生食蔬菜源金黃色葡萄球菌毒素編碼基因和藥敏性分析

白小寶，索 佳，曹晨陽，蘇 麗，趙越凡，劉麗莎，馮承謙，呂 欣，楊保偉,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心，北京 100022；3.漢中市漢臺(tái)區(qū)市場監(jiān)督管理局過街樓蔬菜批發(fā)市場監(jiān)管所，陜西 漢中 723000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的食源性致病菌，廣泛分布于環(huán)境、動(dòng)物和人體[1-2]。2016年，金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食源性疾病暴發(fā)事件僅次于副溶血性弧菌和沙門菌[3]。隨著抗生素的長期使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）和苯唑西林敏感耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（oxacillin-susceptible methicillin-resistantStaphylococcus aureus，OS-MRSA）日漸流行，給食品安全帶來極大危害[4-6]。

新鮮生食蔬菜可提供人體必需的維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)，為日常飲食中不可或缺[7]。此類蔬菜經(jīng)常以生食為主，進(jìn)食前往往不經(jīng)高溫烹飪，被金黃色葡萄球菌及其腸毒素污染后非常容易導(dǎo)致食物中毒[8]。隨著MRSA和OS-MRSA日漸流行，其對食品安全構(gòu)成的潛在風(fēng)險(xiǎn)日益加劇[8-10]。

目前，針對生食蔬菜中致病菌的研究主要集中于沙門氏菌和大腸桿菌[7]，對金黃色葡萄球菌污染深入研究較少[11-15]。本研究對前期分離于陜西4 個(gè)城市大型超市、農(nóng)貿(mào)市場和攤販的西紅柿、生菜、菠菜和包菜的金黃色葡萄球菌進(jìn)行相關(guān)研究，旨在為生食蔬菜中金黃色葡萄球菌的安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

27 株疑似金黃色葡萄球菌，分離于2020年9月—2021年9月在陜西西安、寶雞、漢中和延安大型超市、農(nóng)貿(mào)市場和攤販采集的西紅柿、生菜、菠菜和包菜。藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。

1.1.2 試劑

LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；TaqDNA聚合酶、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Buffer、dNTP Mixture、MgCl2、DL2000 DNA Marker、Loading Buffer、Gel Red 大連寶生物工程有限公司；14 種 抗生素 北京索萊寶科技有限公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、GEL-DOCXR凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂 公司；SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Milli-Q Synthesis超純水機(jī) 德國默克密理博 公司；微量移液槍 德國艾本德股份公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MDF-U5411高壓滅菌鍋 上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR模板制備

將保存于-80 ℃的疑似菌劃線接種至LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取典型菌落再次劃線至LB；挑取1～2 個(gè)菌落，均勻分散于200 μL無菌去離子水，用煮沸法制DNA模板。

1.3.2nuc、毒素和耐藥性編碼基因檢測

使用PCR擴(kuò)增nuc基因鑒定金黃色葡萄球菌。陽性菌株通過PCR擴(kuò)增5 種經(jīng)典腸毒素編碼基因sea、seb、sec、sed和see，13 種新型腸毒素編碼基因seg、seh、sei、sej、sek、sem、sen、seo、sep、seq、ser、set和seu，殺白細(xì)胞毒素編碼基因pvl共19 種基因；擴(kuò)增大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性編碼基因ermA、ermB、ermC和msrA，四環(huán)素耐藥編碼基因tetK，氨基糖苷類抗生素耐藥編碼基因aac(6′)/aph(2″)，甲氧芐啶耐藥性編碼基因dfrD、dfrK、dfrG和dfrS1(dfrA)，β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性編碼基因blaZ和mecA等。

根據(jù)文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道的序列合成引物。PCR體系為25 μL，其中10×buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶0.25 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、超純水13.15 μL和模板DNA 5 μL。

1.3.3 抗生素藥敏性檢測

采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）頒布的瓊脂稀釋法，測定27 株菌對14 種抗生素的敏感性。供試抗生素及其耐藥折點(diǎn)分別為：紅霉素（erythromycin，ERY；8 μg/mL）、氨芐西林（ampicillin，AMP；0.5 μg/mL）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillin/clavulanic acid，A/C；8/4 μg/mL）、苯唑西林（oxacillin，OXA；4 μg/mL）、頭孢西?。╟efoxitin，F(xiàn)OX；8 μg/mL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP；4 μg/mL）、利福平（rifampin，RIF；4 μg/mL）、萬古霉素（vancomycin，VAN；16 μg/mL）、四環(huán)素（tetracycline，TET；16 μg/mL）、慶大霉素（gentamicin，GEN；16 μg/mL）、氯霉素（chloramphenicol，CHL；32 μg/mL）、阿米卡星（amikacin，AMK；64 μg/mL）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（trimethoprim/sulfamethoxazole，T/S；4/76 μg/mL）和頭孢曲松（ceftriaxone，CRO；64 μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌檢出

經(jīng)nuc鑒定，27 株疑似金黃色葡萄球菌均為金黃色葡萄球菌，在各種生食蔬菜中的流行情況不同。其中，10 株（37.0%，10/27）菌mecA陽性，全部對OXA敏感，均為OS-MRSA菌株（表1）。17 株（63.0%，17/27）菌為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA）。

表1 MSSA和OS-MRSA在生食蔬菜中的流行狀況Table 1 Prevalence of MSSA and OS-MRSA in vegetables consumed raw

2.2 毒素編碼基因檢出

在19 種供試毒素編碼基因中共檢出sea、seb、sec、seh、sek、sem、sen、seq8 種。其中，sec檢出率最高（29.6%，8/27），其次分別為seb和sek（22.2%，6/27），seh（11.1%，3/27），sea、sen和seq（7.4%，2/27），sem（3.7%，1/27）。未檢出sed、see、seg、sei、sej、seo、sep、ser、set和seu等腸毒素編碼基因和殺白細(xì)胞毒素基因pvl（表2）。

表2 生食蔬菜中金黃色葡萄球菌毒素編碼基因檢出率Table 2 Detection rates of toxin-encoding genes in S.aureus isolate from vegetables consumed raw

51.9%（14/27）的分離株至少攜帶1 種毒素編碼基因，共檢出9 種毒素編碼基因譜。其中，seb-sec-sek（11.1%，3/27），sec、sec-seh和seb-sek-seq（7.4%，2/27），sea、sen、sea-seh、seb-sek和sec-sem-sen（3.7%，1/27）比較常見（表3）。

表3 生食蔬菜中金黃色葡萄球菌毒素編碼基因譜Table 3 Profiles of toxin-encoding genes in S.aureus isolates from vegetables consumed raw

2.3 藥敏性檢測

27 株金黃色葡萄球菌全部對OXA、RIF和VAN敏感。對A/C耐受最為普遍（100.0%，27/27），其次分別為T/S（96.3%，26/27），AMP（92.6%，25/27），ERY（74.1%，20/27），F(xiàn)OX（40.7%，11/27），CIP（22.2%，6/27），CRO（14.8%，4/27），GEN（11.1%，3/27），AMK和TET（7.4%，2/27），CHL（3.7%，1/27）（表4）。

表4 生食蔬菜中金黃色葡萄球菌耐藥率Table 4 Drug resistance rates of S.aureus isolates from vegetables consumed raw

27 株分離株共呈現(xiàn)出12 種耐藥譜（表5）。最常檢出的耐藥譜為AMP-FOX-ERY-A/C-T/S（29.6%，8/27），其次分別為AMP-ERY-A/C-T/S（14.8%，4/27），AMP-A/C-T/S和AMP-CIP-ERY-A/C-T/S（11.1%，3/27），A/C-T/S（7.4%，2/27），AMP-A/C、AMP-CIP-A/C-T/S、AMP-CRO-ERY-A/C-T/S、AMP-FOX-CIP-ERY-A/C-T/S、AMP-FOX-GEN-TETCRO-ERY-A/C-T/S、AMP-FOX-CIP-GEN-AMK-CROERY-A/C-T/S和AMP-CHL-GEN-TET-AMK-CROERY-A/C-T/S（3.7%，1/27）。

表5 生食蔬菜中金黃色葡萄球菌的耐藥譜Table 5 Antibiotic resistance spectrum of S.aureus from vegetables consumed raw

菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥表型和基因型基本一致，對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素的耐藥表型和基因型檢出不一致（圖1）。

圖1 金黃色葡萄球菌耐藥表型和基因型相關(guān)性分析Fig.1 Correlation between antibiotic-resistant phenotypes and genotypes of S.aureus

2.4 耐藥基因檢出

在12 種供試耐藥性編碼基因中共檢出blaZ、mecA、ermC、tetK、dfrG、dfrK、aac(6′)/aph(2″)7 種基因。其中，blaZ檢出最高（88.9%，24/27），其次分別為mecA（37.0%，10/27），ermC（25.9%，7/27），tetK（18.5%，5/27），dfrG和dfrK（14.8%，4/27），aac(6′)/aph(2″)（3.7%，1/27）（表6）。

表6 生食蔬菜中金黃色葡萄球菌耐藥基因檢出率Table 6 Detection rates of antibiotic resistance-encoding genes in S.aureus from vegetables consumed raw

88.9%（24/27）的分離株至少攜帶1 種耐藥基因。27 株分離株中共檢出9 種耐藥基因譜，其中blaZ和blaZmecA（22.2%，6/27）最為常見，其次分別為ermCblaZ和dfrK-dfrG-blaZ（11.1%，3/27），tetK-blaZ-mecA（7.4%，2/27），ermC-tetK-blaZ、ermC-dfrK-dfrGblaZ、ermC-tetK-blaZ-mecA和ermC-tetK-aac(6′)/aph(2″)-blaZ-mecA（3.7%，1/27）（表7）。

表7 生食蔬菜中金黃色葡萄球菌耐藥性編碼基因譜Table 7 Drug resistance gene profiles of S.aureus from vegetables consumed raw

3 討論與結(jié)論

新鮮蔬菜含有糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、纖維素等多種營養(yǎng)成分，是人們膳食的重要組成部分，規(guī)律地?cái)z入蔬菜可以防治腫瘤、心血管疾病和降低 血脂[7,20]。在中國居民膳食平衡寶塔（2022）中，第2層為蔬菜和水果類，蔬菜每日應(yīng)攝入量為300～500 g[21]。隨著人們生活水平的提高，近年來對蔬菜、特別是生食蔬菜的消費(fèi)量持續(xù)增加。因此，生食蔬菜的食用安全性尤為重要。目前，已有在生食蔬菜中檢出金黃色葡萄球菌的報(bào)道[8,15,22]。

為更好掌握陜西省生食蔬菜中金黃色葡萄球菌的流行狀況及其基本特性，本研究對歷時(shí)13 個(gè)月，從省內(nèi)4 個(gè)地區(qū)大型超市、農(nóng)貿(mào)市場和攤販采集的西紅柿、生菜、菠菜和包菜中分離出的27 株金黃色葡萄球菌的藥敏性、耐藥基因和毒素基因進(jìn)行了研究。對27 株金黃色葡萄球菌的mecA基因和OXA敏感性檢測結(jié)果表明OS-MRSA菌株占37.0%（10/27）。張鵬飛等[4]在生豬養(yǎng)殖場分離到的OS-MRSA占金黃色葡萄球菌的13.4%（9/67），Zhang Pengfei等[23]在184 株零售食品源金黃色葡萄球菌中檢出7 株（3.8%）OS-MRSA。本研究發(fā)現(xiàn)生食蔬菜中OS-MRSA的檢出率高于生豬養(yǎng)殖場和零售食品。OS-MRSA菌株攜帶mecA，有可能在抗生素選擇下變?yōu)楦叨饶退幍腗RSA變種[24-25]。蔬菜生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈主要包括種植、運(yùn)輸、貯藏、加工或直接銷售等環(huán)節(jié)，任一環(huán)節(jié)都可能受到金黃色葡萄球菌的污染[7,13,26]。在種植地，蔬菜可能會(huì)被攜帶金黃色葡萄球菌的糞便和灌溉水直接或間接污染[7,13]。蔬菜從種植地采收、被運(yùn)輸?shù)酱笮统?、農(nóng)貿(mào)市場和攤販過程中，包裝不嚴(yán)、運(yùn)輸車輛、用具和人員被金黃色葡萄球菌污染等也均可導(dǎo)致蔬菜污染[7,13]。糞便、灌溉水和環(huán)境中金黃色葡萄球菌種類繁多，藥敏特性各不相同。因此，復(fù)雜眾多的生產(chǎn)環(huán)節(jié)均可能導(dǎo)致蔬菜攜帶較多OS-MRSA菌株。這充分表明，不應(yīng)忽視蔬菜作為食品載體進(jìn)一步傳播OS-MRSA的可能，對蔬菜種植及相關(guān)環(huán)境中OS-MRSA的存在和演變進(jìn)行追溯研究非常必要。

本研究發(fā)現(xiàn)陜西省蔬菜中51.9%（14/27）的金黃色葡萄球菌攜帶1～3 種毒素編碼基因，sec基因檢出率為29.6%，同時(shí)也檢出了seb和sek（22.2%），seh（11.1%），sea、sen和seq（7.4%），sem（3.7%）等，與肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌seb、sek（18.8%）的檢出率比較相似[27]。Wu Shi等[15]在零售蔬菜源金黃色葡萄球菌中也檢出了sec（83.3%）、seb（36.7%）、sek（30.0%）、seh（50.0%）、sea（26.7%）、sen（36.7%）、seq（50.0%）和sem（86.7%）等毒素編碼基因，但其檢出率均高于本研究。檢出率的差異可能與分離菌株地理位置和樣品類型有關(guān)。本研究中幾乎一半的分離株攜帶毒素基因，有9 種毒素編碼基因譜，比現(xiàn)制飲品中金黃色葡萄球菌毒素基因檢出率（34.9%）高，但比肉雞屠宰環(huán)節(jié)（96.9%）低[27-28]。表明蔬菜被腸毒素基因陽性金黃色葡萄球菌污染情況較為嚴(yán)重，可能會(huì)對食品安全產(chǎn)生潛在危害。

藥敏結(jié)果表明，所有菌株對A/C耐藥，70%以上的菌株分別對T/S、ERY和AMP耐藥，40%左右的菌株對FOX耐藥，可耐受2～9 種抗生素。菌株對AMP、CIP和RIF的耐藥率與Wu Shi等[15]在零售蔬菜中研究結(jié)果相似，對T/S、ERY、CIP和AMP的耐藥率與張鵬飛等[27]對肉雞屠宰環(huán)節(jié)的研究結(jié)果較相近，對A/C和AMP的耐藥率高于哈愛日等[29]對內(nèi)蒙古奶牛乳源中金黃色葡萄球菌的耐藥率。分離株呈現(xiàn)出的耐藥譜種類多于肉雞屠宰環(huán)節(jié)和現(xiàn)制飲品中金黃色葡萄球菌的耐藥譜[27-28]。耐受3 種及以上抗生素菌株的檢出率（88.9%）也高于即食食品和蔬菜（80.0%）[8]及雞肉中耐受相同種類抗生素菌株的檢出率（65.78%）[18]。蔬菜中金黃色葡萄球菌多重耐藥情況非常嚴(yán)重，這可能與抗生素在人類及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中過度使用相關(guān)[30-32]。因此，需要嚴(yán)格控制并減少抗生素的使用限制耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)。

綜上，在陜西省蔬菜中分離的27 株金黃色葡萄球菌中檢出了OS-MRSA，也檢出了MRSA。菌株多重耐藥情況比較嚴(yán)重，攜帶多種抗生素編碼基因和毒素編碼基因。應(yīng)加強(qiáng)對生食蔬菜中金黃色葡萄球菌的檢測和防控，以防止其通過食物鏈傳播，減少由此可能引發(fā)的食源性疾病。