冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花品質(zhì)的影響

羅 密，俞夢(mèng)瑤，禹利君,2,，黃建安,2，王坤波,2，劉仲華,2,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯磚茶在特殊溫濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)真菌，又名金花菌，能分泌各種酶系，改善茯磚茶風(fēng)味口感[1-2]。特有的發(fā)花工藝使得茯磚茶區(qū)別于其他品類黑茶，其滋味醇和，具有濃郁的菌花香。藥理學(xué)研究表明，茯磚茶具有抗氧化[3]、調(diào)節(jié)腸道菌群[4]、降脂減肥[5]、降血糖[6]等功效。傳統(tǒng)茯磚茶加工流程復(fù)雜、周期長(zhǎng)，加工過程中易與外界環(huán)境進(jìn)行空氣置換，且在梅雨季節(jié)易滋生雜菌。而金花散茶是以純化的冠突散囊菌進(jìn)行調(diào)控發(fā)花，且發(fā)花前茶樣進(jìn)行滅菌處理，發(fā)花環(huán)境可控，所選的菌種單一，能極大縮短周期，杜絕雜菌生長(zhǎng)，促使生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。

櫧葉齊、云臺(tái)大葉和桃源大葉加工的黑毛茶是湖南安化黑茶加工的主要原材料。相關(guān)研究表明，這3 個(gè)品種的毛茶原料的水浸出物、茶多酚、可溶性糖等主體品質(zhì)指標(biāo)突出，是湖南黑茶加工的優(yōu)等原材料[7]。湖南安化黑毛茶加工工藝獨(dú)特，經(jīng)七星灶熏煙處理、毛茶篩分后拼配一定比例茶梗，形成了湖南茯磚茶特有的品質(zhì)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)工藝發(fā)花生產(chǎn)的茯磚茶，其發(fā)花期間香氣、滋味變化已有一定研究[8-9]，但使用單一冠突散囊菌株對(duì)湖南安化代表性茶廠生產(chǎn)的黑毛茶原料進(jìn)行發(fā)花比較，尚未見相關(guān)報(bào)道。課題組前期對(duì)系列冠突散囊菌進(jìn)行黑毛茶發(fā)花比較可知，從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中分離純化的冠突散囊菌LJSC.2001（GenBank登記號(hào)：MZ147020）平皿培養(yǎng)菌落質(zhì)地致密、厚實(shí)，生長(zhǎng)速度快；干茶上的金花顆粒亮黃不易變色，發(fā)花的茶樣茶湯黃亮、滋味甜醇。

因此，本研究選取冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶原料進(jìn)行散茶調(diào)控發(fā)花，分析黑毛茶發(fā)花茶樣的感官品質(zhì)、生化成分變化，并運(yùn)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HP-SPME-GC-MS）聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)性組分及特征品質(zhì)進(jìn)行剖析，以分析湖南代表性廠家提供的黑毛茶在同一條件下發(fā)花后所產(chǎn)生滋味品質(zhì)及香氣成分的特征差異，為后期不同黑毛茶原料冠突散囊菌LJSC.2001工廠化發(fā)花生產(chǎn)提供可借鑒的理論依據(jù)，并為茯磚茶加工的原料組成及拼配提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌LJSC.2001（Gen Bank 登記號(hào)：MZ147020）從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中分離純化得到，貯藏于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。夏秋季采摘一芽四、五葉及同等嫩度的對(duì)夾葉進(jìn)行黑毛茶加工，黑毛茶原料由湖南安化幾個(gè)代表性茶廠提供，編號(hào)依次為1、3、5、7、9、11。對(duì)應(yīng)的金花散茶樣品參考課題組Xu Shuai等[10]的方法在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備獲得，編號(hào)依次為2、4、6、8、10、12。各廠家提供的黑毛茶詳細(xì)信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)材料信息Table 1 Information about dark tea samples tested in this study

甲醇、乙腈（均為色譜純）美國TEDIA公司；沒食子酸、兒茶素、咖啡堿、可可堿標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma 公司；楊梅素、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品 曼斯特（成都）生物科技有限公司；福林-酚、碳酸鈉、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、水合茚三酮、98%濃硫酸、蒽酮、氯化鋁（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750型紫外-可見分光光度計(jì)、LC-M20A分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、GC/MS-QP2010型GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、PDMS/DVB固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 黑毛茶及金花散茶制備

黑毛茶基本加工工藝流程：鮮葉→灑水灌漿→殺青→ 揉捻→渥堆→干燥。

具體工藝條件：1）鮮葉：原料為一芽四、五葉及同等嫩度對(duì)夾葉；2）灑水灌漿：按照鮮葉質(zhì)量添加10%的純凈水均勻噴灑茶鮮葉；3）殺青：使用6CST-100滾筒殺青機(jī)，待筒出風(fēng)口溫度達(dá)220～260 ℃時(shí)開始投葉，殺青4～5 min以保證殺青適度；4）揉捻：殺青葉趁熱揉捻，分“輕-重-輕”3 個(gè)階段，共15 min；5）渥堆：揉捻后轉(zhuǎn)入長(zhǎng)、寬、高各1.2 m的渥堆箱，渥堆8～12 h，至茶堆表面出現(xiàn)由熱氣凝結(jié)的水珠，葉色由暗綠變?yōu)辄S褐，青氣消失，可聞到明顯的酒糟氣味，附在葉表面的茶汁被葉肉吸收，黏性減少，解塊茶團(tuán)一打就散即為適度；6）干燥：分初烘和復(fù)烘；初烘溫度130～140 ℃，烘至七成干左右為宜，攤涼回潮至少30 min后進(jìn)行復(fù)烘；復(fù)烘溫度110～120 ℃，烘至茶葉含水量至10%以下。部分廠家按照其特有的加工工序在黑毛茶后續(xù)干燥時(shí)進(jìn)行剔梗和七星灶熏煙處理。

金花散茶基本工藝流程：黑毛茶→稱樣→復(fù)水→滅菌→接種→發(fā)花→干燥→金花散茶。

具體工藝條件：1）稱樣：準(zhǔn)確稱取對(duì)應(yīng)黑毛茶100 g；2）復(fù)水：對(duì)稱取的黑毛茶進(jìn)行復(fù)水，使其含水量達(dá)到30%左右，放置一段時(shí)間待水分分布均勻，密封三角瓶瓶口；3）滅菌：將三角瓶于121 ℃滅菌20 min，取出置于超凈工作臺(tái)中冷卻；4）接種：無菌條件下接入活化的冠突散囊菌LJSC.2001菌液7.5 mL（菌液的孢子懸液密度為1×106～1×107個(gè)/mL）；5）發(fā)花：于28 ℃、相對(duì)濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)花10～14 d，觀察到冠突散囊菌分布整瓶茶樣后終止發(fā)酵；6）干燥：70～80 ℃烘干90～120 min至含水量小于10%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 感官審評(píng)

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》[11]。由3 名具備評(píng)茶師資格審評(píng)人員和2 名茶學(xué)專業(yè)研究生組成，對(duì)黑毛茶及金花散茶外形、湯色、香氣、滋味、葉底5 項(xiàng)因子審評(píng)，金花散茶外形加評(píng)金花菌的附著程度和顆粒顏色。審評(píng)步驟：先看外形，再評(píng)內(nèi)質(zhì)；各茶樣稱取3.0 g于150 mL審評(píng)杯中，快速注滿沸水，加蓋浸泡2 min；按沖泡次序依次等速將茶湯瀝入評(píng)茶碗中，評(píng)湯色、嗅香氣、嘗滋味后，進(jìn)行第2次沖泡，時(shí)間5 min，審評(píng)程序與第1泡相同，加評(píng)葉底。結(jié)果以第2泡為主、綜合第1泡進(jìn)行評(píng)判。

1.3.3 生化成分測(cè)定

水浸出物測(cè)定采用GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》[12]；茶多酚測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[13]中福林-酚法；游離氨基酸測(cè)定采用GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》[14]；可溶性糖測(cè)定采用硫酸-蒽酮比色法[15]；黃酮測(cè)定采用三氯化鋁比色法[16]。

沒食子酸、兒茶素組分及生物堿檢測(cè)參照Wangkarn等[17]方法。試液制備參照GB/T 8302—2002《茶 取樣》，浸提液過0.45 μm纖維膜備測(cè)。HPLC條件：Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A：0.2%磷酸，B：甲醇∶乙腈＝95∶5；梯度洗脫程序：0～13 min，86%～77% A、14%～23% B；13～25 min，77%～64% A、23%～36% B；25～28 min，64% A、36% B；28～30 min，64%～86% A、36%～14% B；30～34 min，86% A、14% B；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。

黃酮醇類物質(zhì)檢測(cè)參照Samanidou等[18]方法，試液制備參照劉雁等[19]方法。HPLC條件：Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為0.2%磷酸，B 為100%甲醇；梯度洗脫程序：0～6 min，65%～50% A、35%～50% B；6～10 min，50%～40% A、50%～60% B；10～15 min，40% A、60% B；15～20 min，40%～65% A、60%～35% B；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.3.4 GC-MS揮發(fā)性成分檢測(cè)

取2.0 g樣品于20 mL萃取瓶，封口，80 ℃水浴平衡10 min后，將老化好的PDMS/DVB固相微萃取頭插入萃取瓶頂空部分，吸附50 min后取出，隨即將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃條件下解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC條件：HP-88石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，流速 1.37 mL/min。升溫程序：起始溫度60 ℃保持5 min；以3 ℃/min升至140 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃；轉(zhuǎn)接口溫度為220 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z45～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用GraphPad Prism8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05，差異顯著，所有數(shù)據(jù)均以表示。采用SIMCA-P 14.1軟件、聯(lián)川生物云平臺(tái)進(jìn)行作圖；根據(jù)總離子流圖、NIST17譜庫檢索，結(jié)合保留時(shí)間和質(zhì)譜確認(rèn)揮發(fā)性成分，結(jié)合文獻(xiàn)、篩選相似度大于80%的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析；采用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花的感官品質(zhì)結(jié)果

由表2可知，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后外形和內(nèi)質(zhì)均得到改善，綜合得分均上升。外形主要表現(xiàn)為發(fā)花后的干茶變得更加平伏，條索更顯緊結(jié)；色澤加深、油潤(rùn)度增加；金花滿披，菌粒淡黃偏白；發(fā)花后香氣均菌花香顯露、香氣濃郁，而不同黑毛茶的香氣品質(zhì)存在差異，其中櫧葉齊B和桃源大葉B的黑毛茶原料及金花散茶具有松煙香；湯色由淺變深、渾濁變明亮；滋味逐漸向醇和、醇厚方向轉(zhuǎn)變，其中云臺(tái)大葉B和桃源大葉A的黑毛茶原料及金花散茶不含梗，發(fā)花后其滋味更加醇厚，其余茶樣均含梗，滋味相對(duì)醇和；葉底變得柔軟明亮，顏色向紅棕、褐黑轉(zhuǎn)變。

表2 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

2.2 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花的滋味成分分析

2.2.1 常規(guī)生化成分分析

由表3 可知，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶的水浸出物含量總體呈升高趨勢(shì)，其中桃源大葉B增幅最大達(dá)10.26%（P＜0.05），而儲(chǔ)葉齊A、云臺(tái)大葉A經(jīng)發(fā)花后則呈下降趨勢(shì)，且云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)7.93%（P＜0.05）。茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖和黃酮含量總體呈下降趨勢(shì)?？扇苄蕴呛糠治鲋?，其中桃源大葉A降幅最大達(dá)27.77%（P＜0.05），而櫧葉齊B發(fā)花后則升高33.48%（P＜0.05）。茶多酚含量分析中，云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)55.65%（P＜0.05）。游離氨基酸和黃酮含量分析中，降幅最大均是云臺(tái)大葉B，分別降幅37.86%、38.71%（P＜0.05）。

表3 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的常規(guī)生化成分含量變化Table 3 Contents of biochemical components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001 %

2.2.2 沒食子酸、兒茶素組分、生物堿及黃酮醇類物質(zhì)的HPLC分析

如表4所示，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶的沒食子酸、可可堿和咖啡堿含量總體呈升高趨勢(shì)，兒茶素組分、楊梅素、槲皮素及山柰酚含量總體呈下降趨勢(shì)，但變化趨勢(shì)存在差異。沒食子酸含量分析中，桃源大葉A增幅最大達(dá)610.88%（P＜0.05），而櫧葉齊B、云臺(tái)大葉A發(fā)花后則下降，分別降幅32.56%、38.00%（P＜0.05）?？煽蓧A分析中，桃源大葉B增幅最大達(dá)25.00%（P＜0.05），而云臺(tái)大葉A、云臺(tái)大葉B則下降，且云臺(tái)大葉B降幅最大達(dá)15.79%（P＜0.05）?？Х葔A含量分析中，桃源大葉B增幅最大達(dá)22.45%（P＜0.05），僅云臺(tái)大葉A下降6.87%。發(fā)花后酯型兒茶素（沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯）、楊梅素及槲皮素含量均顯著降低（P＜0.05），降幅最大依次為云臺(tái)大葉A（86.24%）、云臺(tái)大葉A（97.06%）、云臺(tái)大葉A（95.44%）、云臺(tái)大葉B（77.59%）及云臺(tái)大葉B（66.06%）。非酯型兒茶素（指表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素）及山柰酚總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表沒食子兒茶素含量分析中，均顯著下降（P＜0.05），且云臺(tái)大葉B降幅最大達(dá)（91.81%）；兒茶素含量分析中，桃源大葉A的降幅最大達(dá)80.79%（P＜0.05），而櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A、桃源大葉B則呈現(xiàn)上升，且云臺(tái)大葉A增幅最大達(dá)75.00%（P＜0.05）；表兒茶素含量分析中，其中云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)64.00%（P＜0.05），但桃源大葉A則增加0.67%；山柰酚含量分析中，云臺(tái)大葉A降幅最大達(dá)43.04%（P＜0.05）。

表4 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶化學(xué)組分含量Table 4 Chemical components of dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001 mg/g

2.3 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花的揮發(fā)性成分GC-MS分析

2.3.1 揮發(fā)性成分鑒定與相對(duì)含量分析

如表5所示，所有茶樣中共鑒定到69 種揮發(fā)性成分，包括碳?xì)漕?4 種、醇類16 種、醛類10 種、酮類10 種、酯類5 種、酚類4 種、內(nèi)酯類1 種、含氮化合物6 種、雜氧化合物3 種。

表5 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的揮發(fā)性 成分鑒定及相對(duì)含量Table 5 Relative content of volatile components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

由圖1可知，不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶中主要揮發(fā)性成分是碳?xì)漕?、醇類、醛類、酮類、酯類。發(fā)花后，碳?xì)漕惪傮w無明顯變化，醛類和酯類上升，醇類和酮類下降，且其趨勢(shì)有所不同。其中櫧葉齊B及桃源大葉B黑毛茶發(fā)花后碳?xì)漕惢衔镲@著增多，而其余茶樣碳?xì)漕惖淖兓幻黠@；櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A黑毛茶發(fā)花后醛類增幅顯著高于其他茶樣；云臺(tái)大葉B、桃源大葉A黑毛茶發(fā)花后酯類增幅顯著高于其他茶樣；櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A黑毛茶發(fā)花后醇類降幅顯著高于其他茶樣；櫧葉齊B、桃源大葉B發(fā)花后酮類降幅顯著高于其他茶樣。

圖1 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的揮發(fā)性成分種類熱圖Fig.1 Heatmap of volatile components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

不同黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，各金花散茶中主要的揮發(fā)性成分有62 種。其平均相對(duì)含量較高的主要是水楊酸甲酯、(,E)-2,4-庚二烯醛、正十三烷、正十四烷、(E)-呋喃氧化芳樟醇、正十二烷、芳樟醇、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-紫羅蘭酮、2,6,10-三甲基十三烷、苯乙烯、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮、苯乙酮、2-甲基四癸烷、十五烷、3-甲基十五烷、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、植酮等。與黑毛茶原料相比，其含量主要上升的有水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、正十三烷、(E)-呋喃氧化芳樟醇、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-2-己烯醛、苯乙酮、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛，且這些揮發(fā)性成分在不同的金花散茶中相對(duì)含量存在差異。其中，云臺(tái)大葉B金花散茶的水楊酸甲酯相對(duì)含量最高達(dá)（24.76%），櫧葉齊A及云臺(tái)大葉A金花散茶的(E,E)-2,4-庚二烯醛（14.91%、12.57%）、(E)-2-己烯醛（1.61%、1.90%）、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛（1.34%、1.59%）、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮（4.38%、4.20%）相對(duì)含量最高，櫧葉齊B金花散茶的正十三烷相對(duì)含量最高達(dá)（8.85%），桃源大葉B金花散茶的(E)-呋喃氧化芳樟醇（6.13%）、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物（3.11%）相對(duì)含量最高，桃源大葉A金花散茶的苯乙酮（2.44%）相對(duì)含量最高。這些揮發(fā)性成分在各金花散茶樣中均檢測(cè)出，且發(fā)花后相對(duì)含量上升，可初步說明以上揮發(fā)性成分可能是構(gòu)成冠突散囊菌LJSC.2001“菌花香”的主要成分。

2.3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)所有揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖2A所示。該模型＝0.564，Q2＝0.062，表明擬合效果良好；還發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性成分主要是黑毛茶原料及金花散茶存在顯著差異，分別分布在左右不同區(qū)域，黑毛茶原料及金花散茶可明顯分為2 個(gè)類別。進(jìn)一步分析冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花對(duì)不同黑毛茶揮發(fā)性成分的影響，基于PCA結(jié)果構(gòu)建黑毛茶原料及金花散茶正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）模型，擬合參數(shù)為＝0.547，＝0.998，Q2＝0.941，表明該模型具有較好的分離和預(yù)測(cè)能力。在OPLS-DA模型上進(jìn)行Biplot分析（圖2B），這進(jìn)一步表明主要是黑毛茶原料及金花散茶的揮發(fā)性成分存在明顯差異。排列檢驗(yàn)200 次的交叉驗(yàn)證模型，檢驗(yàn)結(jié)果如圖2C所示，Q2負(fù)值說明所建OPLS-DA模型可靠（R2＝0.900，Q2＝-0.547）。

圖2 冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花不同黑毛茶的揮發(fā)性成分多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Multivariate statistical analysis of volatile components in dark tea fermented by E.cristatum LJSC.2001

變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值可以量化OPLS-DA的各個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)大小，VIP值越大，貢獻(xiàn)率越大，VIP＞1為常見的特征揮發(fā)性成分篩選依據(jù)[20]。如圖2D所示，VIP＞1的揮發(fā)性成分共19 種，包括水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醇、苯甲醇、正十三烷、橙花醇、(E)-橙花叔醇、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-呋喃氧化芳樟醇、(E)-2-己烯醛、苯乙酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、異丁酸葉醇酯、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、甲基庚烯酮、β-紫羅蘭酮、2,6,10-三甲基十三烷、香葉基丙酮、雪松醇。為進(jìn)一步尋找潛在的特征揮發(fā)性成分，以VIP＞1結(jié)合發(fā)花后呈上升趨勢(shì)的揮發(fā)性成分作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選到9 種揮發(fā)性成分，按照VIP值由大到小依次為水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、正十三烷、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-呋喃氧化芳樟醇、(E)-2-己烯醛、苯乙酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮和(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛。其中，篩選到的特征揮發(fā)性成分中醛類和酯類共有4 種，說明冠突散囊菌LJSC.200對(duì)酯類和醛類揮發(fā)性成分影響較大，這與上述揮發(fā)性種類和相對(duì)含量分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了模型的可靠性，而這些揮發(fā)性成分應(yīng)是構(gòu)成冠突散囊菌LJSC.2001“菌花香”的特征揮發(fā)性成分。

3 討論

3.1 滋味品質(zhì)

感官審評(píng)結(jié)果表明，經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，滋味品質(zhì)得到提升，菌花香為主導(dǎo)香氣。其中，云臺(tái)山和白沙溪的金花散茶樣滋味更加醇和，這是因?yàn)槠浜诿栉催M(jìn)行剔梗處理，梗中可溶性糖含量相對(duì)更較高，使其滋味更加醇和。白沙溪的金花散茶樣除有明顯的菌花香以外，還有淡淡的松煙香，這是黑毛茶后續(xù)干燥進(jìn)行了七星灶熏煙，吸附了一定的松煙香，形成特有的綜合香氣。通過發(fā)花能可有效提高黑毛茶的品質(zhì)，但加工過程中的剔梗有利于滋味更加醇和，七星灶熏煙使香氣更加豐富。

生化成分結(jié)果表明，發(fā)花后內(nèi)含成分的總體變化趨勢(shì)為：水浸出物含量升高，可溶性糖含量下降，黃酮、茶多酚及游離氨基酸含量明顯下降。微生物的生長(zhǎng)需要不斷進(jìn)行養(yǎng)分供應(yīng)，促使茶葉中水溶性物質(zhì)浸出，而發(fā)花時(shí)的濕熱作用促使氨基酸與羧基化合物發(fā)生縮合，生成生物堿及其衍生物，氨基酸與糖類物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，且冠突散囊菌生長(zhǎng)過程中需要大量碳源和氮源維持自身的繁殖和代謝，導(dǎo)致氨基酸及可溶性糖下降[21-22]；茶葉中黃酮類以黃酮苷形式存在，黃酮苷受熱水解釋放糖基促使黃酮含量下降；同時(shí)發(fā)花過程中微生物能分泌各種酶系促進(jìn)茶多酚發(fā)生非酶促氧化，促使茶多酚含量下降[23-24]。但云臺(tái)山的儲(chǔ)葉齊及云臺(tái)大葉未進(jìn)行剔梗處理，發(fā)花后其水浸出物含量下降，這可能是冠突散囊菌更適合以茶梗為原料進(jìn)行自身繁殖生長(zhǎng)，對(duì)茶梗中內(nèi)含物進(jìn)行了充分利用使得其水浸出物的含量比黑毛茶有所下降?？扇苄蕴呛?jī)H以白沙溪的櫧葉齊發(fā)花后含量顯著升高，其黑毛茶經(jīng)歷了未剔梗、熏煙的后續(xù)處理，與白沙溪的桃源大葉呈相反的變化趨勢(shì)，這可能是櫧葉齊、桃源大葉二者的品種特性所導(dǎo)致。發(fā)花后，酯型兒茶素、楊梅素、槲皮素均顯著下降，非酯型兒茶素和山柰酚總體呈下降趨勢(shì)，而云臺(tái)山的櫧葉齊和云臺(tái)大葉、白沙溪的桃源大葉發(fā)花后兒茶素含量上升，且君和的桃源大葉發(fā)花后表兒茶素含量上升，這是冠突散囊菌在發(fā)酵過程中能分泌水解酶將酯型兒茶素水解成非酯型兒茶素和沒食子酸，使得發(fā)酵后酯型兒茶素 減少[25]；楊梅素、槲皮素及山柰酚屬于黃酮醇類物質(zhì)，發(fā)酵過程中由于受到微生物胞外酶的降解，總黃酮醇和黃酮的含量下降[26]。但本研究發(fā)現(xiàn)總體上云臺(tái)山的云臺(tái)大葉及云上的云臺(tái)大葉下降幅度最大，這可能是云臺(tái)大葉品種的差異所導(dǎo)致。生物堿及沒食子酸發(fā)花后總體呈升高趨勢(shì)，而白沙溪的櫧葉齊、云臺(tái)山的云臺(tái)大葉沒食子酸含量下降，云臺(tái)山的云臺(tái)大葉、云上的云臺(tái)大葉發(fā)花后可可堿則呈下降趨勢(shì)，云臺(tái)山的云臺(tái)大葉咖啡堿呈下降趨勢(shì)，這與微生物的多重轉(zhuǎn)化有關(guān)，許多真菌均可參與黑茶的物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，通過不同的微生物代謝途徑，使得沒食子酸發(fā)酵前期顯著升高，后期降低，生物堿含量發(fā)生變化[27]。

3.2 揮發(fā)性成分

黑毛茶發(fā)花前后其碳?xì)漕惪傮w變化不明顯，與Li Qin等[28]的研究結(jié)果一致，但在金花散茶中的相對(duì)含量較高。碳?xì)漕惙譃轱柡蜔N和不飽和烴，飽和烴對(duì)茶葉香氣貢獻(xiàn)較小，不飽和烴則起著一定的呈香作用，具有多種香型[29]，而本研究中檢測(cè)到的碳?xì)漕愔饕遣伙柡蜔N，如正十三烷。本研究發(fā)現(xiàn)白沙溪的櫧葉齊及桃源大葉發(fā)花后碳?xì)漕愶@著增多，這可能與其黑毛茶加工過程的熏煙處理有關(guān)。發(fā)花后醇類總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中(E)-呋喃氧化芳樟醇和(E)-芳樟醇-3,7-氧化物在金花散茶中相對(duì)含量較高，且參與“菌花香”構(gòu)成。茯磚茶中的醇類化合物分為開鏈脂肪族、萜醇類、芳香族和脂環(huán)族，在茯磚茶的加工過程中呈下降趨勢(shì)[28]，(E)-呋喃氧化芳樟醇和(E)-芳樟醇-3,7-氧化物屬于萜醇類，由特定的酶釋放出來、以皂苷的形式存在[30]，具有木香、花香、萜香、青香氣，被認(rèn)為是構(gòu)成“菌花香”的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[31]，本研究結(jié)果與之相符，但本研究還發(fā)現(xiàn)云臺(tái)山的櫧葉齊、云臺(tái)大葉黑毛茶發(fā)花后醇類的降幅最大，可能與品種有關(guān)。發(fā)花后酮類總體呈下降趨勢(shì)，其中苯乙酮及(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮在金花散茶含量較高，且參與構(gòu)成“菌花香”。酮類化合物分為開鏈脂肪族、脂環(huán)族、萜酮類和芳香族，酮類在茯磚茶的加工過程中整體呈下降趨勢(shì)，而苯乙酮屬于芳香族酮類，具有強(qiáng)烈的金合歡香氣、水果味，可以與苯乙醇相互轉(zhuǎn)化[32]，是茯磚茶“真菌香”的關(guān)鍵組成物質(zhì)[28]，(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮屬于開鏈脂肪族，具有果香，帶有青草氣，在茯磚茶的黑毛茶中含量最高，隨著發(fā)花時(shí)間的延長(zhǎng)，含量逐漸降低[33]，為“菌花香”貢獻(xiàn)青氣屬性[34]，本研究結(jié)果與之一致，且白沙溪的櫧葉齊和桃源大葉發(fā)花后降幅最大，可能與熏煙有關(guān)。發(fā)花后醛類總體呈升高趨勢(shì)，且(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、(E)-2-己烯醛在金花散茶中含量較高，參與“菌花香”形成。醛類化合物的氣味閾值低于其他揮發(fā)性化合物的氣味閾值，但對(duì)總體香氣有重要的潛在作用[35]，主要分為開鏈脂肪族、萜醛類和芳香族，在加工成茯磚茶過程中其含量整體是上升趨勢(shì)[36]，(E,E)-2,4-庚二烯醛具脂肪氣味、青草氣、蔬菜氣息，(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛具紫羅蘭香，(E)-2-辛烯醛具青氣味，均屬于開鏈脂肪族，參與形成“菌花香”[31]，而本研究發(fā)現(xiàn)云臺(tái)山的櫧葉齊和云臺(tái)大葉發(fā)花后增幅最大，可能是熏煙促使醇類和醛類的轉(zhuǎn)換。酯類發(fā)花后總體呈升高趨勢(shì)，且水楊酸甲酯含量較高，參與“菌花香”形成[37]，水楊酸甲酯呈冬青油、草藥香氣，被認(rèn)為是茯磚茶“菌花香”的關(guān)鍵組分，在茯磚茶加工過程中逐 漸上升[38]。

4 結(jié)論

以不同廠家提供的櫧葉齊、云臺(tái)大葉、桃源大葉黑毛茶進(jìn)行冠突散囊菌LJSC.2001發(fā)花后，感官品質(zhì)明顯提升，形成了濃郁菌花香，并保留黑毛茶原料的特有松煙香；發(fā)花促使茶葉中內(nèi)含成分呈下降趨勢(shì)，尤以苦澀味的酯型兒茶素物質(zhì)下降幅度最大；形成了水楊酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-芳樟醇-3,7-氧化物、(E)-呋喃氧化芳樟、苯乙酮和(E)-2-,(Z)-6-壬二烯醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、正十三烷為主體的菌花香組分。黑毛茶加工后經(jīng)歷剔梗與七星灶熏煙處理對(duì)發(fā)花后茶樣的品質(zhì)也產(chǎn)生了明顯影響，后續(xù)可細(xì)化黑毛茶工藝處理、擴(kuò)大黑毛茶的不同品種原料進(jìn)行發(fā)花對(duì)比研究，為茯磚茶加工的原料組成及拼配提供可借鑒的參考。