轉錄組和代謝組分析瘤菌根菌對鐵皮石斛的促生機制

王偉英, 林江波, 鄒暉, 戴藝民

轉錄組和代謝組分析瘤菌根菌對鐵皮石斛的促生機制

王偉英, 林江波, 鄒暉, 戴藝民*

(福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005)

為篩選出促進鐵皮石斛()生長的差異表達基因和差異代謝物，對瘤菌根菌與無菌盆栽鐵皮石斛苗共生后形成的側根根系進行轉錄組、代謝組和雙組學聯(lián)合分析。結果表明，轉錄組分析共找到262條差異表達基因富集到了35條通路中，其中內質網(wǎng)蛋白質加工通路途徑的差異基因最多，其次為氨基糖和核苷酸糖代謝通路。代謝組分析共檢測出194個差異代謝物富集到33個KEGG通路中，其中代謝途徑的差異代謝物最多有133個，其次為不同環(huán)境的微生物代謝途徑的差異代謝物有70個。通過聯(lián)合分析，有9個差異基因的差異表達導致絲氨酸、谷氨酸、d-甘露糖和激素等代謝物的積累量發(fā)生變化，這可能是瘤菌根菌促進鐵皮石斛生長的重要原因。因此，推測瘤菌根菌促進鐵皮石斛生長與氨基酸、糖、植物激素的積累及相關基因的表達變化有關。

鐵皮石斛；內生真菌；轉錄組；代謝組

鐵皮石斛()為蘭科(Orchi- daceae)石斛屬多年生草本植物，位列“中華九大仙草”之首，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、抗腫瘤、抗氧化、增強人體免疫力和降低血糖等作用。由于鐵皮石斛自然分布較少，生長緩慢，繁殖率低以及過度采伐，其野生資源已遭嚴重破壞，被列為瀕危保護的中藥品種。隨著組織培養(yǎng)技術的發(fā)展和應用，現(xiàn)階段鐵皮石斛的組織培養(yǎng)技術已經(jīng)趨于成熟，鐵皮石斛的有機種植、林下種植以及仿野生種植已成為近年的熱點，但因產(chǎn)量過低制約著鐵皮石斛種植的發(fā)展，提高鐵皮石斛產(chǎn)量成為了亟待解決的問題。

蘭科菌根系統(tǒng)中存在多種內生真菌類型，主要屬擔子菌門、半知菌門和子囊菌門，其中擔子菌類真菌為優(yōu)勢菌群[1]。擔子菌膠膜菌科中的無性態(tài)屬瘤菌根菌屬(sp.)以及瘤菌根菌屬的有性態(tài)膠膜菌屬()是蘭科植物的主要共生真菌[2]。瘤菌根菌在鐵皮石斛的生長發(fā)育中起著促進生長的作用[3–4]。金輝等[5]通過雙重培養(yǎng)條件研究了鐵皮石斛組培苗在接種瘤菌根菌60 d后的變化, 發(fā)現(xiàn)接菌苗鮮重顯著增加, 體內B、Si、Fe、Cu、Mn等多種礦質元素含量顯著提高。

近年來，有關鐵皮石斛的分子遺傳學、基因組、轉錄組、蛋白質組與代謝組等已有研究[6–8]，Wu等[9]利用大規(guī)模代謝組學和轉錄技術，基于生理特征分析研究了低溫信號轉導、轉錄調控和基因表達，揭示了鐵皮石斛幼苗對低溫馴化的響應。但目前對瘤菌根菌與鐵皮石斛中的互作和促生機制還未有系統(tǒng)的研究。本研究在前期已開展了瘤菌根菌的分離純化、鑒定，發(fā)現(xiàn)瘤菌根菌與鐵皮石斛根系形成共生關系后對鐵皮石斛的生長具有促進效果，提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和營養(yǎng)成分的含量[10–11]。本研究將通過轉錄組和代謝組比較分析瘤菌根菌侵染后促生機制，進而為鐵皮石斛的分子育種、功能基因的挖掘和活性成分的生物合成提供依據(jù)，對鐵皮石斛種植具有重要的應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為冠豸山野生鐵皮石斛()，瘤菌根菌菌株(sp.)在福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所保存。

1.2 方法

石斛盆栽苗的準備 泥炭土高溫滅菌后裝入未使用過的花盆，將生根培養(yǎng)基中4 cm高的鐵皮石斛組培苗種在花盆中，每盆種3叢，每叢3株石斛苗。

菌液培育與接菌處理 配制液體PDA培養(yǎng)液，接入瘤菌根菌，放入180 r/min搖床，28 ℃震蕩培育7 d后用粉碎機攪碎大塊菌絲至均勻，用5 mL移液槍將菌液接種在石斛的根基部，每叢分3點各接5 mL，接80盆。接菌的為處理組(T)，未接菌的為對照組(CK)。每月接菌1次，總共接菌3次。當根系開始分叉時進行隨機取樣，設置3個生物學重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

轉錄組測序、數(shù)據(jù)的拼接、組裝和功能注釋由北京百邁克生物科技有限公司完成，測序平臺為Illumina HiSeq 4000。代謝組測定使用安捷倫1290超高效液，所使用的色譜柱為購自Waters的UPLC BEH Amide色譜柱(1.7m, 2.1 mm×100 mm)。采用DPS對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理及顯著性檢驗分析,顯著水平為0.05。

2 結果和分析

2.1 瘤菌根菌對鐵皮石斛新芽生長的影響

當無菌組培苗移載到花盆2個月后植株停止生長但會長出新芽，新芽長出新根。從圖1和表1可見，不管接菌與否，鐵皮石斛新芽的生長周期基本相同，新芽都在每年的3月長出，到12月植株封頂停止生長，即新芽的生長周期大約為10個月。鐵皮石斛在9至12月的生長速度較快，是最適生長期，接菌處理的表現(xiàn)更為顯著，莖增長了11.16 cm, 葉片數(shù)增加了11.39片，而未接菌的莖增長了9.39 cm,葉片數(shù)增加了10.1片。未接菌植株新芽在整個生育期生長比較緩慢，植株矮小，葉片數(shù)少，與接菌處理的莖長和葉片數(shù)差異顯著；9月后的差異更顯著。在生長期內接菌處理的新芽生長速度較未接菌快。植株的葉片數(shù)越多，莖干就越長，葉片數(shù)與莖長呈顯著正相關關系，相關系數(shù)為0.993。因此，推測接菌一方面誘導了根系分叉，加大根系面積，增強營養(yǎng)的吸收；另一方面誘導植株發(fā)生一系列代謝變化來調控生長。

圖1 鐵皮石斛新芽的生長。A, B, C分別為未接菌1、6、9個月; D, E, F分別為接菌1、6、9個月。標尺=2 cm。

表1 鐵皮石斛新芽的根莖葉變化

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)；CK: 未接菌; T: 接菌。

Data followed different letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level. CK: Uninoculation; T: Inoculation.

2.2 轉錄組分析

2.2.1 差異表達基因的GO富集分析

設定閾值VIP>1.0，F(xiàn)C>1.2或FC<0.833且< 0.05，未接菌與接菌處理的根系共篩選出262條差異基因，差異表達基因有177條，接菌處理中上調表達的有59條，下調表達的有118條。與常用數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得注釋的差異基因共有172條, 其中GO數(shù)據(jù)庫注釋了38個差異表達基因, 占總數(shù)的22.1%；而KEGG數(shù)據(jù)庫注釋了70個差異表達基因, 占40.7%。在GO數(shù)據(jù)庫中，植物基因劃分為3類，分別為生物學過程、細胞成分和分子功能。GO富集分析表明，38個DEGs分為20個功能組，其中生物學過程61條、細胞成分57條和分子功能40條。在分子功能分類中以催化活性和結合基因為主，占92.11%，其中催化活性占52.63%；參與細胞組分的DEGs在細胞和細胞組分占比最高，其次為細胞膜和細胞器；參與生物學過程的DEGs主要集中在代謝過程、細胞過程和單組織過程，以代謝過程占比最高(圖2)。

2.2.2 差異表達基因的KEGG通路注釋

在KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫中，植物的生物代謝通路劃分為5類，分別為細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和生物體系統(tǒng)。KEGG通路分析結果表明，35條DEGs注釋到35條KEGG通路(圖3)，其中12條上調表達的DEGs注釋到17條通路，23條下調表達的DEGs注釋到22條通路中，遺傳信息處理類中的內質網(wǎng)蛋白質加工通路的基因最多, 有199條，其中DEG有7條；其次是新陳代謝類中的氨基糖和核苷酸糖代謝通路，有124條基因，DEG有3條。

2.3 代謝組分析

設定閾值VIP>1.0，F(xiàn)C>1.2或FC<0.833且< 0.05，從未接菌與接菌處理的根系中共檢測出2 543個代謝物，篩選出194個差異代謝物(DMs)，其中104個在接菌根系中含量上調，90個含量下調，接菌處理顯著提高了鐵皮石斛根系的代謝物含量。

有59個差異代謝產(chǎn)物在KEGG數(shù)據(jù)庫中沒有注釋，對注釋的135個差異代謝物進行分類，主要包括糖類、氨基酸及其衍生物、有機酸及衍生物、核苷酸及衍生物、脂肪酸類、黃酮類、萜類、苯丙素類、生物堿、醇類、酯類以及植物激素類等(圖4)，其中氨基酸及其衍生物占20.0%，其次糖類(14.1%)，有機酸及有機酸鹽和苯丙素類分別占12.6%和8.9%。

圖2 差異表達基因的GO富集分析。1: 催化活性; 2: 轉運體活性; 3: 綁定; 4: 細胞外區(qū)域; 5: 細胞; 6: 膜; 7: 細胞連接; 8: 大分子復合物; 9: 細胞器; 10: 細胞器部分; 11: 膜部分; 12: 細胞部分; 13: 共質體; 14: 代謝過程; 15: 細胞過程; 16: 多細胞生物過程; 17: 發(fā)育過程; 18: 單一生物過程; 19: 應激反應; 20: 定位。

圖3 鐵皮石斛根系DEGs的KEGG分析

圖4 差異代謝物的數(shù)量。1: 糖; 2: 氨基酸及其衍生物類; 3: 有機酸及衍生物; 4: 脂肪酸類; 5: 核苷酸及衍生物; 6: 酮; 7: 苯丙素類; 8: 生物堿; 9: 萜類; 10: 醇類; 11: 酯類; 12: 植物激素類; 13: 胺; 14: 醌; 15: 酚; 16: 其他。

KEGG分析表明(圖5)，54個差異代謝物分布在5類生物代謝通路的33個途徑中，參與包括代謝途徑、微生物代謝、抗生素的生物合成、碳代謝、氨基酸的生物合成、玉米素生物合成及植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成等活動，與糖類、氨基酸等初生代謝產(chǎn)物積累或主要次生代謝物積累及植物激素的合成相關,其中參與代謝途徑的差異代謝物數(shù)量最多，有113個代謝物，其中9個差異顯著代謝物；其次是不同環(huán)境的微生物代謝，有63個代謝物，4個差異顯著代謝物。

圖5 注釋的差異代謝物通路分類圖

2.4 聯(lián)合分析

對不同處理的鐵皮石斛根系的差異基因和差異代謝物進行關聯(lián)分析，找到9條共同富集代謝通路(表2)，分別為氨基酸的生物合成、半乳糖代謝、類黃酮生物合成、碳代謝、ABC轉運體、果糖和甘露糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、磷酸戊糖途徑以及氨?；?tRNA的生物合成。這些通路中有9個DEGs和6個DMs, 9個DEGs分別為轉醛醇酶基因()、內切-1,4--甘露糖苷酶基因()、莽草酸-羥基肉桂?；D移酶基因()、幾丁質酶基因()、III類酸性內切幾丁質酶基因()、幾丁質酶Hevamine基因()、ATP結合盒蛋白亞家族B成員1轉運蛋白基因()、ATP結合盒蛋白亞家族B成員2轉運蛋白基因()和組氨酸t(yī)RNA合成酶基因(), 其中3個通路的DEG為, 且接菌處理比未接菌上調；2個通路的DEG為，接菌處理比未接菌顯著上調。

半乳糖代謝、ABC轉運體、果糖和甘露糖代謝及氨基糖和核苷酸糖代謝4個通路共有7個DEGs，其中半乳糖代謝通路有1個()，ABC轉運體有2個(，)，果糖和甘露糖代謝通路有1個()、氨基糖和核苷酸糖代謝通路有3個(、)。但這些通路中共同的DM為上調表達的d-甘露糖。在氨基酸的生物合成、碳代謝和氨酰基-tRNA的生物合成3個通路中只有2個DEGs (和)，1個共同的DM，為顯著上調表達的3-磷酸絲氨酸，log2FC為1.350 7。除共同的DM，氨基酸的生物合成通路中還有1個DM (-乙酰-l-谷氨酸)；碳代謝通路有2個DMs，分別是下調表達的二羥基丙酮和上調表達的2-脫氫-3-脫氧-d-葡萄糖酸鹽；而氨?；?tRNA的生物合成通路中只有1個DM, 即3-磷酸絲氨酸。在磷酸戊糖途徑通路的DEG為，DM為上調表達的2-脫氫-3-脫氧-d-葡萄糖酸鹽。而類黃酮生物合成通路的DEG是，DM為上調表達的新橙皮苷。

氨基酸的生物合成、氨酰基-tRNA的生物合成和碳代謝途徑的DEG和DM的差異均達到極顯著水平，推測瘤菌根菌與鐵皮石斛根系共生后誘導調控了和表達，從而改變了促進鐵皮石斛生長的主要代謝物氨基酸和糖含量。

3 結論和討論

內生真菌對宿主的系統(tǒng)演化、生長發(fā)育及提高抗逆性具有十分重要的作用，幾乎可以被當作植物的一個“組織器官”，是影響植物發(fā)育、生理、代謝的重要因素[12]。內生真菌侵染組織后，為了行使特定的生物學功能，互作雙方在形態(tài)、生理和分子水平均發(fā)生著深刻的變化，從而建立穩(wěn)定有效的共生體。

表2 瘤菌根菌促進鐵皮石斛生長的DEGs與DMs的聯(lián)合分析

內生真菌與寄主互作時會引起菌體和寄主的形態(tài)變化。一方面互作時內生真菌的菌絲形態(tài)發(fā)生變化，Chacón等[13]利用激光共聚焦技術觀察了GFP標記的哈茨木霉菌株侵染番茄()根系的菌絲形態(tài)變化，結果表明共培養(yǎng)2 d后菌絲頂端呈現(xiàn)酵母狀的乳突型細胞，推測這種特異性的形態(tài)變化有助于雙方營養(yǎng)的交換。另一方面互作時寄主植物發(fā)生農(nóng)藝性狀的變化，如叢枝菌根(AM)真菌可以促進紫穗槐()結瘤數(shù)量來提高固氮能力[14]。本課題組前期研究表明, 瘤菌根菌與鐵皮石斛根形成菌根并建立起共生關系后，原本只有1條主根的根系結構發(fā)生了變化, 主根上長出許多側根和根毛，側根上還會形成二級側根，增加了根尖數(shù)和根體積[4]。本研究表明瘤菌根菌會促使新芽分化，長出新根并分叉生成側根。在從發(fā)芽到封頂?shù)恼麄€生育期相對固定，接菌處理加快了新芽的生長速度，增加葉片數(shù)和莖干長度，進而提高了產(chǎn)量，這與前期[11]的研究結果一致。

內生真菌與寄主互作時還會引起寄主的基因表達和代謝物的變化。菌株侵染根系后能削弱根部細胞基因的表達，的過表達卻限制菌絲的侵染強度[15]。對叢枝菌根和外生菌根的研究表明，根系分泌物中的倍半萜類、黃酮類物質充當了信號分子，促進孢子萌發(fā)[16]。李娜[17]通過代謝組研究野生稻()內生真菌與擬南芥()的共生關系，結果表明宿主代謝途徑中的三羧酸途徑發(fā)生改變，致使淀粉積累減少。本研究轉錄組分析表明，瘤菌根菌和鐵皮石斛根系共生后，根系的糖分解代謝途徑中的磷酸戊糖途徑的轉醛醇酶基因的表達顯著上調，這為合成代謝提供了多種原料，即轉醛醇酶基因上調表達，加強了細胞碳代謝以及糖代謝的磷酸戊糖途徑，產(chǎn)生供生物合成所需的還原力NADPH、ATP和核酸合成所需的戊糖，以及磷酸戊糖的中間物4-磷酸赤蘚糖，也為合成更多的芳香族氨基酸及其衍生物提供了前體。Hasunuma等[18]認為對環(huán)境因素的響應表明其可能在植物體其他代謝途徑中起作用，并推測可能與初生和次生代謝中的碳通量調節(jié)有關。

氨酰-tRNA合成酶(aaRS)是生物體內蛋白質合成途徑中的一類關鍵酶，能夠精確地識別tRNA使其氨酰化，在蛋白合成過程中，不同的氨基酸需要特定的aaRS轉運[19–20]。Glu被谷氨酰-tRNA合成酶催化產(chǎn)生的l-谷氨酰-tRNA普遍被認為是葉綠素合成的起點[21]。aaRS在蛋白質的生物合成中起重要作用，為蛋白質合成提供原料，從而將遺傳信息翻譯成蛋白質行使細胞的生物功能，它們一旦被抑制，整個細胞生長都將被抑制[22]。本研究表明，磷酸絲氨酰tRNA合成酶基因的表達上調，提高了氨酰tRNA合成酶的活性，生成更多具有生物功能的蛋白質，促進細胞生長。

d-甘露糖是葡萄糖的C-2差向異構體，天然存在于許多植物中，d-甘露糖在醫(yī)學上具有重要的應用[23–25]。多糖水解物主要含甘露糖、葡萄糖及微量的阿拉伯糖和木糖，其中水溶性多糖的單糖組成以d-甘露糖和d-葡萄糖為主，d-甘露糖以游離狀態(tài)存在于果皮中，如柑橘()、桃()和蘋果()等[26]。鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，含量高達29%以上[27],其中d-甘露糖、葡萄糖、半乳糖以140:35:1的較恒定比例關系存在于鐵皮石斛多糖中[28]。-1,4-甘露聚糖內切酶是一種多糖降解酶，能夠水解-1,4-d-甘露糖苷鍵連接的甘露聚糖生成甘露糖[29]。本研究表明，在瘤菌根菌共生后半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝通路中的-1,4-甘露聚糖內切酶基因表達量顯著增加，因此增強了對甘露聚糖的水解而生成更多的甘露寡糖，甘露寡糖在-1,4-甘露糖苷酶的作用下生成甘露糖，因而d-甘露糖含量高。

綜上，瘤菌根菌與鐵皮石斛根系共生后新芽能更快速生長，增加葉片數(shù)和莖干長，轉錄組和代謝組聯(lián)合分析表明接菌后轉醛醇酶基因、氨酰tRNA合成酶基因、ATP結合框轉運蛋白基因、內切-1,4--甘露聚糖酶和幾丁質酶基因均顯著上調表達，其代謝產(chǎn)物氨基酸、糖類、有機酸鹽、類黃酮、生長素以及其他生物活性物質含量也顯著增加。因此，這些關鍵差異基因的上調表達和代謝物的增加可能是瘤菌根菌促進鐵皮石斛生長和提升品質的重要原因，這為進一步對這些關鍵基因進行功能研究奠定了基礎。

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Transcriptome Sequencing and Metabolite Analysis for Revealing the Growth Promoting Mechanism ofsp.of

WANG Weiying, LIN Jiangbo, ZOU Hui, DAI Yimin*

(Subtropical Agriculture Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian, China)

To screen the differentially expressed genes (DEGs) and differential metabolites (DMs)that promote the growth of, transcriptomic, metabolomic and biomic analysis were performed on the lateral roots formed after the symbiosis of tumorrhizal bacteria and sterile pottedseedlings. The result showed that a total of 262 DEGs were found and enriched into 35 pathways by transcriptome analysis, among which endoplasmic reticulum protein processing pathway had the most DEGs, followed by amino sugar and nucleotide sugar metabolism pathways. A total of 194 DMs were detected enriched in 33 KEGG pathways by metabolomic analysis, among which 133 DMs were in metabolic pathways, followed by 70 DMs in microbial metabolic pathways of different environments. Combined analysis showed that the differential expression of 9 DEGs resulted in changes in the accumulation of metabolites, such as serine, glutamate, d-mannose and hormones, which might be an important reason forsp. to promote the growth of. Therefore, it was suggested that the growth ofpromoted bysp. was related to the accumulation of amino acids, sugars, phytohormones and the expression changes of related genes.

;sp.; Transcriptome; Metabolite

10.11926/jtsb.4643

2022-03-28

2022-06-22

福建省自然科學基金項目(2020J011368)資助

This work was supported by the Project for Natural Science in Fujian (Grant No. 2020J011368).

王偉英(1980年生)，女，博士研究生，副研究員，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術研究。E-mail: weiyingwang178@126.com

通訊作者 Corresponding author.E-mail: dymtcn@163.com