濕地松木質(zhì)部和針葉松脂合成基因分析

張文娟, 谷振軍, 胡珊, 張志紅, 李火根, 楊春霞*

濕地松木質(zhì)部和針葉松脂合成基因分析

張文娟1, 谷振軍2, 胡珊2, 張志紅3, 李火根1, 楊春霞2*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)，林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心，南京 210037；2. 江西省林業(yè)科學(xué)院林木遺傳育種與栽培研究所，南昌 330032；3. 峽江縣林木良種場(chǎng)，江西 吉安 331409)

為挖掘濕地松()松脂合成相關(guān)的基因，對(duì)不同采脂期的木質(zhì)部和針葉進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與火炬松()參考基因組進(jìn)行比對(duì)，共獲得了68 211條unigenes，546 356 450條clean reads，平均比對(duì)率達(dá)90.21%。將不同時(shí)期木質(zhì)部、木質(zhì)部與針葉間進(jìn)行兩兩對(duì)比，以<0.05，|log2FoldChange|>1.0為標(biāo)準(zhǔn)來篩選差異基因，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果表明，參與萜類物質(zhì)合成的差異基因有133個(gè)，其中大部分富集在MEP途徑，從差異基因中挑選8個(gè)產(chǎn)脂相關(guān)的候選基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，確定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與產(chǎn)脂存在關(guān)聯(lián)性。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析，挖掘出133個(gè)參與松脂萜類物質(zhì)合成相關(guān)的差異基因，其中萜烯合酶基因()和轉(zhuǎn)運(yùn)基因在正調(diào)控萜類物質(zhì)合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

濕地松；松脂；轉(zhuǎn)錄組；產(chǎn)脂候選基因

濕地松()屬于常綠喬木，自上世紀(jì)三十年代從美國(guó)引進(jìn)國(guó)內(nèi)[1]，因其生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)脂力高、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，很快成為我國(guó)南方地區(qū)重要的造林樹種[2]。近年來，濕地松因其松脂產(chǎn)量高、雜質(zhì)少、松節(jié)油含量高等優(yōu)勢(shì)，脂用價(jià)值日益凸顯，加上松材線蟲病危害致使馬尾松()栽培面積不斷縮減，在某些地區(qū)濕地松已逐漸取代馬尾松成為主要采脂樹種[3–4]。

松脂不僅能為生產(chǎn)林化產(chǎn)品提供可再生的原料，也是松樹抵御昆蟲以及食草動(dòng)物攻擊的重要手段[5]。松脂是萜烯類混合物，以異戊二烯亞基(C5)為基本單位，主要通過2種不同的途徑：甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)和甲基赤蘚糖磷酸(methyl- erythritol phosphate, MEP)途徑合成。目前在馬尾松中利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[6]、在油松()中利用基因組測(cè)序[7]初步解析了松脂生物合成調(diào)控機(jī)制, 并發(fā)現(xiàn)了一些可能參與調(diào)控松脂合成的關(guān)鍵基因，如萜烯合酶、細(xì)胞色素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和香葉基二磷酸合酶等。然而，相對(duì)于其他產(chǎn)脂樹種，濕地松松脂合成相關(guān)的調(diào)控機(jī)制方面研究較少。

江西省濕地松的采脂期通常為5月—10月，松脂產(chǎn)量在7、8月達(dá)到峰值，到10月底采脂活動(dòng)基本結(jié)束。本研究選取濕地松第一代種子園中同一無性系Ⅱ-142在不同采脂期4、8、10月的木質(zhì)部和針葉作為樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與火炬松()基因組進(jìn)行比對(duì)，以了解濕地松松脂合成相關(guān)基因隨季節(jié)性變化的表達(dá)差異，并通過對(duì)比產(chǎn)脂高峰期(8月)與產(chǎn)脂量低谷時(shí)期(4、10月)、高產(chǎn)脂無性系與低產(chǎn)脂無性系的基因表達(dá)差異，篩選出松脂合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，以期為后續(xù)的高產(chǎn)脂育種工作提供科學(xué)的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇江西省峽江縣林木良種場(chǎng)濕地松第一代種子園(115°24′ E, 27°33′ N)中無性系Ⅱ-142為試驗(yàn)材料，分別在4月(采脂前期)、8月(采脂高峰期)和10月(采脂結(jié)束期)采集無性系1.3 m胸徑處樹干的木質(zhì)部組織和針葉，4、8、10月的木質(zhì)部樣本編號(hào)為SAPB、SAUB、SOCB，針葉為混樣，編號(hào)為SPN，每組樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采集同一種子園中的高產(chǎn)脂無性系2-0420(產(chǎn)量約20 kg/ind.)和低產(chǎn)脂無性系2-113 (產(chǎn)量約5 kg/ind.)的木質(zhì)部和針葉進(jìn)行RT- qPCR (real-time reverse-transcription polymerase chain reaction)驗(yàn)證，所有樣品采集后放入液氮速凍，保存在-80 ℃超低溫冰箱中隨時(shí)取用。

1.2 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

CTAB法提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop及Agilent 2100分析儀檢測(cè)總RNA的濃度、純度以及完整性。構(gòu)建cDNA文庫(kù)，首先利用Oligo(dT)磁珠對(duì)mRNA進(jìn)行富集，然后用陽離子隨機(jī)打斷mRNA，并以得到的片段為模板獲得cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建后使用Agilent 2100 bioanalyzer和RT-qPCR對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后采用IlluminaHiSep4000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控、基因比對(duì)及組裝

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)首先要進(jìn)行過濾，除掉質(zhì)量低的、帶接頭的以及堿基信息不明確的reads，從而獲得高質(zhì)量的clean reads。其次，對(duì)clean data進(jìn)行Q20、Q30和GC含量的計(jì)算。最后使用HISAT2軟件將質(zhì)控后的clean reads與火炬松基因組進(jìn)行比對(duì)，并用StringTie軟件進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本組裝。

1.4 差異基因篩選及富集分析

差異基因表達(dá)分析通過DESeq2軟件(1.20.0)進(jìn)行，并使用Hochberg和Benjamini的方法來對(duì)值進(jìn)行調(diào)整，以<0.05，|log2FoldChange|>1.0為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，通過clusterProfiler (3.4.4)軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并修正了基因長(zhǎng)度偏差。

1.5 產(chǎn)脂相關(guān)基因表達(dá)驗(yàn)證

挑選8個(gè)與產(chǎn)脂相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，驗(yàn)證其在無性系Ⅱ-142的4、6、8、10月的木質(zhì)部和針葉中的表達(dá)量以及在高、低產(chǎn)脂的無性系中的表達(dá)量差異。利用PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa, 大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并通過Primer-BLAST在線平臺(tái)設(shè)計(jì)引物(表1)，內(nèi)參基因?yàn)椤Ｓ肅FX實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad, 上海)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。使用2–??CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及組裝

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到546 356 450條clean reads, 總堿基為81.94G。每個(gè)樣本的Q20值均超過98%，Q30值平均為94.77%，GC含量為44～46.5，且與火炬松基因組的平均比對(duì)率達(dá)到90.21% (表2)。不同樣本間的相關(guān)性系數(shù)為0.829～0.961，說明樣本間的表達(dá)模式比較接近。這表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分析。并利用StringTie軟件共獲得了16 460條新的unigenes，加上比對(duì)上火炬松轉(zhuǎn)錄組的51 751條unigenes，共獲得68 211條unigenes。

表1 熒光定量PCR引物

表2 樣品測(cè)序的質(zhì)量評(píng)估

2.2 差異基因表達(dá)分析

以<0.05，|log2FoldChange|>1.0為基因差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從圖1可見，不同采脂時(shí)期木質(zhì)部中差異表達(dá)基因數(shù)量不一，其中以8月與10月樣品間(SAUB vs SOCB)的差異基因最多，為6 023 個(gè)unigenes，8月與4月間(SAUB vs SAPB)的差異基因最少，為3 221個(gè)unigenes，3個(gè)對(duì)比組合(圖2)共有的差異基因僅為366個(gè)unigenes，少于它們各自獨(dú)有的差異基因。

相對(duì)于不同采脂時(shí)期，不同組織間獲得的差異基因數(shù)量較多(圖1)，其中以8月份木質(zhì)部與針葉間(SAUB vs SPN)的差異基因最多，為12 908個(gè)unigenes,包括5 287個(gè)上調(diào)基因和7 621個(gè)下調(diào)基因，3個(gè)不同比對(duì)組合(SAPB vs SPN、SAUB vs SPN、SOCB vs SPN)中，共有的差異基因?yàn)? 919個(gè)，4、8、10月各自獨(dú)有的差異基因分別為1 800、2 333和2 255個(gè)(圖2)。

2.3 差異基因的GO富集分析

對(duì)所有樣本間的差異基因進(jìn)行GO富集分析(圖3), 結(jié)果表明木質(zhì)部與針葉間(SAPB vs SPN、SAUB vs SPN、SOCB vs SPN)差異最顯著的條目均為光合作用，而SOCB vs SPN組合用于蛋白質(zhì)翻譯的tRNA氨基?；?tRNA aminoacylation for protein translation)、tRNA氨基?；?tRNA aminoacylation) 等分類差異也比較顯著；不同采脂時(shí)期的木質(zhì)部間(SAUB vs SAPB、SAUB vs SOCB、SOCB vs SAPB)的差異基因GO富集分析表明，SAUB vs SOCB、SOCB vs SAPB間的差異基因富集的條目基本一致,但SAUB vs SOCB差異最顯著的條目為有機(jī)物分解代謝過程，SOCB vs SAPB差異最顯著的條目為對(duì)生物脅迫的反應(yīng)。對(duì)于SAUB vs SAPB組合，差異基因主要富集在對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)和對(duì)水分的反應(yīng)這2條類目中。

圖1 不同采脂時(shí)期濕地松不同器官的差異基因數(shù)。SAPB: 4月木質(zhì)部; SAUB: 8月木質(zhì)部; SOCB: 10月木質(zhì)部; SPN: 針葉。下同

圖2 差異基因韋恩圖

2.4 松脂合成相關(guān)的通路分析

將不同樣本間的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析(圖4)，結(jié)果表明木質(zhì)部與針葉間差異基因富集的通路差別不大，差異最顯著的通路為卟啉與葉綠素代謝、光合作用、玉米素生物合成等。不同采脂時(shí)期的木質(zhì)部間差異基因的KEGG富集表明，SAUB vs SAPB、SAUB vs SOCB差異最顯著的通路都為類黃酮生物合成，而SOCB vs SAPB差異最顯著的富集通路為苯丙烷生物合成。與松脂合成相關(guān)的萜類通路方面，SAPB vs SPN、SOCB vs SPN、SOCB vs SAPB間均有差異基因富集在二萜生物合成通路,而SAPB vs SPN在萜類骨架合成、單帖生物合成等通路的差異也很顯著。

為深入了解濕地松松脂在基因和酶水平上的代謝，基于KEGG富集結(jié)果對(duì)萜類合成相關(guān)通路進(jìn)行了分析，并對(duì)其在不同階段不同組織中表達(dá)譜繪制了熱圖，以說明參與松脂生物合成和積累的候選基因的表達(dá)譜。分析表明萜類合成相關(guān)的差異基因共有133個(gè)(圖5)，參與MEP途徑的差異基因有93個(gè)，其中3個(gè)基因；參與MVA途徑的差異基因僅有12個(gè)，其中有6個(gè)為基因。在通路中共發(fā)現(xiàn)68個(gè)基因，其中有42個(gè)二萜合酶、25個(gè)單萜合酶、1個(gè)倍半萜合酶；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因有27個(gè)，其中13個(gè)在8月表達(dá)量最高。

圖3 差異基因的GO富集分析

圖4 差異基因的KEGG富集分析

圖5 濕地松萜烯生物合成途徑。AACT: 乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶; HMGS: 羥甲基戊二酰輔酶A合成酶; HMGR: 羥基甲基戊二酰輔酶A還原酶; MVK: 甲羥戊酸激酶; PMVK: 磷酸甲戊酸激酶; MVD: 二磷酸戊二酸脫羧酶; DXS: 1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶; DXR: 1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸還原酶; MCT: 2-C-甲基-d-赤蘚糖醇4-磷酸胞苷基轉(zhuǎn)移酶; CMK: 4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-d-赤蘚糖醇激酶; MECPS: 2-C-甲基-d-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶; HDS: 2-C-甲基-d-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶; HDR: 2-甲基-d-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸還原酶; IPPI: 異戊烯基二磷酸δ異構(gòu)酶; GPPS: 香葉基二磷酸合酶; FPPS: 法呢基焦磷酸合酶; GGPPS: 香葉基香葉基二磷酸合酶; STPS: 倍半萜合酶; MTPS: 單萜合酶; DTPS: 二萜合酶; CYP450: 細(xì)胞色素P450。

2.5 產(chǎn)脂相關(guān)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

從差異基因(圖5)中選擇萜類合成通路上游的基因和下游的基因，以及具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明(圖6, 7)，(PITA_13112)基因在10月的表達(dá)量最高，在高產(chǎn)脂無性系中的表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)脂無性系；(PITA_15631)基因在針葉中表達(dá)量顯著高于木質(zhì)部，而在不同月份的木質(zhì)部之間差異不大，在高產(chǎn)脂無性系中的表達(dá)量高于低產(chǎn)脂無性系, 但差異并不顯著；3個(gè)基因(PITA_ 39473、PITA_ 38904和PITA_28724)在8月的表達(dá)量顯著高于其他月份和針葉的，高產(chǎn)脂無性系表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)脂無性系，其中(PITA_39473)基因在高、低產(chǎn)脂無性系中的差異極顯著(<0.001); 除了(PITA_ 13961)基因在10月的表達(dá)量高于8月，其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PITA_33107、PITA_05351)都在8月的表達(dá)量最高，整體上在高產(chǎn)脂的無性系中的表達(dá)量高于低產(chǎn)脂無性系。實(shí)時(shí)熒光定量的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的。

圖6 8個(gè)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR結(jié)果。柱上不同字母表示顯著差異(P<0.05); 4: 4月的木質(zhì)部; 6: 6月的木質(zhì)部; 8: 8月的木質(zhì)部; 10: 10月的木質(zhì)部。

圖7 8個(gè)差異基因的表達(dá)。*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001。

3 結(jié)論和討論

濕地松是重要的產(chǎn)脂樹種之一，由于其基因組較大和遺傳背景不清，調(diào)控松脂合成的機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，為濕地松松脂合成的分子機(jī)制研究提供了很好的研究手段，目前已經(jīng)完成了濕地松全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組和高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作[8–9]。但針對(duì)松脂合成通路解析及其相關(guān)調(diào)控基因挖掘與鑒定等方面的分析則較少涉及，分子調(diào)控機(jī)制的研究還處于開始階段。因此，本研究以濕地松無性系的針葉與不同采脂時(shí)期的木質(zhì)部作對(duì)比, 針對(duì)松脂產(chǎn)量季節(jié)性變化開展二代高通量測(cè)序，并以火炬松基因組為參考進(jìn)行有參分析，Q30平均為94.77%，與火炬松基因組的平均比對(duì)率為90.21%，高于前人[10]的研究報(bào)道，說明本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

松脂主要由萜類物質(zhì)組成，在針葉樹種中萜類物質(zhì)通過MVA和MEP途徑合成，有很多基因參與萜類物質(zhì)生物合成[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)133個(gè)差異基因參與萜類物質(zhì)合成，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等。和基因分別是MVA途徑和MEP途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵的限速酶[11–12]。本研究中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因，其中5個(gè)在針葉中表達(dá)量較高，而在油松中發(fā)現(xiàn)基因在新萌發(fā)的針葉中表達(dá)量顯著高于1 a生和2 a生針葉，說明新萌發(fā)針葉可能是萜類物質(zhì)合成的主要場(chǎng)所[7]；1個(gè)(PITA_13112)基因在10月木質(zhì)部和針葉中呈高表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在10月產(chǎn)脂量最高，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，且該基因在高產(chǎn)脂的無性系中的表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)脂無性系，說明該基因在濕地松中可能是調(diào)控松脂合成的關(guān)鍵基因。但在思茅松(var.)的高產(chǎn)脂機(jī)制研究中，基因在高、低產(chǎn)脂無性系中無差異表達(dá)[13]。因此，基因在不同松類樹種中表達(dá)模式不一，在濕地松萜類物質(zhì)合成中的具體調(diào)控作用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。在濕地松中發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因呈差異表達(dá)，選擇基因(PITA_15631)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在不同月份的木質(zhì)部之間表達(dá)量差異不顯著，在高產(chǎn)脂無性系與低產(chǎn)脂無性系中差異也不顯著。在思茅松中，基因(AIY22671.1)在高產(chǎn)脂無性系中呈現(xiàn)高表達(dá)[13]，該基因與基因(PITA_15631)相似度為98.81%, 為同一家族中不同基因；而在馬尾松的8個(gè)基因中有5個(gè)在低產(chǎn)脂無性系中呈現(xiàn)高表達(dá)，僅有1個(gè)在高產(chǎn)脂無性系中具有較高表達(dá)量[14]，因此，該基因與其他松樹中已報(bào)道的基因序列存在差異，其生物學(xué)功能可能存在差異，故其在濕地松中的調(diào)控作用尚需要深入開展功能驗(yàn)證。

萜烯合酶基因()分為7個(gè)基因亞家族，包括和,松屬植物的基因通常屬于家族[14], 它是萜類合成通路下游的一個(gè)關(guān)鍵基因，催化底物(如GPP、FPP、GGPP和OPP)上烯丙基二磷酸鍵的斷裂或質(zhì)子化，電離產(chǎn)生酶結(jié)合活性碳陽離子中間體，然后在酶活性位點(diǎn)的空間約束下重新排列或環(huán)化，最終形成不同鏈長(zhǎng)的有環(huán)或無環(huán)萜類化合物,對(duì)萜類多樣性的貢獻(xiàn)極大[15–16]。已有研究表明，松科植物中含有大量的萜類合成酶，火炬松中鑒定出68個(gè)萜類合成酶[17]，馬尾松中有50個(gè)轉(zhuǎn)錄本，19個(gè)呈差異表達(dá)[18]，通過基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)油松有134個(gè)基因，遠(yuǎn)高于其他植物中發(fā)現(xiàn)的基因數(shù)量[7]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了68個(gè)基因，其中絕大部分在針葉中表達(dá)量較高，而在不同月份的木質(zhì)部中呈差異表達(dá)的有19個(gè)。在木質(zhì)部呈差異表達(dá)的19個(gè)基因中選擇3個(gè)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明3個(gè)基因在產(chǎn)脂高峰期的表達(dá)與其他時(shí)期具有顯著差異，其中2個(gè)基因(PITA_39473和PITA_38904)的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，1個(gè)基因(PITA_28724)與測(cè)序結(jié)果有點(diǎn)偏差，但在高產(chǎn)脂無性系中表達(dá)量也顯著高于低產(chǎn)脂無性系。這與思茅松、馬尾松的研究結(jié)果相似[13–14]，說明這3個(gè)基因正調(diào)控萜類物質(zhì)合成。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是進(jìn)行生物體內(nèi)跨膜運(yùn)輸?shù)囊环N特殊蛋白，含有1個(gè)由12個(gè)跨膜螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)和與ATP結(jié)合的區(qū)域(NBD)，可分為內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物次生代謝物的運(yùn)輸，還具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能[20]。在松屬植物中，參與松脂合成相關(guān)的萜烯類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)在火炬松和馬尾松中與松脂合成相關(guān)[6,21]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了27個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因, 其中大部分在8月的表達(dá)量最高。3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因，除了(PITA_13961)外，(PITA_33107)和(PITA_05351)均在產(chǎn)脂高峰期(8月)的表達(dá)量最高，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，且整體上在高產(chǎn)脂無性系中的表達(dá)量高于低產(chǎn)脂無性系。同樣，在濕地松中通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析篩選出6個(gè)與產(chǎn)脂相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)基因，其中4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因在高產(chǎn)脂無性系中表達(dá)量較高，2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因則在低產(chǎn)脂無性系中表達(dá)量較高[22]，在馬尾松中也有類似情況[6]。因此，轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族中不同基因可能在松脂合成調(diào)控中發(fā)揮不同作用，具體調(diào)控機(jī)制尚需要開展進(jìn)一步的研究與探索。

綜上，本研究挖掘出133個(gè)參與萜類物質(zhì)合成通路的相關(guān)差異基因，其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因在萜類物質(zhì)合成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，和基因?yàn)樗芍祁愇镔|(zhì)合成上游通路中關(guān)鍵的限速酶，而3個(gè)基因(PITA_39473、PITA_38904和PITA_28724)和2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PITA_33107和PITA_05351)在松脂萜類物質(zhì)合成下游通路中發(fā)揮關(guān)鍵的正調(diào)控作用。

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Genes Related to Resin Biosynthesis in Xylem and Needle of

ZHANG Wenjuan1, GU Zhengjun2, HU Shan2, ZHANG Zhihong3, LI Huogeng1, YANG Chunxia2*

(1. Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology of Ministry of Education, Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University,Nanjing 210037, China; 2. Institute of Forest Genetic Breeding and Cultivation, Jiangxi Academy of Forestry,Nanchang 330032, China; 3. Xiajiang County Forest Seed Farm,Ji’an 331409, Jiangxi, China)

In order to explore the genes related to pine resin biosynthesis in, a total of 12 samples of xylem at different resin collection stages and needles were used for high-throughput transcriptome sequencing. Compared with the reference genome of, a total of 68 211 unigenes and 546 356 450 clean reads were obtained with an average mapping rate of 90.21%. The expression profiles between needles and xylem were compared in pairs. The differentially expressed genes (DEGs) were selected according to<0.05, |log2foldchange|> 1.0, and then annotated by GO and KEGG enrichment analysis. The results showed that 133 DEGs involved in terpene synthesis, most of which were enriched in MEP pathway. Eight candidate genes related to pine resin biosynthesis were selected from the DEGs and validated by RT-qPCR, in which,,,transporter genes were highly correlated with the rosin production. Therefore, 133 differential genes related to pine resin biosynthesis were mined through transcriptome sequencing, and among which threegenes and twotransporter genes positively regulate terpenoid synthesis.

; Resin; Transcriptome; Candidate genes involved in resin biosynthesis

10.11926/jtsb.4691

2022-06-17

2022-07-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32160389)；江西林業(yè)科學(xué)院青年科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2021522901)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32160389), and the Project for Distinguished Young Scholars of Jiangxi Academy of Forestry (Grant No. 2021522901).

張文娟(1996年生)，女，碩士，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail: ellanz@126.com

通訊作者 Corresponding author.E-mail: yangcx0812@126.com