冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花品質(zhì)的影響

羅 密，俞夢(mèng)瑤，禹利君,2,，黃建安,2，王坤波,2，劉仲華,2,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯磚茶在特殊溫濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)真菌，又名金花菌，能分泌各種酶系，改善茯磚茶風(fēng)味口感[1-2]。特有的發(fā)花工藝使得茯磚茶區(qū)別于其他品類黑茶，其滋味醇和，具有濃郁的菌花香。藥理學(xué)研究表明，茯磚茶具有抗氧化[3]、調(diào)節(jié)腸道菌群[4]、降脂減肥[5]、降血糖[6]等功效。傳統(tǒng)茯磚茶加工流程復(fù)雜、周期長(zhǎng)，加工過(guò)程中易與外界環(huán)境進(jìn)行空氣置換，且在梅雨季節(jié)易滋生雜菌。而金花散茶是以純化的冠突散囊菌進(jìn)行調(diào)控發(fā)花，且發(fā)花前茶樣進(jìn)行滅菌處理，發(fā)花環(huán)境可控，所選的菌種單一，能極大縮短周期，杜絕雜菌生長(zhǎng)，促使生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。

櫧葉齊、云臺(tái)大葉和桃源大葉加工的黑毛茶是湖南安化黑茶加工的主要原材料。相關(guān)研究表明，這3 個(gè)品種的毛茶原料的水浸出物、茶多酚、可溶性糖等主體品質(zhì)指標(biāo)突出，是湖南黑茶加工的優(yōu)等原材料[7]。湖南安化黑毛茶加工工藝獨(dú)特，經(jīng)七星灶熏煙處理、毛茶篩分后拼配一定比例茶梗，形成了湖南茯磚茶特有的品質(zhì)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)工藝發(fā)花生產(chǎn)的茯磚茶，其發(fā)花期間香氣、滋味變化已有一定研究[8-9]，但使用單一冠突散囊菌株對(duì)湖南安化代表性茶廠生產(chǎn)的黑毛茶原料進(jìn)行發(fā)花比較，尚未見相關(guān)報(bào)道。課題組前期對(duì)系列冠突散囊菌進(jìn)行黑毛茶發(fā)花比較可知，從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中分離純化的冠突散囊菌LJSC.2001（GenBank登記號(hào)：MZ147020）平皿培養(yǎng)菌落質(zhì)地致密、厚實(shí)，生長(zhǎng)速度快；干茶上的金花顆粒亮黃不易變色，發(fā)花的茶樣茶湯黃亮、滋味甜醇。

因此，本研究選取冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶原料進(jìn)行散茶調(diào)控發(fā)花，分析黑毛茶發(fā)花茶樣的感官品質(zhì)、生化成分變化，并運(yùn)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HP-SPME-GC-MS）聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)性組分及特征品質(zhì)進(jìn)行剖析，以分析湖南代表性廠家提供的黑毛茶在同一條件下發(fā)花后所產(chǎn)生滋味品質(zhì)及香氣成分的特征差異，為后期不同黑毛茶原料冠突散囊菌LJSC.2001工廠化發(fā)花生產(chǎn)提供可借鑒的理論依據(jù)，并為茯磚茶加工的原料組成及拼配提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌LJSC.2001（Gen Bank 登記號(hào)：MZ147020）從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中分離純化得到，貯藏于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。夏秋季采摘一芽四、五葉及同等嫩度的對(duì)夾葉進(jìn)行黑毛茶加工，黑毛茶原料由湖南安化幾個(gè)代表性茶廠提供，編號(hào)依次為1、3、5、7、9、11。對(duì)應(yīng)的金花散茶樣品參考課題組Xu Shuai等[10]的方法在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備獲得，編號(hào)依次為2、4、6、8、10、12。各廠家提供的黑毛茶詳細(xì)信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)材料信息Table 1 Information about dark tea samples tested in this study

甲醇、乙腈（均為色譜純）美國(guó)TEDIA公司；沒(méi)食子酸、兒茶素、咖啡堿、可可堿標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma 公司；楊梅素、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品 曼斯特（成都）生物科技有限公司；福林-酚、碳酸鈉、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、水合茚三酮、98%濃硫酸、蒽酮、氯化鋁（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750型紫外-可見分光光度計(jì)、LC-M20A分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、GC/MS-QP2010型GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、PDMS/DVB固相微萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 黑毛茶及金花散茶制備

黑毛茶基本加工工藝流程：鮮葉→灑水灌漿→殺青→ 揉捻→渥堆→干燥。

具體工藝條件：1）鮮葉：原料為一芽四、五葉及同等嫩度對(duì)夾葉；2）灑水灌漿：按照鮮葉質(zhì)量添加10%的純凈水均勻噴灑茶鮮葉；3）殺青：使用6CST-100滾筒殺青機(jī)，待筒出風(fēng)口溫度達(dá)220～260 ℃時(shí)開始投葉，殺青4～5 min以保證殺青適度；4）揉捻：殺青葉趁熱揉捻，分“輕-重-輕”3 個(gè)階段，共15 min；5）渥堆：揉捻后轉(zhuǎn)入長(zhǎng)、寬、高各1.2 m的渥堆箱，渥堆8～12 h，至茶堆表面出現(xiàn)由熱氣凝結(jié)的水珠，葉色由暗綠變?yōu)辄S褐，青氣消失，可聞到明顯的酒糟氣味，附在葉表面的茶汁被葉肉吸收，黏性減少，解塊茶團(tuán)一打就散即為適度；6）干燥：分初烘和復(fù)烘；初烘溫度130～140 ℃，烘至七成干左右為宜，攤涼回潮至少30 min后進(jìn)行復(fù)烘；復(fù)烘溫度110～120 ℃，烘至茶葉含水量至10%以下。部分廠家按照其特有的加工工序在黑毛茶后續(xù)干燥時(shí)進(jìn)行剔梗和七星灶熏煙處理。

金花散茶基本工藝流程：黑毛茶→稱樣→復(fù)水→滅菌→接種→發(fā)花→干燥→金花散茶。

具體工藝條件：1）稱樣：準(zhǔn)確稱取對(duì)應(yīng)黑毛茶100 g；2）復(fù)水：對(duì)稱取的黑毛茶進(jìn)行復(fù)水，使其含水量達(dá)到30%左右，放置一段時(shí)間待水分分布均勻，密封三角瓶瓶口；3）滅菌：將三角瓶于121 ℃滅菌20 min，取出置于超凈工作臺(tái)中冷卻；4）接種：無(wú)菌條件下接入活化的冠突散囊菌LJSC.2001菌液7.5 mL（菌液的孢子懸液密度為1×106～1×107個(gè)/mL）；5）發(fā)花：于28 ℃、相對(duì)濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)花10～14 d，觀察到冠突散囊菌分布整瓶茶樣后終止發(fā)酵；6）干燥：70～80 ℃烘干90～120 min至含水量小于10%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 感官審評(píng)

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》[11]。由3 名具備評(píng)茶師資格審評(píng)人員和2 名茶學(xué)專業(yè)研究生組成，對(duì)黑毛茶及金花散茶外形、湯色、香氣、滋味、葉底5 項(xiàng)因子審評(píng)，金花散茶外形加評(píng)金花菌的附著程度和顆粒顏色。審評(píng)步驟：先看外形，再評(píng)內(nèi)質(zhì)；各茶樣稱取3.0 g于150 mL審評(píng)杯中，快速注滿沸水，加蓋浸泡2 min；按沖泡次序依次等速將茶湯瀝入評(píng)茶碗中，評(píng)湯色、嗅香氣、嘗滋味后，進(jìn)行第2次沖泡，時(shí)間5 min，審評(píng)程序與第1泡相同，加評(píng)葉底。結(jié)果以第2泡為主、綜合第1泡進(jìn)行評(píng)判。

1.3.3 生化成分測(cè)定

水浸出物測(cè)定采用GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》[12]；茶多酚測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[13]中福林-酚法；游離氨基酸測(cè)定采用GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》[14]；可溶性糖測(cè)定采用硫酸-蒽酮比色法[15]；黃酮測(cè)定采用三氯化鋁比色法[16]。

沒(méi)食子酸、兒茶素組分及生物堿檢測(cè)參照Wangkarn等[17]方法。試液制備參照GB/T 8302—2002《茶 取樣》，浸提液過(guò)0.45 μm纖維膜備測(cè)。HPLC條件：Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A：0.2%磷酸，B：甲醇∶乙腈＝95∶5；梯度洗脫程序：0～13 min，86%～77% A、14%～23% B；13～25 min，77%～64% A、23%～36% B；25～28 min，64% A、36% B；28～30 min，64%～86% A、36%～14% B；30～34 min，86% A、14% B；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。

黃酮醇類物質(zhì)檢測(cè)參照Samanidou等[18]方法，試液制備參照劉雁等[19]方法。HPLC條件：Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為0.2%磷酸，B 為100%甲醇；梯度洗脫程序：0～6 min，65%～50% A、35%～50% B；6～10 min，50%～40% A、50%～60% B；10～15 min，40% A、60% B；15～20 min，40%～65% A、60%～35% B；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.3.4 GC-MS揮發(fā)性成分檢測(cè)

取2.0 g樣品于20 mL萃取瓶，封口，80 ℃水浴平衡10 min后，將老化好的PDMS/DVB固相微萃取頭插入萃取瓶頂空部分，吸附50 min后取出，隨即將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃條件下解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC條件：HP-88石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，流速 1.37 mL/min。升溫程序：起始溫度60 ℃保持5 min；以3 ℃/min升至140 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃；轉(zhuǎn)接口溫度為220 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z45～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用GraphPad Prism8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05，差異顯著，所有數(shù)據(jù)均以表示。采用SIMCA-P 14.1軟件、聯(lián)川生物云平臺(tái)進(jìn)行作圖；根據(jù)總離子流圖、NIST17譜庫(kù)檢索，結(jié)合保留時(shí)間和質(zhì)譜確認(rèn)揮發(fā)性成分，結(jié)合文獻(xiàn)、篩選相似度大于80%的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析；采用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花的感官品質(zhì)結(jié)果

由表2可知，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后外形和內(nèi)質(zhì)均得到改善，綜合得分均上升。外形主要表現(xiàn)為發(fā)花后的干茶變得更加平伏，條索更顯緊結(jié)；色澤加深、油潤(rùn)度增加；金花滿披，菌粒淡黃偏白；發(fā)花后香氣均菌花香顯露、香氣濃郁，而不同黑毛茶的香氣品質(zhì)存在差異，其中櫧葉齊B和桃源大葉B的黑毛茶原料及金花散茶具有松煙香；湯色由淺變深、渾濁變明亮；滋味逐漸向醇和、醇厚方向轉(zhuǎn)變，其中云臺(tái)大葉B和桃源大葉A的黑毛茶原料及金花散茶不含梗，發(fā)花后其滋味更加醇厚，其余茶樣均含梗，滋味相對(duì)醇和；葉底變得柔軟明亮，顏色向紅棕、褐黑轉(zhuǎn)變。

表2 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

2.2 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花的滋味成分分析

2.2.1 常規(guī)生化成分分析

由表3 可知，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶的水浸出物含量總體呈升高趨勢(shì)，其中桃源大葉B增幅最大達(dá)10.26%（P＜0.05），而儲(chǔ)葉齊A、云臺(tái)大葉A經(jīng)發(fā)花后則呈下降趨勢(shì)，且云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)7.93%（P＜0.05）。茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖和黃酮含量總體呈下降趨勢(shì)?？扇苄蕴呛糠治鲋?，其中桃源大葉A降幅最大達(dá)27.77%（P＜0.05），而櫧葉齊B發(fā)花后則升高33.48%（P＜0.05）。茶多酚含量分析中，云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)55.65%（P＜0.05）。游離氨基酸和黃酮含量分析中，降幅最大均是云臺(tái)大葉B，分別降幅37.86%、38.71%（P＜0.05）。

表3 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的常規(guī)生化成分含量變化Table 3 Contents of biochemical components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001 %

2.2.2 沒(méi)食子酸、兒茶素組分、生物堿及黃酮醇類物質(zhì)的HPLC分析

如表4所示，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶的沒(méi)食子酸、可可堿和咖啡堿含量總體呈升高趨勢(shì)，兒茶素組分、楊梅素、槲皮素及山柰酚含量總體呈下降趨勢(shì)，但變化趨勢(shì)存在差異。沒(méi)食子酸含量分析中，桃源大葉A增幅最大達(dá)610.88%（P＜0.05），而櫧葉齊B、云臺(tái)大葉A發(fā)花后則下降，分別降幅32.56%、38.00%（P＜0.05）。可可堿分析中，桃源大葉B增幅最大達(dá)25.00%（P＜0.05），而云臺(tái)大葉A、云臺(tái)大葉B則下降，且云臺(tái)大葉B降幅最大達(dá)15.79%（P＜0.05）?？Х葔A含量分析中，桃源大葉B增幅最大達(dá)22.45%（P＜0.05），僅云臺(tái)大葉A下降6.87%。發(fā)花后酯型兒茶素（沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯）、楊梅素及槲皮素含量均顯著降低（P＜0.05），降幅最大依次為云臺(tái)大葉A（86.24%）、云臺(tái)大葉A（97.06%）、云臺(tái)大葉A（95.44%）、云臺(tái)大葉B（77.59%）及云臺(tái)大葉B（66.06%）。非酯型兒茶素（指表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素）及山柰酚總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表沒(méi)食子兒茶素含量分析中，均顯著下降（P＜0.05），且云臺(tái)大葉B降幅最大達(dá)（91.81%）；兒茶素含量分析中，桃源大葉A的降幅最大達(dá)80.79%（P＜0.05），而櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A、桃源大葉B則呈現(xiàn)上升，且云臺(tái)大葉A增幅最大達(dá)75.00%（P＜0.05）；表兒茶素含量分析中，其中云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)64.00%（P＜0.05），但桃源大葉A則增加0.67%；山柰酚含量分析中，云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)43.04%（P＜0.05）。

表4 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶化學(xué)組分含量Table 4 Chemical components of dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001 mg/g

2.3 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花的揮發(fā)性成分GC-MS分析

2.3.1 揮發(fā)性成分鑒定與相對(duì)含量分析

如表5所示，所有茶樣中共鑒定到69 種揮發(fā)性成分，包括碳?xì)漕?4 種、醇類16 種、醛類10 種、酮類10 種、酯類5 種、酚類4 種、內(nèi)酯類1 種、含氮化合物6 種、雜氧化合物3 種。

表5 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的揮發(fā)性 成分鑒定及相對(duì)含量Table 5 Relative content of volatile components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

由圖1可知，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶中主要揮發(fā)性成分是碳?xì)漕?、醇類、醛類、酮類、酯類。發(fā)花后，碳?xì)漕惪傮w無(wú)明顯變化，醛類和酯類上升，醇類和酮類下降，且其趨勢(shì)有所不同。其中櫧葉齊B及桃源大葉B黑毛茶發(fā)花后碳?xì)漕惢衔镲@著增多，而其余茶樣碳?xì)漕惖淖兓幻黠@；櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A黑毛茶發(fā)花后醛類增幅顯著高于其他茶樣；云臺(tái)大葉B、桃源大葉A黑毛茶發(fā)花后酯類增幅顯著高于其他茶樣；櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A黑毛茶發(fā)花后醇類降幅顯著高于其他茶樣；櫧葉齊B、桃源大葉B發(fā)花后酮類降幅顯著高于其他茶樣。

圖1 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的揮發(fā)性成分種類熱圖Fig.1 Heatmap of volatile components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶中主要的揮發(fā)性成分有62 種。其平均相對(duì)含量較高的主要是水楊酸甲酯、(,E)-2,4-庚二烯醛、正十三烷、正十四烷、(E)-呋喃氧化芳樟醇、正十二烷、芳樟醇、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-紫羅蘭酮、2,6,10-三甲基十三烷、苯乙烯、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮、苯乙酮、2-甲基四癸烷、十五烷、3-甲基十五烷、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、植酮等。與黑毛茶原料相比，其含量主要上升的有水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、正十三烷、(E)-呋喃氧化芳樟醇、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-2-己烯醛、苯乙酮、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛，且這些揮發(fā)性成分在不同的金花散茶中相對(duì)含量存在差異。其中，云臺(tái)大葉B金花散茶的水楊酸甲酯相對(duì)含量最高達(dá)（24.76%），櫧葉齊A及云臺(tái)大葉A金花散茶的(E,E)-2,4-庚二烯醛（14.91%、12.57%）、(E)-2-己烯醛（1.61%、1.90%）、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛（1.34%、1.59%）、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮（4.38%、4.20%）相對(duì)含量最高，櫧葉齊B金花散茶的正十三烷相對(duì)含量最高達(dá)（8.85%），桃源大葉B金花散茶的(E)-呋喃氧化芳樟醇（6.13%）、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物（3.11%）相對(duì)含量最高，桃源大葉A金花散茶的苯乙酮（2.44%）相對(duì)含量最高。這些揮發(fā)性成分在各金花散茶樣中均檢測(cè)出，且發(fā)花后相對(duì)含量上升，可初步說(shuō)明以上揮發(fā)性成分可能是構(gòu)成冠突散囊菌LJSC.2001“菌花香”的主要成分。

2.3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)所有揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖2A所示。該模型＝0.564，Q2＝0.062，表明擬合效果良好；還發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性成分主要是黑毛茶原料及金花散茶存在顯著差異，分別分布在左右不同區(qū)域，黑毛茶原料及金花散茶可明顯分為2 個(gè)類別。進(jìn)一步分析冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花對(duì)不同黑毛茶揮發(fā)性成分的影響，基于PCA結(jié)果構(gòu)建黑毛茶原料及金花散茶正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）模型，擬合參數(shù)為＝0.547，＝0.998，Q2＝0.941，表明該模型具有較好的分離和預(yù)測(cè)能力。在OPLS-DA模型上進(jìn)行Biplot分析（圖2B），這進(jìn)一步表明主要是黑毛茶原料及金花散茶的揮發(fā)性成分存在明顯差異。排列檢驗(yàn)200 次的交叉驗(yàn)證模型，檢驗(yàn)結(jié)果如圖2C所示，Q2負(fù)值說(shuō)明所建OPLS-DA模型可靠（R2＝0.900，Q2＝-0.547）。

圖2 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的揮發(fā)性成分多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Multivariate statistical analysis of volatile components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值可以量化OPLS-DA的各個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)大小，VIP值越大，貢獻(xiàn)率越大，VIP＞1為常見的特征揮發(fā)性成分篩選依據(jù)[20]。如圖2D所示，VIP＞1的揮發(fā)性成分共19 種，包括水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醇、苯甲醇、正十三烷、橙花醇、(E)-橙花叔醇、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-呋喃氧化芳樟醇、(E)-2-己烯醛、苯乙酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、異丁酸葉醇酯、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、甲基庚烯酮、β-紫羅蘭酮、2,6,10-三甲基十三烷、香葉基丙酮、雪松醇。為進(jìn)一步尋找潛在的特征揮發(fā)性成分，以VIP＞1結(jié)合發(fā)花后呈上升趨勢(shì)的揮發(fā)性成分作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選到9 種揮發(fā)性成分，按照VIP值由大到小依次為水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、正十三烷、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-呋喃氧化芳樟醇、(E)-2-己烯醛、苯乙酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮和(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛。其中，篩選到的特征揮發(fā)性成分中醛類和酯類共有4 種，說(shuō)明冠突散囊菌LJSC.200對(duì)酯類和醛類揮發(fā)性成分影響較大，這與上述揮發(fā)性種類和相對(duì)含量分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明了模型的可靠性，而這些揮發(fā)性成分應(yīng)是構(gòu)成冠突散囊菌LJSC.2001“菌花香”的特征揮發(fā)性成分。

3 討論

3.1 滋味品質(zhì)

感官審評(píng)結(jié)果表明，經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，滋味品質(zhì)得到提升，菌花香為主導(dǎo)香氣。其中，云臺(tái)山和白沙溪的金花散茶樣滋味更加醇和，這是因?yàn)槠浜诿栉催M(jìn)行剔梗處理，梗中可溶性糖含量相對(duì)更較高，使其滋味更加醇和。白沙溪的金花散茶樣除有明顯的菌花香以外，還有淡淡的松煙香，這是黑毛茶后續(xù)干燥進(jìn)行了七星灶熏煙，吸附了一定的松煙香，形成特有的綜合香氣。通過(guò)發(fā)花能可有效提高黑毛茶的品質(zhì)，但加工過(guò)程中的剔梗有利于滋味更加醇和，七星灶熏煙使香氣更加豐富。

生化成分結(jié)果表明，發(fā)花后內(nèi)含成分的總體變化趨勢(shì)為：水浸出物含量升高，可溶性糖含量下降，黃酮、茶多酚及游離氨基酸含量明顯下降。微生物的生長(zhǎng)需要不斷進(jìn)行養(yǎng)分供應(yīng)，促使茶葉中水溶性物質(zhì)浸出，而發(fā)花時(shí)的濕熱作用促使氨基酸與羧基化合物發(fā)生縮合，生成生物堿及其衍生物，氨基酸與糖類物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，且冠突散囊菌生長(zhǎng)過(guò)程中需要大量碳源和氮源維持自身的繁殖和代謝，導(dǎo)致氨基酸及可溶性糖下降[21-22]；茶葉中黃酮類以黃酮苷形式存在，黃酮苷受熱水解釋放糖基促使黃酮含量下降；同時(shí)發(fā)花過(guò)程中微生物能分泌各種酶系促進(jìn)茶多酚發(fā)生非酶促氧化，促使茶多酚含量下降[23-24]。但云臺(tái)山的儲(chǔ)葉齊及云臺(tái)大葉未進(jìn)行剔梗處理，發(fā)花后其水浸出物含量下降，這可能是冠突散囊菌更適合以茶梗為原料進(jìn)行自身繁殖生長(zhǎng)，對(duì)茶梗中內(nèi)含物進(jìn)行了充分利用使得其水浸出物的含量比黑毛茶有所下降?？扇苄蕴呛?jī)H以白沙溪的櫧葉齊發(fā)花后含量顯著升高，其黑毛茶經(jīng)歷了未剔梗、熏煙的后續(xù)處理，與白沙溪的桃源大葉呈相反的變化趨勢(shì)，這可能是櫧葉齊、桃源大葉二者的品種特性所導(dǎo)致。發(fā)花后，酯型兒茶素、楊梅素、槲皮素均顯著下降，非酯型兒茶素和山柰酚總體呈下降趨勢(shì)，而云臺(tái)山的櫧葉齊和云臺(tái)大葉、白沙溪的桃源大葉發(fā)花后兒茶素含量上升，且君和的桃源大葉發(fā)花后表兒茶素含量上升，這是冠突散囊菌在發(fā)酵過(guò)程中能分泌水解酶將酯型兒茶素水解成非酯型兒茶素和沒(méi)食子酸，使得發(fā)酵后酯型兒茶素 減少[25]；楊梅素、槲皮素及山柰酚屬于黃酮醇類物質(zhì)，發(fā)酵過(guò)程中由于受到微生物胞外酶的降解，總黃酮醇和黃酮的含量下降[26]。但本研究發(fā)現(xiàn)總體上云臺(tái)山的云臺(tái)大葉及云上的云臺(tái)大葉下降幅度最大，這可能是云臺(tái)大葉品種的差異所導(dǎo)致。生物堿及沒(méi)食子酸發(fā)花后總體呈升高趨勢(shì)，而白沙溪的櫧葉齊、云臺(tái)山的云臺(tái)大葉沒(méi)食子酸含量下降，云臺(tái)山的云臺(tái)大葉、云上的云臺(tái)大葉發(fā)花后可可堿則呈下降趨勢(shì)，云臺(tái)山的云臺(tái)大葉咖啡堿呈下降趨勢(shì)，這與微生物的多重轉(zhuǎn)化有關(guān)，許多真菌均可參與黑茶的物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，通過(guò)不同的微生物代謝途徑，使得沒(méi)食子酸發(fā)酵前期顯著升高，后期降低，生物堿含量發(fā)生變化[27]。

3.2 揮發(fā)性成分

黑毛茶發(fā)花前后其碳?xì)漕惪傮w變化不明顯，與Li Qin等[28]的研究結(jié)果一致，但在金花散茶中的相對(duì)含量較高。碳?xì)漕惙譃轱柡蜔N和不飽和烴，飽和烴對(duì)茶葉香氣貢獻(xiàn)較小，不飽和烴則起著一定的呈香作用，具有多種香型[29]，而本研究中檢測(cè)到的碳?xì)漕愔饕遣伙柡蜔N，如正十三烷。本研究發(fā)現(xiàn)白沙溪的櫧葉齊及桃源大葉發(fā)花后碳?xì)漕愶@著增多，這可能與其黑毛茶加工過(guò)程的熏煙處理有關(guān)。發(fā)花后醇類總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中(E)-呋喃氧化芳樟醇和(E)-芳樟醇-3,7-氧化物在金花散茶中相對(duì)含量較高，且參與“菌花香”構(gòu)成。茯磚茶中的醇類化合物分為開鏈脂肪族、萜醇類、芳香族和脂環(huán)族，在茯磚茶的加工過(guò)程中呈下降趨勢(shì)[28]，(E)-呋喃氧化芳樟醇和(E)-芳樟醇-3,7-氧化物屬于萜醇類，由特定的酶釋放出來(lái)、以皂苷的形式存在[30]，具有木香、花香、萜香、青香氣，被認(rèn)為是構(gòu)成“菌花香”的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[31]，本研究結(jié)果與之相符，但本研究還發(fā)現(xiàn)云臺(tái)山的櫧葉齊、云臺(tái)大葉黑毛茶發(fā)花后醇類的降幅最大，可能與品種有關(guān)。發(fā)花后酮類總體呈下降趨勢(shì)，其中苯乙酮及(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮在金花散茶含量較高，且參與構(gòu)成“菌花香”。酮類化合物分為開鏈脂肪族、脂環(huán)族、萜酮類和芳香族，酮類在茯磚茶的加工過(guò)程中整體呈下降趨勢(shì)，而苯乙酮屬于芳香族酮類，具有強(qiáng)烈的金合歡香氣、水果味，可以與苯乙醇相互轉(zhuǎn)化[32]，是茯磚茶“真菌香”的關(guān)鍵組成物質(zhì)[28]，(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮屬于開鏈脂肪族，具有果香，帶有青草氣，在茯磚茶的黑毛茶中含量最高，隨著發(fā)花時(shí)間的延長(zhǎng)，含量逐漸降低[33]，為“菌花香”貢獻(xiàn)青氣屬性[34]，本研究結(jié)果與之一致，且白沙溪的櫧葉齊和桃源大葉發(fā)花后降幅最大，可能與熏煙有關(guān)。發(fā)花后醛類總體呈升高趨勢(shì)，且(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、(E)-2-己烯醛在金花散茶中含量較高，參與“菌花香”形成。醛類化合物的氣味閾值低于其他揮發(fā)性化合物的氣味閾值，但對(duì)總體香氣有重要的潛在作用[35]，主要分為開鏈脂肪族、萜醛類和芳香族，在加工成茯磚茶過(guò)程中其含量整體是上升趨勢(shì)[36]，(E,E)-2,4-庚二烯醛具脂肪氣味、青草氣、蔬菜氣息，(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛具紫羅蘭香，(E)-2-辛烯醛具青氣味，均屬于開鏈脂肪族，參與形成“菌花香”[31]，而本研究發(fā)現(xiàn)云臺(tái)山的櫧葉齊和云臺(tái)大葉發(fā)花后增幅最大，可能是熏煙促使醇類和醛類的轉(zhuǎn)換。酯類發(fā)花后總體呈升高趨勢(shì)，且水楊酸甲酯含量較高，參與“菌花香”形成[37]，水楊酸甲酯呈冬青油、草藥香氣，被認(rèn)為是茯磚茶“菌花香”的關(guān)鍵組分，在茯磚茶加工過(guò)程中逐 漸上升[38]。

4 結(jié)論

以不同廠家提供的櫧葉齊、云臺(tái)大葉、桃源大葉黑毛茶進(jìn)行冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，感官品質(zhì)明顯提升，形成了濃郁菌花香，并保留黑毛茶原料的特有松煙香；發(fā)花促使茶葉中內(nèi)含成分呈下降趨勢(shì)，尤以苦澀味的酯型兒茶素物質(zhì)下降幅度最大；形成了水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-呋喃氧化芳樟、苯乙酮和(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、正十三烷為主體的菌花香組分。黑毛茶加工后經(jīng)歷剔梗與七星灶熏煙處理對(duì)發(fā)花后茶樣的品質(zhì)也產(chǎn)生了明顯影響，后續(xù)可細(xì)化黑毛茶工藝處理、擴(kuò)大黑毛茶的不同品種原料進(jìn)行發(fā)花對(duì)比研究，為茯磚茶加工的原料組成及拼配提供可借鑒的參考。