乳鐵蛋白、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、高甲酯果膠和β-環(huán)糊精四元復(fù)合物基高內(nèi)相Pickering乳液的構(gòu)建及表征

謝麗清，徐班萌，梁新紅，李 波，楊 偉

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

高內(nèi)相Pickering乳液（high internal phase Pickering emulsion，HIPPEs）是內(nèi)相體積分數(shù)大于74%的一類Pickering乳液[1]。與傳統(tǒng)Pickering乳液相比，HIPPEs僅需少量固體或膠體顆粒就能穩(wěn)定油滴，所形成的乳液體系多為半固態(tài)凝膠結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的抗聚集、抗絮凝和抗奧氏熟化等特性[2-3]，在食品工業(yè)中可作為人造奶油替代物或活性物質(zhì)運載體系等[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，與單一顆?；蚨獜?fù)合物相比，多元復(fù)合物穩(wěn)定Pickering乳液的能力通常更加優(yōu)異。其中，蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物是目前研究熱點之一。許多三元復(fù)合物，如明膠-單寧酸-葡甘聚糖[5]、豌豆蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）-高甲氧基化果膠[6]、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）-姜黃素-燕麥β-葡聚糖[7]和LF-EGCG-低甲酯果膠[8]等，已成功用于穩(wěn)定Pickering乳液。在這些體系中，蛋白質(zhì)提供表面活性，多糖通過空間排斥或位阻提供物理穩(wěn)定性，而多酚一方面作為抗氧化劑為乳液體系提供化學(xué)穩(wěn)定性，同時通過“橋聯(lián)”作用與蛋白質(zhì)和多糖共同構(gòu)建出更加優(yōu)異的黏彈性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進一步提高了乳液的物理穩(wěn)定性。因此，推測在蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物顆粒基礎(chǔ)上進一步構(gòu)建四元復(fù)合物顆粒，可能會具有更加優(yōu)異的乳化穩(wěn)定能力，但目前仍鮮見相關(guān)研究。

β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是由8 個葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接的具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的低聚糖，具有獨特的疏水空腔，該特性使其能夠包埋小分子，提高小分子的穩(wěn)定性或水溶性[9]。另外，有研究報道，β-CD能夠穩(wěn)定Pickering乳液[10]。因此，將β-CD引入蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物體系，可能能夠通過與蛋白質(zhì)、多酚和多糖之間的相互作用改變復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，進而形成新的功能特性。目前，有關(guān)利用β-CD調(diào)控蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)和乳化特性的研究尚鮮見報道。

本研究在LF-EGCG-高甲酯果膠（high methoxylated pectin，HMP）三元復(fù)合物的基礎(chǔ)上引入β-CD，以進一步調(diào)控三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)。首先，借助多種光譜學(xué)技術(shù)表征四元復(fù)合物結(jié)構(gòu)；然后，制備HIPPEs并研究乳液的微觀結(jié)構(gòu)、流變和質(zhì)構(gòu)特性、3D打印特性以及冷藏穩(wěn)定性；最后，提出四元復(fù)合物形成以及其穩(wěn)定HIPPEs的作用機制。本研究能夠為蛋白質(zhì)-多酚-雙多糖四元復(fù)合物的構(gòu)建及其在HIPPEs中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LF（純度＞92%）新西蘭New Image國際有限公司；EGCG（純度＞98%）美國Sigma有限公司；β-CD、異硫氰酸熒光素、尼羅紅 上海源葉生物科技有限公司；HMP（甲酯化度72%）安徽喬富企業(yè)有限 公司；大豆油 上海益海嘉里食品股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA1-2 LD plus真空凍干機 德國Christ公司；IKA-T25數(shù)顯型高速剪切儀 德國艾卡公司；2100N型濁度計 美國Hach公司；Cary Eclipse型熒光分光光度計 美國安捷倫公司；TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；DCAT21型接觸角與表面張力儀 德國DatePhysics公司；Quanta 200型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）美國FEI公司；LSM780型共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laserscanning microscopy，CLSM）德國Zeiss公司；BT-9300H型激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司；Rheolaser Master型光學(xué)微流變儀 法國Formulaction 公司；TA.New plus型質(zhì)構(gòu)儀 美國ISENSO公司；食品3D打印機 杭州食印科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三元及四元復(fù)合物制備

在10 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，分別配制0.04 g/mL LF、4.0 mmol/L EGCG、0.025 g/mL HMP和0.01 g/mLβ-CD母液，充分溶解后使用。

設(shè)置2 個空白對照組：LF-EGCG-HMP三元復(fù)合物、LF-EGCG-β-CD三元復(fù)合物，分別記為MIX1和MIX2。依據(jù)β-CD的不同添加順序，構(gòu)建得到3 種四元復(fù)合物：LFβ-CD-EGCG-HMP、LF-EGCG-β-CD-HMP和LF-EGCGHMP-β-CD，分別記為MIX3、MIX4和MIX5。

配制過程構(gòu)建嚴格按照添加順序進行：MIX1：1 mL LF＋1.25 mL EGCG＋0.8 mL HMP＋1.95 mL PBS；MIX2：1 mL LF＋1.25 mL EGCG＋0.75 mLβ-CD＋ 2 mL PBS；MIX3：1 mL LF＋0.75 mLβ-CD＋1.25 mL EGCG＋0.8 mL HMP＋1.2 mL PBS；MIX4：1 mL LF＋ 1.25 mL EGCG＋0.75 mLβ-CD＋0.8 mL HMP＋1.2 mL PBS；MIX5：1 mL LF＋1.25 mL EGCG＋0.8 mL HMP＋ 0.75 mLβ-CD＋1.2 mL PBS。每次溶液渦旋（3000 r/min，2 min）混合后，均靜置30 min，以充分自組裝。

1.3.2 濁度測定

分別取20 mL MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5于測試管中進行濁度測定。測定溫度為25 ℃。

1.3.3 熒光光譜測定

分別將MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5稀釋10 倍后進行熒光光譜掃描。激發(fā)波長295 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm，掃描溫度25 ℃。

1.3.4 紅外光譜測定

將MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5于-18 ℃冷凍48 h，之后冷凍干燥。利用紅外光譜對凍干樣品進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.5 界面張力測定

使用吊片法分別測定MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5在大豆油中的界面張力[11]。先將20 mL大豆油加入樣品皿中，再將20 mL樣品溶液加入另一樣品皿中測量，最后把20 mL大豆油加入到20 mL樣品溶液中，以PBS作為空白，于25 ℃條件下測定。

1.3.6 接觸角測定

分別將冷凍干燥的MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5壓片，制成直徑13 mm、厚度2 mm的待測樣品。將20 mL大豆油加入樣品皿中，加適量蒸餾水于另一個新的樣品皿中，然后將待測樣品浸入大豆油中，在樣品表面滴2 μL蒸餾水，平衡10 s，記錄并讀取接觸角值。

1.3.7 SEM觀察

將MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5于-18 ℃冷凍48 h，之后冷凍干燥。利用SEM對凍干樣品進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.8 HIPPEs制備

分別以MIX1、MIX2、MIX3、MIX4和MIX5為液相，大豆油為油相，按油相80%、液相20%比例倒入高腳剪切杯中，使用IKA-T25數(shù)顯型高速剪切儀以8000 r/min進行剪切，剪切時間為2 min。制得的HIPPEs分別記為HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5。

1.3.9 CLSM觀察

參考Yusoff等[11]的方法并稍作修改。稱取0.01 g異硫氰酸熒光素和尼羅紅分別溶于異丙醇和無水乙醇，制備0.01%異硫氰酸熒光素染色液和0.01%尼羅紅染色液，分別對LF和大豆油進行染色。之后按照1.3.8節(jié)中的方法制備乳液。將乳液置于凹面載玻片上，用蓋玻片覆蓋，并在蓋玻片周圍涂上甘油密封。分別在514、488 nm波長下激發(fā)異硫氰酸熒光素和尼羅紅熒光，記錄乳液微觀形貌。

1.3.10 粒徑和粒徑分布測定

分別取適量HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于激光粒度分布儀的攪拌裝置中，與蒸餾水充分混合，在透光率15%時，進行粒徑及其分布測定。

1.3.11 光學(xué)微流變測定

將HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5分別裝入平底圓柱玻璃管（高度70 mm，外徑27.5 mm），靜置4 h 后進行微流變分析。記錄乳液的彈性因子（elasticity index，EI）、宏觀黏度因子（macroscopic viscosity index，MVI）和固液平衡值（solid-liquid balance，SLB）。

1.3.12 質(zhì)構(gòu)特性測定

分別取5 mL HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5置于小燒杯中進行質(zhì)構(gòu)分析，測定其硬度、黏性、內(nèi)聚力、膠著性和咀嚼性。探頭為P0.5，模式為TPA，測試前后速率均為2 mm/s，測試速率為1 mm/s，壓縮距離為4 mm。

1.3.13 3D打印特性測定

選擇直徑30 mm，高15 mm圓柱體作為3D打印模型，采用1.2 mm口徑針頭進行3D打印。3D打印參數(shù)設(shè)置如下：移動速率30 mm/s，回縮速率40 mm/s，填充速率20 mm/s，填充密度80%，溫度25 ℃。樣品成型后使用游標卡尺測量圓柱體底部直徑。

1.3.14 抗氧化能力測定

1.3.14.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除能力測定

參考朱穎等[12]的方法，并稍作修改。稱取3.94 mg DPPH，加入適量無水乙醇溶解，避光超聲10 min后，用無水乙醇定容至100 mL，得到100 μmol/L的DPPH自由基溶液，避光保存?zhèn)溆?。分別將HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5用蒸餾水稀釋10 倍，渦旋2 min。對照組為2 mL 100 μmol/L DPPH自由基溶液＋2 mL無水乙醇，空白組為2 mL待測樣品＋2 mL無水乙醇，實驗組為2 mL待測樣品＋2 mL 100 μmol/L DPPH自由基溶液。各組室溫避光反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測定吸光度。按式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：A為實驗組吸光度；A0為空白組吸光度；A1為對照組吸光度。

1.3.14.2 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定

參考朱穎等[12]的方法，并稍作修改。稱取ABTS 0.0960 g、過硫酸鉀0.0331 g溶于50 mL蒸餾水中，避光靜置12 h，作為ABTS陽離子自由基母液。使用無水乙醇稀釋母液至其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，用作ABTS陽離子自由基待測液。分別將HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5用蒸餾水稀釋10 倍作為待測樣品。空白組為3.6 mL ABTS陽離子自由基溶液＋0.4 mL無水乙醇，實驗組為3.6 mL ABTS陽離子自由基溶液＋0.4 mL待測樣品。各組室溫避光反應(yīng)5 min，于734 nm波長處測定吸光度。按式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率：

式中：A為空白組吸光度；A0為實驗組吸光度。

1.3.15 乳液穩(wěn)定性測定

乳析指數(shù)：分別取5 mL HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于10 mL離心管中，8000 r/min 離心20 min，測定離心后析出層與乳液高度。按式（3）計算乳析指數(shù)：

貯藏穩(wěn)定性：分別取適量HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于玻璃瓶中，常溫放置1、3、5、7 d后觀察樣品表觀變化。

冷藏穩(wěn)定性：分別取適量HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5于玻璃瓶中，4 ℃冷藏1、3、5、7 d后，常溫放置20 min，觀察樣品表觀變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 三元及四元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性

由圖1A可知，MIX1的濁度高達2637 NTU。這與之前的研究類似，這是因為HMP帶負電荷，能夠與 LF-EGCG復(fù)合物通過靜電復(fù)合物形成高濁度凝聚體[13]。隨著β-CD添加，形成的四元復(fù)合物濁度進一步增加，表明復(fù)合物中分子間的聚集行為增強。當β-CD質(zhì)量濃度達到0.0015 g/mL后，進一步增加其質(zhì)量濃度，溶液濁度不再增加，表明此時β-CD對溶液體系的影響達到飽和。在0.0015 g/mLβ-CD條件下，MIX2的濁度僅為15 NTU，溶液清澈透明。這也與之前的研究類似，認為β-CD作為中性電荷，不能與LF通過靜電相互作用，但能夠通過其疏水空腔結(jié)合EGCG，競爭性干擾LF與EGCG的相互作 用[14]。另外，自組裝順序直接影響了加入β-CD后的四元復(fù)合物濁度，從高到低依次為MIX3＞MIX4＞MIX5。

圖1 三元及四元復(fù)合物的濁度（A）、熒光特性（B）、紅外 光譜（C）、油-水界面張力（D）、接觸角（E）和SEM圖像（F）Fig.1 Turbidity (A),fluorescence spectra (B),FTIR spectra (C),oilwater interfacial tension (D),contact angle (E) and SEM images (F) of the ternary and quaternary complexes

由圖1B可知，相較于MIX2，MIX1的熒光強度較強，表明研究所用濃度條件下，相比于β-CD，HMP對LF與EGCG相互作用的干擾能力更強，進而減弱EGCG對LF的熒光淬滅效應(yīng)。與MIX1相比，四元復(fù)合物的熒光強度增強，表明β-CD的添加進一步減弱了EGCG對LF的熒光猝滅效應(yīng)。這可歸因于β-CD所具有的空腔結(jié)構(gòu)，能夠通過氫鍵包埋EGCG。

在蛋白質(zhì)紅外光譜中，位于3400 cm-1附近的酰胺A帶與N—H伸縮振動有關(guān)，當其與氫鍵締合時，將向低波數(shù)位移[15]。由圖1C可知，MIX1和MIX2的酰胺A帶分別位于3365.1 cm-1和3355.9 cm-1處，而在MIX3、MIX4和MIX5中分別紅移至3332.1、3305.9 cm-1和3307.7 cm-1。蛋白質(zhì)的酰胺I帶位于1600～1700 cm-1之間，歸因于多肽骨架的C＝O伸縮振動，其變化也與氫鍵的形成密切相關(guān)[16]。與MIX1和MIX2相比，MIX3、MIX4和MIX5中的酰胺I帶出現(xiàn)明顯藍移。顯然，氫鍵參與了四元復(fù)合物的形成。另外，在1057～1077 cm-1區(qū)域峰的位移進一步表明四元復(fù)合物中各物質(zhì)之間發(fā)生了相互作用。

界面張力的降低有利于乳化穩(wěn)定[17]。由圖1D可知，與三元復(fù)合物相比，四元復(fù)合物的界面張力降低約3 mN/m，表明添加β-CD后，復(fù)合物更易于吸附在乳滴表面，表現(xiàn)出更強的乳化穩(wěn)定性。MIX3界面張力最低，說明其乳化穩(wěn)定性最強。在四元復(fù)合物中，LF、EGCG和β-CD均具有穩(wěn)定HIPPEs的能力，因此，它們之間的相互作用可能是四元復(fù)合物乳化穩(wěn)定性提高的原因。

接觸角是衡量顆粒潤濕性的重要指標。通常，接觸角小于90°時，表明顆粒具有較強的潤濕水能力，形成的Pickering乳液多為O/W型；反之，接觸角大于90°時，表明顆粒具有較強的潤濕油能力強，形成的乳液多為W/O型。另外，接觸角越接近90°時，形成的乳液越穩(wěn)定[18]。由圖1E可知，三元復(fù)合物和四元復(fù)合物的接觸角之間差異明顯，從高到低為：MIX3（89.9±0.2）°＞ MIX4（85.8±0.2）°＞MIX5（79.5±0.2）°＞MIX2（76.2±0.2）°＞MIX1（74.6±0.1）°，這表明相比于三元復(fù)合物，四元復(fù)合物更易穩(wěn)定HIPPEs。特別是MIX3，其接觸角接近90°，顯著高于MIX1和MIX2，這直接說明了自組裝順序的重要意義。即自組裝順序通過靈活調(diào)控四元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和顆粒潤濕性，顯著影響著它們穩(wěn)定HIPPEs的能力。這與之前強調(diào)自組裝順序?qū)τ贚F-EGCG-低甲酯果膠三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)和乳化特性影響的研究結(jié)果[8]一致。

由圖1F可知，MIX1表現(xiàn)出典型的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這與其含有HMP密切相關(guān)。HMP能夠通過氫鍵、疏水相互作用和范德華力等非共價作用力與LF和EGCG分別或共同相互作用，進而形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。相比而言，MIX3、MIX4和MIX5的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)行為更加明顯，結(jié)構(gòu)更加致密。此外，MIX2的顆粒形貌幾乎無網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是因為β-CD并不具備HMP的結(jié)構(gòu)特點，其所形成的 “—(LF-EGCG-β-CD)n—”結(jié)構(gòu)不具備相互交聯(lián)特性。

綜上，β-CD的添加顯著影響了LF-EGCG-HMP三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，所形成的四元復(fù)合物可能會不同程度地影響HIPPEs的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。

2.2 CLSM分析

如圖2所示，三元復(fù)合物和四元復(fù)合物用異硫氰酸熒光素染色，呈綠色；大豆油用尼羅紅染色，呈紅色。三元復(fù)合物和四元復(fù)合物（綠色）均吸附在乳液界面，并緊密包裹著乳滴（紅色）。顯然，這些乳液均為O/W體系。同時，連續(xù)相呈綠色，說明存在大量游離的（未吸附的）三元復(fù)合物和四元復(fù)合物。它們能夠通過空間位阻作用抑制乳滴的聚結(jié)，有利于HIPPEs的穩(wěn)定。另外，乳滴均呈非球形，表明這些乳液由Pickering穩(wěn)定機制穩(wěn)定，乳滴間存在強烈的擠壓形變行為。

圖2 三元及四元復(fù)合物的粒徑分布及CLSM圖Fig.2 Particle size distribution and CLSM images of the ternary and quaternary complexes

由表1可知，在這些HIPPEs中，乳滴的粒徑大小和均一度存在一定差異。HIPPE1的D50、D4,3、D3,2分別為（23.24±0.17）、（26.24±0.12）、（9.18±0.13）μm，HIPPE 2 的D50、D4,3、D3,2分別為（26.99±0.61）、（38.87±0.30）、（12.32±0.61）μm，均一性較差。相比而言，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5中的D50、D4,3、D3,2分別在17～20、19～24、7～10 μm范圍內(nèi)，乳滴粒徑明顯減小，分布趨于均一。基于四元復(fù)合物的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及優(yōu)異的顆粒潤濕性（接觸角更接近90°），推測四元復(fù)合物通過兩方面提高HIPPEs穩(wěn)定性：1）更緊密吸附于油水界面；2）在連續(xù)相中形成高黏度網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過強大的空間位阻作用和高黏度有效抑制乳滴之間的聚集。

表1 三元及四元復(fù)合物的粒徑Table 1 Particle sizes of the ternary and quaternary complexes

2.3 光學(xué)微流變分析

相比于機械流變，以多散斑擴散波光譜學(xué)為理論基礎(chǔ)的光學(xué)微流變可以在無干擾條件下準確反映軟物質(zhì)體系（如懸浮液、乳液、水凝膠和泡沫等）的流變性質(zhì)，目前已成為一種重要的流變學(xué)研究手段[19]。

EI值表征乳液的彈性，其大小與體系中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強度密切相關(guān)。EI值越大，乳液中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，體系越穩(wěn)定；反之，乳液中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越松散，體系越不穩(wěn)定，易發(fā)生形變[20]。由圖3可知，與HIPPE1和HIPPE2相比，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的EI增大，特別是HIPPE3，EI值達（4.4±0.1）×10-3nm-2，是HIPPE1和HIPPE2的1.64 倍和1.88 倍。這表明HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的連續(xù)相中形成了更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可歸因于MIX3、MIX4和MIX5致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

MVI值表征乳液的黏性，值越大表示體系中液滴的運動阻力越強，體系越穩(wěn)定[21]。由圖3可知，與HIPPE1、HIPPE2相比，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5具有更高的MVI值。這說明在HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5中，乳液液滴的運動速度變慢，乳液變得更加穩(wěn)定。顯然，β-CD的添加增強了乳液連續(xù)相中三元復(fù)合物的黏度。

SLB值表征乳液的固液特征。通常，0＜SLB＜0.5時，體系傾向于固體行為；0.5＜SLB＜1.0時，體系傾向于液體行為；SLB＝0.5時，體系達到固液平衡[22]。由圖3可知，HIPPE1的SLB值為0.50±0.001，說明HIPPE1 為固液平衡體系，HIPPE2 的SLB 值為0.57±0.0025，大于0.5，說明HIPPE2體系更傾向于液體。相比而言，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的SLB值減小，分別為0.45±0.001、0.46±0.001和0.47±0.001，說明β-CD的加入使HIPPE1由固液平衡體系向類固體體系轉(zhuǎn)變。乳液的類固體行為較液體行為和固液平衡更有利于防止乳液體系的聚結(jié)和奧氏熟化[23]。

2.4 質(zhì)構(gòu)特性和3D打印特性

由表2可知，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5在硬度、黏性、內(nèi)聚力、膠著性、咀嚼性指標上均優(yōu)于HIPPE1和HIPPE2，這可歸因于HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和高黏性[24]。

表2 三元及四元復(fù)合物的質(zhì)構(gòu)特性Table 2 Texture characteristics of the ternary and quaternary complexes

3D打印技術(shù)因其快速成型、個性化定制等優(yōu)點，特別適合用于食品新結(jié)構(gòu)的開發(fā)和應(yīng)用[25]。圖4A為HIPPE1、HIPPE2、HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的3D打印成型效果圖。通過對3D打印乳液底部直徑的測定，可間接反應(yīng)乳液的3D打印穩(wěn)定性。初始3D打印HIPPEs為直徑30 mm、高15 mm的圓柱體。但放置12 h后，HIPPE1和HIPPE2出現(xiàn)較為嚴重的坍塌，由圖4B可知，乳液底部直徑分別達到40.1 mm和41.0 mm。相比而言，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5底部直徑介于35.3～38.8 mm之間。這說明四元復(fù)合物基HIPPEs的支撐性能更強，表現(xiàn)出更加優(yōu)異的3D打印特性，特別適合作為食品3D打印材料。顯然，這應(yīng)歸因于HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的優(yōu)異黏彈性和質(zhì)構(gòu)特性。

圖4 三元及四元復(fù)合物的表觀形貌（A）和3D打印直徑（B）Fig.4 Visual appearance (A) and 3D printed diameters (B) of the ternary and quaternary complexes

2.5 抗氧化能力分析

之前報道發(fā)現(xiàn)，與單一多酚和蛋白質(zhì)-多酚二元復(fù)合物相比，一些蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物的抗氧化性較低，這種現(xiàn)象被歸因于復(fù)合物中多糖對多酚“束縛”[26-27]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，與三元復(fù)合物基乳液相比，四元復(fù)合物基乳液的抗氧化性增強。由圖5可知，HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的DPPH自由基清除能力分別為82.3%、76.6%和73.3%，高于HIPPE1（41.5%）和HIPPE2（45.7%）；ABTS陽離子自由基清除能力分別為54.2%、51.2%和48.5%，高于HIPPE1（40.3%）和HIPPE2（42.3%）。由于EGCG是發(fā)揮抗氧化性的主要因素，因此推測四元復(fù)合物基HIPPEs抗氧化性提高的原因是：β-CD通過氫鍵作用與EGCG結(jié)合，競爭性降低HMP對EGCG的“束縛”，通過形成相對松散的“—(β-CDEGCG-HMP)n—”結(jié)構(gòu)，增加EGCG的水溶性，進而提高整個乳液體系的抗氧化能力。不過，該推測仍需進一步研究加以驗證。

圖5 三元及四元復(fù)合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力Fig.5 DPPH and ABTS cation radical scavenging activities of the ternary and quaternary complexes

2.6 乳液穩(wěn)定性分析

乳析指數(shù)可以用于評價乳液的物理穩(wěn)定性，其值越高，乳液物理穩(wěn)定性越差，反之則越強[28]。由圖6A可知，HIPPE2在離心后表現(xiàn)出明顯的破乳現(xiàn)象（大量油析出），說明LF-EGCG-β-CD三元復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性較差。HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5的乳析指數(shù)低于HIPPE2，說明它們的離心穩(wěn)定性增強。HIPPE3的乳析指數(shù)最小，這可歸因于HIPPE3較小的粒徑、較致密的結(jié)構(gòu)和較高的黏彈性。

圖6 三元及四元復(fù)合物的乳析指數(shù)（A）、常溫穩(wěn)定性（B）和 冷藏穩(wěn)定性（C）Fig.6 Creaming index (A),room temperature stability (B) and refrigeration stability (C) of the ternary and quaternary complexes

由圖6B、C可知，5 種乳液均表現(xiàn)出良好的常溫穩(wěn)定性，但其冷藏穩(wěn)定性卻不相同：HIPPE1、HIPPE2出現(xiàn)了可見的析油現(xiàn)象，而在HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5中并未發(fā)生。這說明HIPPE3、HIPPE4和HIPPE5具有良好的冷藏穩(wěn)定性，適合在冷藏食品體系應(yīng)用。

2.7 四元復(fù)合物及其HIPPEs可能的形成機制

如圖7所示，在MIX3中，首先形成LF-β-CD二元混合物（LF與β-CD相互作用力弱）；添加EGCG后，形成濁度較低的LF-β-CD-EGCG三元復(fù)合物；之后，借助于與LF和EGCG的相互作用，HMP將LF-β-CD-EGCG三元復(fù)合物吸附于表面，促進了各成分之間的交聯(lián)，形成了結(jié)構(gòu)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。MIX4的結(jié)構(gòu)形成過程與MIX3類似，區(qū)別在于大量LF-EGCG-β-CD三元復(fù)合物存在于該結(jié)構(gòu)內(nèi)部，部分“掩蓋”了復(fù)合物整體的乳化能力。MIX5的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對簡單，主要是由LF-EGCG-HMP三元復(fù)合物及圍繞在該復(fù)合物表面的β-CD組成?？傊?，β-CD的加入推動了復(fù)合物中各成分的重組裝，優(yōu)化了顆粒網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使其具備更加適宜的潤濕性。當MIX3、MIX4和MIX5作為連續(xù)相穩(wěn)定HIPPEs時，這些顆粒通過強界面吸附能力及高黏網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予HIPPEs優(yōu)異的黏彈特性和穩(wěn)定性。

圖7 四元復(fù)合物可能的形成（A）及其穩(wěn)定HIPPEs的 作用機制（B）示意圖Fig.7 Schematic diagrams of the possible mechanisms involved in the formation of the quaternary complexes (A) and the structures of HIPPEs (B)

3 結(jié)論

與三元復(fù)合物相比，由LF、EGCG、HMP和β-CD自組裝構(gòu)建的四元復(fù)合物具有較低的界面張力和更加適宜的潤濕性，表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定HIPPEs特性。四元復(fù)合物的致密交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)賦予HIPPEs更高的黏彈性、質(zhì)構(gòu)特性和3D打印特性。同時，β-CD能夠通過干擾EGCG與LF或HMP的結(jié)合，顯著提高HIPPEs的抗氧化特性。另外，自組裝順序靈活調(diào)控著四元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和乳化特性。本研究為蛋白質(zhì)-多酚-雙多糖四元復(fù)合物的構(gòu)建及其在HIPPEs中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。