白化菠蘿蜜莖2個(gè)蛋白激酶和4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族分析

張水仙, 王紫璇, 謝柳青, 于旭東, 蔡澤坪*, 羅佳佳,2

白化菠蘿蜜莖2個(gè)蛋白激酶和4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族分析

張水仙1a, 王紫璇1a, 謝柳青1b, 于旭東1a, 蔡澤坪1a*, 羅佳佳1b,2

(1. 海南大學(xué), a. 林學(xué)院, 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; b. 熱帶作物學(xué)院, 海口 570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所, 海口 571101)

為探究蛋白激酶(PKs)和轉(zhuǎn)錄因子(TFs)在白化菠蘿蜜()幼苗莖次生生長中的表達(dá)變化，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行預(yù)測及分類，并對挑選出的2個(gè)PKs和4個(gè)TFs家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明, 胞質(zhì)類受體激酶(RLCK)-VIII家族的DEGs上下調(diào)表達(dá)各4個(gè)，亮氨酸富集重復(fù)類受體激酶(LRR-RLK)-X家族Xa和Xb-2分支中的DEGs均下調(diào)表達(dá)，Xb-1中的均上調(diào)，TCP家族的20個(gè)DEGs中有15個(gè)上調(diào)表達(dá)，zf-HD和GRF家族中的大多數(shù)DEGs上調(diào)表達(dá)，Alfin-like家族中的DEGs均下調(diào)表達(dá)。因此，這表明6個(gè)家族可能在菠蘿蜜莖的次生生長過程和應(yīng)對非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

菠蘿蜜；莖；蛋白激酶；轉(zhuǎn)錄因子

莖的次生生長是樹木莖增粗的主要方式，包括次生木質(zhì)部和次生韌皮部的形成等一系列過程，與木材形成密切相關(guān)[1]。近年來，植物莖次生生長的研究主要在楊屬()植物中開展。Dharma- wardhana等[2]研究表明，胡楊()部分轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TFs)基因上調(diào)表達(dá)與莖的次生生長相關(guān)，對其生長速度、木材質(zhì)量等方面起促進(jìn)作用。Seyfferth等[3]確定了白楊()轉(zhuǎn)錄組中與木材相關(guān)的基因，并探究了木材形成中與乙烯相關(guān)的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，然而目前的研究集中在楊屬等速生樹種。

蛋白激酶(protein kinases, PKs)在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，其主要通過使底物蛋白磷酸化的方式將信號逐級放大從而引起細(xì)胞反應(yīng)[4]。植物類受體激酶(receptor-like kinases, RLKs)是PKs中重要的一類。RLKs定位在細(xì)胞膜上，典型的RLKs調(diào)控機(jī)制為信號分子與其胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合后, 激活胞內(nèi)激酶域進(jìn)而實(shí)現(xiàn)跨膜信號的傳導(dǎo)[5]。莖的次生生長主要依賴于形成層的活動(dòng)，Agusti等[6]通過反向遺傳學(xué)分析確定了擬南芥()中的RLK基因和以相反的作用調(diào)節(jié)形成層的活動(dòng)。TFs作為一類反式作用因子，能與啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[7]。有研究表明，POPCORONA (PtPCN)轉(zhuǎn)錄因子在楊樹莖的次生生長過程中能夠調(diào)控細(xì)胞的分化[8]，PtNAC、PtbZIP等轉(zhuǎn)錄因子與胡楊莖的次生生長密切相關(guān)[9]。PtGRF9轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)毛果楊()細(xì)胞壁的生物合成，進(jìn)而調(diào)控莖的次生生長[10]。但相關(guān)研究大多在正常植株中開展，對白化突變體莖次生生長中PKs和TFs的研究還鮮見報(bào)道。

菠蘿蜜()是優(yōu)質(zhì)的木材樹種，能夠帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。白化突變體已被運(yùn)用在雜交育種、分子標(biāo)記等諸多方面。本課題組前期考察中發(fā)現(xiàn)了白化菠蘿蜜苗(albinoseedling, AAS)，并對其次生生長莖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解剖觀察，其次生木質(zhì)部、次生韌皮部及周皮的厚度均減小[11]，且次生木質(zhì)部導(dǎo)管和次生韌皮部篩管的孔徑和面積減小，密度增大[12]，這說明白化現(xiàn)象對菠蘿蜜莖的次生生長具有負(fù)面影響。然而在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的PKs和TFs基因表達(dá)如何變化還需深入分析。

因此，本研究對白化菠蘿蜜苗次生生長莖中PKs和TFs的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行預(yù)測及分類,并通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等方法對挑選出的2個(gè)PKs和4個(gè)TFs家族進(jìn)行分析，為研究植物白化對莖PKs和TFs的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

菠蘿蜜()采自海南省儋州市海南大學(xué)儋州校區(qū)。菠蘿蜜母株具有隱性的白化突變，且子代能分離出白化(AAS)和正常幼苗[13]，以分離出的正常幼苗作為對照(CK)。將萌發(fā)40 d的AAS與CK次生生長莖置于液氮中速凍保存(–196 ℃),送華大基因公司進(jìn)行RNA提取、文庫構(gòu)建和測序。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

次生生長莖DEGs的編碼序列(coding sequence, CDS)、蛋白序列及基因表達(dá)量(fragments per kilo- base million, FPKM)從謝柳青等[14]獲取，SRA數(shù)據(jù)庫登錄號為PRJNA611876。43 881個(gè)DEGs的表達(dá)差異均在2倍以上，且Q-value<0.001。

1.3 菠蘿蜜PKs和TFs預(yù)測

將菠蘿蜜DEGs的CDS上傳到ITAK (http://itak. feilab.net/cgi-bin/itak/index.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行PKs和TFs預(yù)測。對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析PKs和TFs家族中上下調(diào)基因的數(shù)量并繪制柱狀圖。

1.4 多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

擬南芥蛋白序列或基因信息從TAIR (https://www. arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫獲得。進(jìn)化樹的構(gòu)建采用MEGA 6.05軟件，用Clustal W將擬南芥和菠蘿蜜蛋白進(jìn)行多序列比對。以鄰接法(neighbor-joining, NJ)建樹，設(shè)置Boot-strap為1 000，模式為Poisson model，缺口設(shè)為Pairwise deletion。

1.5 各家族DEGs的表達(dá)分析

通過在線網(wǎng)站Expression Heatmapper (http:// www2.heatmapper.ca/expression/)將樣品的FPKM進(jìn)行可視化處理。采用Row Z-score標(biāo)準(zhǔn)化方法繪制熱圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 PKs和TFs的數(shù)量和長度

本研究選取前期研究[14]得到的43 881個(gè)DEGs,對其中PKs和TFs相關(guān)基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明, PKs中上、下調(diào)DEGs分別為517和873個(gè)，其中26個(gè)(IV)僅在AAS中表達(dá)，67個(gè)(I)僅在CK中表達(dá)。TFs中上、下調(diào)DEGs分別為865和773個(gè)，其中34個(gè)(IV)僅在AAS中表達(dá)，43個(gè)(I)僅在CK中表達(dá)(圖1: A, B)。僅在AAS中表達(dá)的PKs和TFs基因長度中位數(shù)均最小，分別為2 262和1 251.5 bp (圖1: C, D)。

圖1 PKs和TFs中DEGs數(shù)量(A, B)和長度(C, D)。I: 僅在CK中表達(dá); II: CK和AAS共有且在AAS中上調(diào)表達(dá); III: CK與AAS共有且在AAS中下調(diào)表達(dá); IV: 僅在AAS中表達(dá)。

2.2 PKs和TFs家族分類和基因數(shù)量

在預(yù)測的1 390個(gè)PKs DEGs中，RLK超家族有747個(gè)，占53.74%，其中RLCK-RLK、LRR-RLK的DEGs數(shù)量較多，共有390個(gè)，占RLK總數(shù)的52.21% (圖2: A)。根據(jù)蛋白序列(下同)，RLCK-RLK的DEGs被劃分為12個(gè)亞家族，RLCK-RLK-VIIa-2的數(shù)量最多(51個(gè))，RLCK-RLK-VIII是DEGs上下調(diào)表達(dá)各占50%的4個(gè)家族中基因數(shù)最多的，且其亞組內(nèi)基因表達(dá)差異明顯(圖2: B)。LRR-RLK的DEGs被劃分為14個(gè)亞家族，LRR-RLK-XI-1中的數(shù)量最多(43個(gè))，以上調(diào)表達(dá)的居多。而LRR-RLK- Xa和LRR-RLK-Xb-2的DEGs均下調(diào)表達(dá)(圖2: C)。在預(yù)測的1 638個(gè)TFs DEGs中，上調(diào)表達(dá)(865個(gè))比下調(diào)表達(dá)(773個(gè))的多。且有11個(gè)家族中上調(diào)的DEGs均超過70%，其中TCP中的DEGs數(shù)量最多(20個(gè))，且大多數(shù)上調(diào)表達(dá)。zf-HD中上調(diào)的DEGs占總數(shù)的92.31%，GRF中的均上調(diào)表達(dá)。此外, 有6個(gè)家族中下調(diào)的DEGs數(shù)量超過各自所含總數(shù)的70%，其中Alfin-like中的DEGs均下調(diào)表達(dá)(圖2: D)。綜上，預(yù)測到RLCK-RLK-VIII、LRR-RLK-X、TCP、zf-HD、GRF和Alfin-like中的DEGs數(shù)量相對較多，且這6個(gè)家族中的DEGs上下調(diào)表達(dá)差異顯著(或亞組內(nèi)基因表達(dá)差異明顯)，故選擇其進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 RLCK-RLK-VIII和LRR-RLK-X受體激酶家族分析

RLCK-VIII家族中共預(yù)測到8個(gè)DEGs，主要聚于2個(gè)分支，其中，與、聚為一支，除外的DEGs均在AAS中下調(diào)表達(dá)。而另一支中的、均上調(diào)表達(dá)(圖3: A, B)。I分支中的RLCK- RLK-VIII基因家族成員DEGs在AAS中下調(diào)表達(dá)的居多，而II分支中則均上調(diào)表達(dá)。

圖2 不同家族中的DEGs數(shù)量。A: PKs家族; B: RLCK-RLK家族; C: LRR-RLK家族; D: TFs家族。

對預(yù)測的LRR-RLK DEGs進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在LRR-RLK-Xa中，與為同源基因，且均在AAS中下調(diào)表達(dá)。在LRR-RLK-Xb-1中，、與為直系同源基因，且均上調(diào)表達(dá)。分別與為直系同源基因,上調(diào)表達(dá)，而下調(diào)表達(dá)，且被認(rèn)為屬于RLK-LRR-Xb-2。和與聚為一支，均下調(diào)表達(dá)(圖3: C, D)。表達(dá)分析表明，LRR-RLK-Xa和LRR- RLK-Xb-2中的DEGs均下調(diào)表達(dá)，而LRR-RLK- Xb-1的均上調(diào)表達(dá)。

2.4 TCP和zf-HD轉(zhuǎn)錄因子家族分析

TCP家族同源性分析結(jié)果表明(圖4)，AAS中TCP家族的DEGs與PCF和CIN 2個(gè)亞家族的相關(guān)基因同源性更高，而在TB1/CYC亞家族中不存在DEGs。有12個(gè)DEGs存在于PCF中，8個(gè)DEGs存在于CIN中(圖4: A)。在PCF中，、、與聚為一支且置信度高于95%, 均在AAS中上調(diào)表達(dá)。、分別與、為直系同源基因，在AAS中上調(diào)表達(dá)，則下調(diào)表達(dá)。與、親緣關(guān)系最近，且均下調(diào)表達(dá)。總體而言，PCF中的DEGs上調(diào)表達(dá)的居多；在CIN中，除外均在AAS中上調(diào)表達(dá)。與聚為一個(gè)大的分支。、、與、為同源基因，與為直系同源基因(圖4: A, B)。表達(dá)分析表明，大多數(shù)DEGs在AAS中上調(diào)表達(dá)。

圖3 菠蘿蜜和擬南芥的RLCK-VIII (A)、LRR-RLK-X (C)家族系統(tǒng)進(jìn)化樹和菠蘿蜜DEGs表達(dá)(B, D)分析

圖4 菠蘿蜜和擬南芥的TCP (A)、zf-HD (C)家族系統(tǒng)進(jìn)化樹及菠蘿蜜DEGs表達(dá)(B, D)分析

zf-HD家族中共預(yù)測到13個(gè)DEGs，主要聚于4個(gè)分支，其中、、、、、與、、聚于一支，除外均在AAS中上調(diào)表達(dá)。、與為同源基因，、、、與、聚于一大支，且除外均在AAS中上調(diào)表達(dá)。與為直系同源基因，并與和聚于一大支，且下調(diào)表達(dá)(圖4: C, D)。表達(dá)分析表明，DEGs在AAS中上調(diào)表達(dá)的居多。

2.5 GRF和Alfin-like轉(zhuǎn)錄因子家族分析

從圖5: A, B可見，GRF家族中共預(yù)測到7個(gè)DEGs，主要分布在I、III和IV分支中, 其中與、為同源基因。與、聚為一支。IV分支中、、、、與、親緣關(guān)系較近。表達(dá)分析表明, 除和外均在AAS中上調(diào)表達(dá)。

圖5 菠蘿蜜和擬南芥的GRF (A)、Alfin-lik (C)家族系統(tǒng)進(jìn)化樹及菠蘿蜜DEGs表達(dá)(B, D)分析

在AAS中，Alfin-like家族的DEGs僅存在于第I和IV分支中。與、高度同源，、、、與聚為一支，且置信度大于75%。表達(dá)分析表明，這5個(gè)DEGs均在AAS中下調(diào)表達(dá)(圖5: C, D)。

3 結(jié)論和討論

Pittermann等[15]的研究表明，白化北美紅杉()莖的木質(zhì)部結(jié)構(gòu)較柔弱，且光合作用能力的喪失導(dǎo)致莖木質(zhì)部發(fā)育遲緩。王開榮[16]研究了7種白化茶的生長發(fā)育過程，白化茶的莖次生生長受到不同程度的抑制，白化程度最高的‘白葉茶1號’地徑最小。董俊娜等[11]報(bào)道AAS莖發(fā)育不良，其莖粗小于正常植株。這說明白化現(xiàn)象不利于莖的次生生長。

RLCK家族中的第VIII亞家族與脫落酸(abscisic acid, ABA)的調(diào)控密切相關(guān)，AtCARK6是胞質(zhì)ABA受體激酶的成員之一[17]。在擬南芥的ABA信號傳導(dǎo)中起著積極的作用，可通過提高細(xì)胞對ABA的敏感性，從而增強(qiáng)植物抗旱等抗環(huán)境脅迫的能力[18]。而AAS中與同源的5個(gè)DEGs中有4個(gè)下調(diào)表達(dá)，可能是其莖的次生生長過程對ABA不敏感的原因。由此推測RLK-RLCK-VIII亞家族可能通過ABA途徑調(diào)控菠蘿蜜莖的次生生長。

LRR-RLK是RLK中最大的一個(gè)家族，幾乎在植物生長發(fā)育的所有過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。Costa等[20]的研究表明，LRR-RLK中的一些基因(來自)在感染病毒的番茄()葉中下調(diào)表達(dá)。AtBIR1是第X家族成員之一，Gao等[21]報(bào)道，敲除會(huì)導(dǎo)致擬南芥細(xì)胞死亡。AAS生長到40 d時(shí)，莖變黃變褐甚至衰老死亡，這可能與同源的6個(gè)DEGs均下調(diào)表達(dá)有關(guān)。油菜素甾醇是木質(zhì)部發(fā)育的調(diào)節(jié)因子[22]。AtBRI1、AtBRL1和AtBRL3是BR信號的受體[23]，AAS中與其同源的5個(gè)DEGs均上調(diào)，這可能是莖木質(zhì)部發(fā)育受到影響的原因。

TCP是轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)大家族。其中,和在植物生長發(fā)育、生物脅迫等方面發(fā)揮作用[24]。Li等[25]檢測了在擬南芥根、莖、葉和花等器官中的表達(dá)，其在莖中的表達(dá)量較高。Lopez等[26]認(rèn)為在植物免疫中發(fā)揮作用。AAS中與和同源的7個(gè)DEGs均上調(diào)表達(dá)，這可能使莖次生生長的發(fā)育和免疫功能受到影響。此外，有研究表明過表達(dá)會(huì)降低植物對生長素(IAA)的敏感性[27]。而AAS中與同源的3個(gè)DEGs均上調(diào)表達(dá), 這可能是其對IAA的敏感性降低的原因之一。

zf-HD家族是陸生植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，如響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)控花的發(fā)育以及種子的壽命等[28]。Bueso等[29]研究表明擬南芥中的AtHB25轉(zhuǎn)錄因子能夠誘導(dǎo)赤霉素(GA)生物合成酶基因的表達(dá)，從而使具有生物活性的GA含量提高，AAS中與同源的4個(gè)均上調(diào)可能會(huì)改變GA的含量, 使莖的次生生長受到一定影響。的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖[30]，AAS中與同源的2個(gè)均上調(diào)可能會(huì)促進(jìn)莖中細(xì)胞的增殖。

GRF是一類植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是調(diào)控植物器官或組織的發(fā)育[31]。有研究表明，辣椒()幼苗經(jīng)GA處理后，的表達(dá)受到抑制[32]。而AAS中與同源的2個(gè)DEGs均上調(diào)，可能是對GA敏感性降低所導(dǎo)致的結(jié)果。Wang等[33]報(bào)道BR信號能促進(jìn)和的表達(dá)，調(diào)控黃化苗的轉(zhuǎn)綠。AAS中與和同源的5個(gè)DEGs均上調(diào)，這與AAS的同源基因上調(diào)表達(dá)相一致，預(yù)示AAS莖中BR信號可能有所增強(qiáng)，從而導(dǎo)致GRF的表達(dá)發(fā)生上調(diào)。

Alfin-like (AL)是植物特有的小型基因家族，在非生物脅迫反應(yīng)中起作用[34]。在擬南芥中，ABA可誘導(dǎo)基因的表達(dá)，且的高表達(dá)使植物對鹽分、干旱及低溫脅迫的耐受性增強(qiáng)從而提高植物的抗逆性[35]。而AAS中與同源的4個(gè)DEGs均下調(diào)，可能是ABA含量較低所造成的結(jié)果。

綜上，本研究通過預(yù)測AAS次生生長莖中PKs和TFs的DEGs，結(jié)果表明，RLCK-VIII、LRR-RLK-X、TCP、zf-HD、GRF和Alfin-like中的DEGs上、下調(diào)表達(dá)差異顯著且數(shù)量均較多，這6個(gè)家族可能分別通過調(diào)控ABA途徑、影響莖木質(zhì)部發(fā)育、降低IAA敏感性、促進(jìn)莖細(xì)胞增殖、增強(qiáng)莖BR信號、降低ABA含量的方式調(diào)控光合作用下菠蘿蜜莖的次生生長，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

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Analysis on 2 Protein Kinases and 4 Transcription Factors Families in AlbinoStems

ZHANG Shuixian1a, WANG Zixuan1a, XIE Liuqing1b, YU Xudong1a, CAI Zeping1a*, LUO Jiajia1b,2

(1a. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, College of Forestry; 1b. College of Tropical Crops, Hainan University,Haikou 570228, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101, China)

Protein kinases (PKs) and transcription factors (TFs) are important components of signal transduction, which are involved in the secondary growth of stems. To explore their expression changes in stem secondary growth of albinoseedlings, the differentially expressed genes (DEGs) of PKs and TFs were predicted and classified based on transcriptome data, and phylogenetic trees were constructed for 2 PKs and 4 TFs families. The results show that the number of up- and down-regulated DEGsin the receptor-like cytoplasmic kinase (RLCK)-VIII family was 4 each. All of DEGs in Xa and Xb-2 branches in leucine-rich repeat receptor kinase (LRR-RLk)-X family were down-regulated, while those in Xb-1 branch were up-regulated. Among 20 DEGs in TCP family, 15 were up-regulated in AAS. And most genes in zf-HD and GRF families were up-regulated, while allin Alfin-like were down-regulated in AAS.Therefore,it was suggested that six families might play an important role in the secondary growth ofstems and the response to abiotic stress.

; Stem; Protein kinase; Transcription factor

10.11926/jtsb.4619

2022-01-24

2022-05-17

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(319MS017)；海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(kyqd1620)；海南大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(SA2000008501, SA2100001230)資助

This work was supported by the Project for Natural Science in Hainan (Grant No. 319MS017), the Project for Scientific Research Startup in Hainan University (Grant No. kyqd1620), and the Project for National Innovation and Entrepreneurship Training of Hainan University (Grant No. SA2000008501, SA2100001230).

張水仙(1999年生)，本科，研究方向?yàn)橐吧鷦?dòng)物與自然保護(hù)區(qū)管理。E-mail: 2714891974@qq.com

通訊作者 Corresponding author.E-mail: 494266605@qq.com