心陽片通過抑制AGEs介導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活改善心力衰竭小鼠心肌纖維化的作用機(jī)制

梁碧容，周政，何嘉琪，劉景，張璐，黎歡，3，黃育生，3，王陵軍（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405；2. 廣州中醫(yī)藥第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 50405）

心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能障礙導(dǎo)致心室充盈和射血能力受損而引起的一組臨床綜合征[1-2]，表現(xiàn)為心臟無法提供足夠的血液維持各器官的代謝需求[1，3-4]。心力衰竭的發(fā)病率和死亡率居高不下，給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來巨大的負(fù)擔(dān)[3，5]。心肌重塑是心力衰竭發(fā)展過程中的重要特征，而心肌纖維化在心肌重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。心肌纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在心臟組織中過度沉積，而活化的成纖維細(xì)胞是促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生的主要來源[7-8]。研究[9-11]顯示，晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation endproducts，AGEs）能夠激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生，而抑制心臟成纖維細(xì)胞的激活可以有效改善心肌纖維化。

中醫(yī)認(rèn)為，心力衰竭的主要病機(jī)是氣血陰陽虛衰、血瘀水停，治療原則主要為調(diào)和陰陽氣血，兼以活血利水[12-14]。心陽片是本課題組根據(jù)“益氣溫陽，活血利水”的治則研發(fā)的中藥復(fù)方制劑，前期研究[15-16]表明，心陽片能夠有效改善心力衰竭小鼠的心功能，減輕心肌纖維化。故本研究擬進(jìn)一步探討心陽片調(diào)控AGEs 介導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活，從而改善心力衰竭小鼠心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物8 周齡C57BL/6J 雄性小鼠48 只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（25±2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44005800008225，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0034。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號(hào)：20180921001。

1.2 藥物及主要試劑心陽片（由吉林參、淫羊藿、黃芪、益母草、毛冬青、葶藶子、車前子組成），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，批號(hào)：20 180401；培哚普利叔丁胺片（雅施達(dá)），施維雅（天津）制藥有限公司，批號(hào)： H20034053。AGEs 抗體，美國Proteintech 公司，批號(hào)：12148；GAPDH抗體（批號(hào)：2118）、二抗Anti-rabbit IgG（批號(hào)：7074），美國CST 公司；vimentin 抗體，英國Abcam公司，批號(hào)：92547；PVDF 膜、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)：P90720），美國Millipore 公司；動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（批號(hào)：DP431）、cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)： KR202），北京天根生化科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010；Masson 染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1340。

1.3 主要儀器Vevo2100 型高分辨率小動(dòng)物超聲機(jī)，加拿大Visual Sonics 公司； Inspira ASVv 容量控制小動(dòng)物呼吸機(jī)，美國HARVARD 公司；Mastercycler?Nexus 梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司；CFX96 Touch 熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)、電泳及電轉(zhuǎn)裝置、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；Eclipse CI 型正置光學(xué)顯微鏡，日本Nikon 公司；Microfuge 20 小型高速離心機(jī)，美國Beckman 公司；TS 型多用脫色搖床，海門市其林貝爾儀器制造公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥將48 只C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為6 組：假手術(shù)組、模型組、心陽片低劑量組、心陽片中劑量組、心陽片高劑量組及培哚普利組，每組8 只。

采用橫向主動(dòng)脈縮窄（Transverse aortic constriction，TAC）法建立心力衰竭小鼠模型：小鼠稱定質(zhì)量后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）進(jìn)行麻醉。將小鼠固定在恒溫手術(shù)臺(tái)上，氣管插管連接呼吸機(jī)；沿左側(cè)胸骨剪開至第二肋，分離雙側(cè)胸腺，暴露主動(dòng)脈弓；根據(jù)主動(dòng)脈弓直徑選擇27G 針頭置于主動(dòng)脈弓處進(jìn)行結(jié)扎，然后取出針頭；關(guān)閉胸腔，待小鼠恢復(fù)自主呼吸后拔出氣管插管，然后進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組暴露主動(dòng)脈弓后，將絲線環(huán)繞主動(dòng)脈弓，但并不進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后4 周利用心臟彩超進(jìn)行心功能檢測(cè)，以左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）低于50% 確認(rèn)TAC小鼠造模成功。

按照60 kg 成人臨床給藥劑量（每日2.25 g）折算，心陽片低、中、高劑量組分別按照455、910、1 820 mg·kg-1灌胃給藥；培哚普利組給予0.61 mg·kg-1培哚普利叔丁胺片灌胃給藥；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)6 周。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心功能小鼠連續(xù)給藥6 周后，利用小動(dòng)物超聲機(jī)檢測(cè)各組小鼠的心功能。小鼠吸入1%異氟烷進(jìn)行麻醉后，采用超聲機(jī)掃描評(píng)估心臟功能，收集LVEF 和左室短軸縮短率（LVFS）數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫組織化學(xué)法測(cè)定小鼠心臟組織AGEs 的表達(dá)將小鼠心臟組織放入4%多聚甲醛溶液固定過夜；然后用梯度濃度乙醇進(jìn)行組織脫水；二甲苯透明1 h 后，石蠟包埋切片；然后脫蠟水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，以H2O2溶液室溫下孵育10 min 阻斷內(nèi)源過氧化物酶；封閉后4 ℃下孵育一抗AGEs（1∶100）過夜；以二抗Anti-rabbit IgG（1∶1 000）孵育1 h；DAB染色后蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片后，在顯微鏡下采集圖像進(jìn)行分析。

1.7 qPCR 法檢測(cè)小鼠心臟組織中vimentin、FSP1及纖維化相關(guān)基因collagenI、collagen Ⅲ、CTGF、fibronectin 的mRNA 表達(dá)嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，進(jìn)行心臟組織RNA 提取和合成cDNA。將小鼠心臟組織加入組織裂解液后進(jìn)行研磨，以13 400×g離心5 min，取上清；加入去蛋白液RW1、漂洗液RW，室溫下靜置、離心后得到總RNA；進(jìn)行純度及濃度檢測(cè)；使用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。所得cDNA 樣本根據(jù)PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行配制，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析；以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列見表1。

1.8 Western Blot 法檢測(cè)小鼠心臟組織中vimentin蛋白的表達(dá)取小鼠心臟組織30 mg，加入裂解液進(jìn)行研磨；以4 ℃、13 400×g離心5 min 后，取上清；采用BCA 蛋白濃度定量試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；用5%脫脂奶粉在室溫下?lián)u床封閉1 h，TBST 洗滌5 min；TBST 稀釋一抗vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃下?lián)u床孵育過夜；TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h；TBST 洗滌3 次，每次5 min，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；掃描后，使用ImageJ 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.9 Masson 染色法觀察小鼠心肌纖維化程度將小鼠心臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定過夜，然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片（4 μm），進(jìn)行常規(guī)Masson染色后，在顯微鏡下觀察、采集圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’s T3 法檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心功能的影響結(jié)果見圖1。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的LVEF、LVFS顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，心陽片低、中、高劑量組及培哚普利組小鼠的LVEF、LVFS 均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，心陽片可以有效改善心力衰竭小鼠的心功能。

圖1 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心功能的影響（±s，n=6）Figure 1 Effects of Xinyang Tablets on cardiac function in mice with heart failure（±s，n=6）

2.2 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心臟組織中AGEs 表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟組織中的AGEs 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，心陽片低、中、高劑量組及培哚普利組小鼠心臟組織中的AGEs 表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明，心陽片能夠抑制心力衰竭小鼠心臟組織中的AGEs 表達(dá)。

圖2 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心臟組織中AGEs 表達(dá)的影響（免疫組化，×100；±s，n=3）Figure 2 The effect of Xinyang Tablets on the expression of AGEs in heart tissue of mice with heart failure（IHC，×100；±s，n=3）

2.3 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心臟組織中成纖維細(xì)胞標(biāo)記物vimentin、FSP1 表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟組織中vimentin、FSP1 mRNA 表達(dá)及vimentin 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，心陽片低、中、高劑量組及培哚普利組小鼠心臟組織中vimentin、FSP1 mRNA 表達(dá)及vimentin 蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果提示，心陽片能夠抑制心力衰竭小鼠心臟組織中成纖維細(xì)胞的激活。

圖3 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心臟組織中vimentin、FSP1 表達(dá)的影響（±s，n=3～4）Figure 3 Effects of Xinyang Tablets on the expressions of vimentin and FSP1 in heart tissue of mice with heart failure（±s，n=3-4）

2.4 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心肌纖維化的影響結(jié)果見圖4。Masson 染色結(jié)果顯示紅色部分為肌纖維，藍(lán)色部分為膠原纖維。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟組織中有大量膠原纖維沉積。與模型組比較，心陽片低、中、高劑量組及培哚普利組小鼠心臟組織中無明顯膠原纖維沉積。結(jié)果表明，心陽片能夠有效改善心力衰竭小鼠的心肌纖維化。

圖4 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心肌纖維化的影響（Masson 染色，×100）Figure 4 The effect of Xinyang Tablets on myocardial fibrosis in mice with heart failure（Masson staining，×100）

2.5 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心臟組織中纖維化相關(guān)指標(biāo)collagenI、collagenⅢ、fibronectin、CTGF mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟組織中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、CTGF、fibronectin mRNA 表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，心陽片低、中、高劑量組及培哚普利組小鼠心臟組織中collagenⅠ、collagen Ⅲ、fibronectin、CTGF mRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 心陽片對(duì)心力衰竭小鼠心臟組織中collagenⅠ、collagenⅢ、fibronectin、CTGF mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=4）Figure 5 Effects of Xinyang Tablets on the mRNA expressions of collagenⅠ，collagen Ⅲ，fibronectin and CTGF in heart tissue of mice with heart failure（±s，n=4）

3 討論

心力衰竭是各種心血管疾病的終末期階段，由于人口老齡化、心肌梗死后生存率提高等原因，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)顯著升高[5，17]。高血壓、糖尿病、高脂血癥等是心力衰竭的基礎(chǔ)病因，長期心臟壓力過度負(fù)荷是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生的主要原因，以心臟重塑為重要特征。本研究采用TAC 法復(fù)制了心力衰竭小鼠模型，心臟肥大、心肌纖維化和炎癥是該模型的主要特征[18]。炎癥、纖維化與心力衰竭的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[19]，改善炎癥、心肌纖維化被認(rèn)為是治療心力衰竭的新策略[20-21]。

晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)所形成的一系列具有高度活性的終產(chǎn)物[22]。有研究[23-24]表明，AGEs 被認(rèn)為是用于評(píng)估心力衰竭嚴(yán)重程度和預(yù)后的一種生物標(biāo)志物。心力衰竭患者的AGEs 水平明顯升高[25]。本研究結(jié)果也表明，與假手術(shù)組比較，心力衰竭模型組小鼠心臟組織中的AGEs 表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了AGEs 與心力衰竭的關(guān)系。此外，活化的成纖維細(xì)胞是心肌纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)生心力衰竭時(shí)心臟成纖維細(xì)胞可分化成為肌成纖維細(xì)胞，分泌膠原和基質(zhì)蛋白，膠原蛋白和基質(zhì)蛋白過量沉積則導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生[26]。因此，抑制成纖維細(xì)胞激活對(duì)改善心肌纖維化至關(guān)重要。本課題組前期研究[10]表明，AGEs 可以激活心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)心力衰竭中心肌纖維化的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，心陽片可以升高心力衰竭小鼠的LVEF、LVFS，減少心肌纖維化面積，降低心臟組織中AGEs 表達(dá)，下調(diào)成纖維細(xì)胞標(biāo)記物vimentin、FSP1 表達(dá)及纖維化相關(guān)指標(biāo)collagen Ⅰ、collagenⅢ、fibronectin、CTGF mRNA 表達(dá)。提示心陽片可能通過調(diào)控AGEs 改善心力衰竭小鼠心功能和心肌纖維化。

中醫(yī)根據(jù)心力衰竭的臨床癥狀將其歸屬于“心水”“心衰”“懸飲”“水腫”“喘癥”“心脹”等范疇，認(rèn)為主要病因?yàn)橥庑扒忠u、勞倦內(nèi)傷、飲食及七情所傷、臟腑失調(diào)[27]，屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，以心氣虧虛為本，血瘀水停為標(biāo)[28]。金代成無己在《傷寒明理論》中記載：“氣虛停飲，陽氣內(nèi)弱，心下空虛，正氣內(nèi)動(dòng)而悸也”，說明氣陽虛是心力衰竭病機(jī)中不可或缺的因素[13]?；谛牧λソ叩闹嗅t(yī)病因病機(jī)，其治則主要為益氣溫陽、活血利水[27]。心陽片能夠有效改善心力衰竭患者的臨床癥狀[29-30]，方中吉林參、黃芪均有補(bǔ)氣的功效，黃芪還能利水消腫；淫羊藿補(bǔ)腎壯陽；益母草、毛冬青活血通脈、利尿消腫；兼以葶藶子、車前子加強(qiáng)利水消腫作用；全方共奏益氣溫陽、活血化瘀利水之功效。

綜上所述，心陽片可以有效改善心力衰竭小鼠的心肌纖維化，可能與其抑制AGEs 介導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活有關(guān)。