CE微生物代謝通路Fig.9 Microbial metabolic pathways in CE

圖10 DE微生物代謝通路統(tǒng)計(jì)Fig.10 Statistical analysis of microbial metabolic pathways in DE

圖11反映了各組代謝通路物種組成情況，DE組主要微生物為嗜冷菌屬、不動桿菌屬等，CE組主要微生物為賴氨酸芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、鏈球菌屬、未分類的慢生根瘤菌屬（unclassified_Rhizobiaceae）等，BSE組主要微生物為羅爾斯通菌屬、未分類的慢生根瘤菌屬、大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、污泥單胞菌屬（Pelomonas）等。

圖11 各組代謝通路物種組成情況Fig.11 Species composition of metabolic pathways

DE組中嗜冷菌屬占絕對優(yōu)勢，而CE組中嗜冷菌屬的相對豐度很低，由此推測，DE和CE在基因功能上的差異主要是由嗜冷菌屬引起。嗜冷桿菌是一種革蘭氏陰性菌，嗜冷，感染人較為少見。人來源的嗜冷桿菌主要為肺炎嗜冷桿菌和糞嗜冷桿菌[35]，吳國杰[36]研究表明，嗜冷桿菌產(chǎn)的酯酶Est10具有很強(qiáng)的耐鹽性，酯酶Est12對一些有機(jī)溶劑和去污劑也具有較好的活性和穩(wěn)定性。李建洲等[37]發(fā)現(xiàn)生鮮乳在低溫貯藏時會受嗜冷菌污染導(dǎo)致其大量繁殖并產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶?？梢姡珼E中嗜冷桿菌屬豐度較高，極難清洗去除，且在高濃度鹽水或鹽泥鹽漬加工咸蛋，其所屬酯酶Est10依然有致劣能力。徐瑤瑤等[25]研究發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌屬具有抑制水體黑臭的作用，CE導(dǎo)致腐敗變質(zhì)的嗜冷菌屬和不動桿菌屬豐度很低，而寡養(yǎng)單胞菌屬的豐度高，這也是潔凈程度高鴨蛋不易形成黑黃的原因。

3 結(jié)論

測定CE、DE和BSE表面微生物總量、種類和豐度的差異，預(yù)測它們表面微生物的功能，并對比NBSE和BSE之間蛋內(nèi)微生物的差異，得出DE表面微生物總量顯著高于CE，且DE與CE表面不同優(yōu)勢菌屬的不同功能使DE腌制后理論上品質(zhì)變差的概率更高，細(xì)菌豐度分布、表型分析和功能預(yù)測也表明DE與BSE更為接近，對BSE和NBSE殼內(nèi)檢測也篩選出在鴨蛋腌制中影響品質(zhì)的微生物。本實(shí)驗(yàn)從微生物方面研究不同表面潔凈程度的鴨蛋，以不同微生物所產(chǎn)生的不同效果為依據(jù)，明確了DE在后續(xù)咸蛋加工中品質(zhì)下降出現(xiàn)黑黃的概率顯著高于CE，為鴨蛋清潔生產(chǎn)的必要性提供了理論依據(jù)。