基于對硝基苯酚熒光內(nèi)濾效應(yīng)的脂肪酶活性測定

徐 陽，辛嘉英,2,*，李慧敏，王貴儒，王雨晴

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

脂肪酶的定義是催化甘油三酯水解成脂肪酸和甘油、單甘油酯或甘油二酯的酶，也叫做三酰甘油酯水解酶，可進行酯交換、酯化等，其廣泛存在于動物、植物等生物體內(nèi)[1-2]。隨著天然酶制劑應(yīng)用越來越廣泛，脂肪酶在食品工業(yè)中也占據(jù)了重要地位[3]。尤其脂肪酶活性對食品品質(zhì)有很大影響，其酶活性測定也成為食品檢測中十分重要的環(huán)節(jié)[4]。傳統(tǒng)測定脂肪酶活性的方法包括平板法、滴定法、比色法、熒光法[5-8]等，其中平板法、滴定法是操作相對簡便的兩種方法，但由于其靈敏度較差，測定結(jié)果不準(zhǔn)確，因此只能用來粗略判斷脂肪酶活性大小；比色法雖然反應(yīng)靈敏度高但操作流程復(fù)雜，易受反應(yīng)介質(zhì)、底物和環(huán)境因素如溫度、pH值的影響，具有反應(yīng)不穩(wěn)定等缺點[9-10]，因此，開發(fā)新方法測定脂肪酶活性將成為未來研究的重點。

基于納米金以及金納米簇的光學(xué)性質(zhì)測定脂肪酶活性具有簡便快速、靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，是一種良好的測定脂肪酶方法[11-12]。孫旭東[13]為檢測脂肪酶活性，研究了一種熒光探針。利用合成的氮金摻雜熒光納米點，使其表面氨基與銅離子配位結(jié)合，使熒光淬滅。巰基乙酸甲酯在脂肪酶作用下發(fā)生水解反應(yīng)，其水解產(chǎn)物巰基乙酸和銅離子的結(jié)合作用大于納米點與銅離子的結(jié)合作用，最終導(dǎo)致銅離子脫離熒光納米點，使得熒光強度恢復(fù)。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得出脂肪酶活性大小。田丹碧等[14]研究了一種納米金團簇?zé)晒庠鰪姺z測脂肪酶活性。其原理是利用脂肪酶水解巰基乙酸甲酯產(chǎn)生巰基乙酸，巰基乙酸能與納米金團簇穩(wěn)定結(jié)合，使得納米金團簇?zé)晒獍l(fā)射強度增加。但利用納米金法測定脂肪酶活性時，脂肪酶中蛋白含量會對實驗結(jié)果造成一定影響，對脂肪酶特殊作用界面的理論研究也并不充分[15-16]。因此，應(yīng)不斷深入開發(fā)納米金的制備及檢測新技術(shù)，成功實現(xiàn)對脂肪酶活性靈敏性的測定。

隨著學(xué)者們對熒光法認(rèn)識的進一步加深，熒光內(nèi)濾法已經(jīng)發(fā)展成了一種新型熒光分析方法[17]，早在1991年就被Gabor等[18]報道。熒光內(nèi)濾效應(yīng)指在反應(yīng)體系中熒光劑的激發(fā)或發(fā)射光被吸收劑所吸收，進而導(dǎo)致熒光劑的熒光強度降低[19-20]。由于吸收劑對熒光基團的吸收程度可轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒鈴姸鹊淖兓錂z測靈敏度在一定程度上也大大提高，檢出限也顯著降低[21]。目前，基于熒光內(nèi)濾效應(yīng)的檢測已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境等領(lǐng)域[22-24]。本研究提出一種基于熒光內(nèi)濾機理測定脂肪酶活性的傳感系統(tǒng)。金納米簇具有良好熒光性能可以成為理想的熒光劑，利用谷胱甘肽制備金納米簇，其激發(fā)波長為420 nm。對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）在405 nm波長處有紫外吸收峰，二者之間吸收與激發(fā)圖譜重疊，熒光劑的熒光被猝滅，可利用熒光內(nèi)濾效應(yīng)達到對脂肪酶活性檢測的目的。金納米簇可作為反應(yīng)體系的熒光團，棕櫚酸對硝基苯酯（p-nitrophenyl palmitate，p-NPP）在脂肪酶的作用下可水解轉(zhuǎn)化為p-NP，作為熒光內(nèi)濾的吸收劑可影響金納米簇的激發(fā)導(dǎo)致熒光強度降低，檢測機理如圖1所示。該方法具有操作簡便、靈敏度高以及樣品消耗少等優(yōu)點，在脂肪酶活性檢測方面具有良好的應(yīng)用前景，在食品工業(yè)領(lǐng)域具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（分析純）天津佳燁貴研科技有限公司；谷胱甘肽（98%）、p-NPP（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-HCl、牛血清白蛋白（均為分析純）北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、無水乙醇、阿拉伯膠、氫氧化鈉（均為分析純）天津市天力化學(xué)試劑有限公司；TritonX-100、異丙醇、磷酸（均為分析純）天津光復(fù)化工開發(fā)中心；考馬斯亮藍G-250（分析純）上海躍騰生物技術(shù)有限公司；硝酸、鹽酸（均為分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；脂肪酶Nvozyme435（分析純）諾維信（中國）投資有限公司；豬胰脂肪酶（30 U/mg）（分析純）上海金穗生物科技有限公司；假絲酵母脂肪酶（700 U/mg）（分析純）上海源葉生物科技有限公司；皺褶假絲酵母脂肪酶（700 U/mg）（分析純）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-50B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限 公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；BSA224S電子天平、PB-10酸度計 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV2550紫外-可見光譜儀 島津消耗品銷售 公司；F-7000FL熒光分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 金納米簇合成

根據(jù)文獻報道的方法[25]合成了谷胱甘肽修飾的金納米簇。將10 mL 4 mmol/L氯金酸溶液添加到10 mL 6 mmol/L谷胱甘肽溶液中。將混合物溶液混合，置于油浴鍋中，設(shè)置溫度為90 ℃，攪拌時間6 h。再使用10 kDa MWCO膜過濾器純化。將得到的濾液收集，置于冰箱，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脂肪酶底物溶液的制備[26]

溶液A：p-NPP 3 mg，溶于10 mL異丙醇中。溶液B：稱量TritonX-100溶液2 g，阿拉伯膠0.5 g，將兩者溶于450 mL的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）中，獲得混合物溶液B。將溶液A與溶液B按1∶9比例混合配制為乳狀液，穩(wěn)定2 h左右，即可獲得脂肪酶的底物溶液C。

1.3.3 脂肪酶活性的檢測

將50 μL不同活性脂肪酶添加到含450 μL脂肪酶的底物溶液C中，并加入1.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 7.5）調(diào)節(jié)pH值。然后在50 ℃水浴中加熱18 min，再加入400 μL谷胱甘肽-金納米簇溶液到反應(yīng)物中，于激發(fā)波長420 nm處得到金納米簇的熒光圖譜。

1.3.4 考馬斯亮藍法測定脂肪酶中蛋白含量[27]

染色液配制：將考馬斯亮藍G-250100 mg添加到100 mL 95%乙醇溶液中，再加100 mL 85% H3PO4溶液，加蒸餾水稀釋至1 L。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)液：0.1 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線：在6 支試管中分別加不同體積的BSA溶液，另取一支試管加1 mg/mL脂肪酶溶液1 mL，將7 支試管分別加水定容至1 mL。每管加入5 mL染液，搖勻，放置5 min，測OD595nm值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定脂肪酶的蛋白含量。

1.3.5 比色法測脂肪酶活性

p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制濃度在2.5～32.5 μmol/L的p-NP溶液，在波長405 nm波長處比色，以p-NP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。進而計算求得脂肪酶活性，具體方法可參見p-NP 法[28-29]，計算公式如下：

式中：X為脂肪酶活性/（U/mL）；C為p-NP濃 度/（μmol/mL）；V為最終體積/mL；V′為脂肪酶的添加量/mL；t為反應(yīng)時間/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽-金納米簇合成

合成谷胱甘肽修飾的金納米簇電鏡如圖2A所示，其粒徑約為2 nm。如圖2B所示，形成的金納米簇在420 nm激發(fā)波長下，580 nm處出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，在紫外光照射下顯示紅色熒光。

圖2 金納米簇的透射電鏡圖（A）和熒光光譜圖（B）Fig.2 TEM image (A) and fluorescence spectrum (B) of gold nanoclusters

2.2 金納米簇的穩(wěn)定性

探究光穩(wěn)定性、溫度和pH值對金納米簇的影響。由圖3A可知，金納米簇在420 nm處照射60 min，其歸一化熒光強度幾乎沒有變化，表明金納米簇具有良好的光穩(wěn)定性。圖3B表明，反應(yīng)溫度范圍在30～50 ℃之間時，對金納米簇的歸一化熒光強度幾乎沒有影響。如圖3C所示，pH值對金納米簇有一定的影響，熒光強度隨著pH值升高而增加，因此要嚴(yán)格控制金納米簇起始溶液的pH值，這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是由金納米簇表面官能團的質(zhì)子化-去質(zhì)子化所引起[30-31]。

圖3 抗光漂白性（A）、溫度（B）和pH值（C）對金納米簇的影響Fig.3 Photobleaching resistance of gold nanoclusters (A) and effect of temperature (B) and pH (C) on gold nanoclusters

2.3 基于熒光內(nèi)濾的熒光傳感機理

如圖4A所示，在脂肪酶存在條件下，p-NPP被水解成p-NP造成吸收峰紅移，從275 nm處紅移到405 nm處。金納米簇的激發(fā)波長在420 nm處，發(fā)射波長在580 nm處，則p-NP的紫外吸收光譜和金納米簇的激發(fā)光譜存在一定的重疊現(xiàn)象，使金納米簇的熒光減弱。

圖4 熒光法測脂肪酶活性的反應(yīng)機理圖Fig.4 Fluorescence spectra and effect of the inner filter effect on fluorescence intensity

為證明金納米簇?zé)晒饨档蛢H僅是由于脂肪酶水解產(chǎn)生的p-NP與金納米簇的熒光內(nèi)濾引起，進行如下實驗，當(dāng)金納米簇中加入酶或p-NPP時，對金納米簇?zé)晒鈴姸然旧蠜]有影響，當(dāng)加入p-NPP和脂肪酶時，其熒光強度減弱，證明了脂肪酶水解p-NPP產(chǎn)生的p-NP與金納米簇的熒光內(nèi)濾效應(yīng)減弱金納米簇?zé)晒鈴姸?，其他物質(zhì)對金納米簇的熒光沒有影響，當(dāng)在金納米簇中直接加入p-NP時，其熒光強度減弱，直接證明了該方法的有效性，見圖4B。

基于p-NP紫外吸收和金納米簇激發(fā)光譜之間的強烈重疊，使熒光強度發(fā)生降低，而p-NP的紫外光譜又會受到脂肪酶活性影響。當(dāng)脂肪酶活性較大時，對p-NPP的水解程度高，產(chǎn)生的p-NP濃度大，則p-NP紫外光譜圖與金納米簇的激發(fā)光譜重疊大，導(dǎo)致熒光顯著降低；反之脂肪酶活性小，對熒光強度的影響不大，熒光強度相對較高。對不同活力的皺褶假絲酵母脂肪酶水解產(chǎn)生的p-NP做了紫外光譜檢測，如圖5所示，其吸光度隨著脂肪酶活性的增大而增加。

圖5 不同活性褶皺假絲酵母脂肪酶的紫外-可見光譜圖Fig.5 UV-visible spectra of Candida rugosa lipase with different activities

2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過實驗優(yōu)化pH值、p-NPP質(zhì)量濃度、脂肪酶水解時間和溫度對金納米簇?zé)晒鈴姸鹊挠绊憽Ｒ韵鄬晒鈴姸龋晒鈴姸炔钪礔0-F）作為脂肪酶活性大小當(dāng)量，即脂肪酶活性越大時，水解產(chǎn)生的p-NP濃度越大，熒光內(nèi)濾效應(yīng)越強，對金納米簇的熒光減弱越大，相對熒光強度越大；反之，脂肪酶活性越小，相對熒光強度越小。如圖6所示，p-NPP質(zhì)量濃度在0.8～3.2 mg/mL之間，隨質(zhì)量濃度增大而增加，在1.6 mg/mL基本達到平衡，選擇最適質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL。其最適pH值為7.5，最適溫度50 ℃，時間為20 min。

圖6 褶皺假絲酵母脂肪酶檢測實驗條件優(yōu)化Fig.6 Optimal conditions for CRL activity detection

2.5 脂肪酶活性的檢測

圖7顯示了在不同皺褶假絲酵母脂肪酶活性條件下，金納米簇?zé)晒獾母淖?。隨著皺褶假絲酵母脂肪酶活性的增強，金納米簇?zé)晒鈴姸戎饾u降低。相對熒光強度（F0-F）與皺褶假絲酵母脂肪酶活性在5.6～196 U/L范圍內(nèi)呈正相關(guān)。線性方程y=2.0035＋0.9368x，相關(guān)系數(shù)r2=0.9978，檢出限為1.3 U/L（信噪比為3）。該檢測方法與比色法相比，其檢出限更低，并且不需對金納米簇進行修飾，檢測方法簡單靈活，可應(yīng)用于實際脂肪酶活性的檢測。

圖7 脂肪酶活性檢測的熒光圖譜Fig.7 Fluorescence spectra for lipase activity detection

2.6 抗干擾檢測

為了探究該反應(yīng)體系的抗干擾性，在溶液中加入乳糖、甘露糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、酪蛋白、纖維素酶、葡萄糖苷酶、淀粉酶、木聚糖酶、絲氨酸、木瓜蛋白酶。如圖8所示，金納米簇的相對熒光強度幾乎不受這些物質(zhì)影響，而脂肪酶加入后相對熒光強度明顯升高，結(jié)果表明該方法對脂肪酶有良好的選擇性。

圖8 抗干擾檢測Fig.8 Evaluation of anti-interference ability

2.7 熒光法與比色法對不同脂肪酶活性比較

為驗證結(jié)果的可靠性，采用p-NP法對不同種類脂肪酶活性進行了測定，見表1，比色法的測定結(jié)果與本研究所建立熒光法檢測脂肪酶活性結(jié)果順序一致，即皺褶假絲酵母脂肪酶＞假絲酵母脂肪酶＞豬胰脂肪酶。雖然本方法所采用的酶活性參數(shù)與比色法不同，但脂肪酶活性的變化趨勢完全一致。本方法采用相對熒光強度（F0-F）當(dāng)作脂肪酶活性大小的參數(shù)，相對熒光強度越高，說明脂肪酶活性越高。

表1 熒光法與比色法對不同脂肪酶活性比較Table 1 Comparison of lipase activity determined by fluorescence and colorimetric methods

3 結(jié)論

探究了一種基于熒光內(nèi)濾效應(yīng)檢測脂肪酶活性的方法，在該反應(yīng)體系中，以谷胱甘肽為修飾劑體和還原劑合成了谷胱甘肽-金納米簇，其作為反應(yīng)體系的熒光團，在脂肪酶的作用下，p-NPP水解為p-NP，其作為熒光的吸收劑，利用熒光內(nèi)濾機理測定脂肪酶活性。該方法具有操作簡便、靈敏度高以及樣品消耗少等優(yōu)點，在脂肪酶活性檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。