培哚普利和螺內(nèi)酯對(duì)大鼠糖尿病腎病水通道蛋白表達(dá)的影響

莫娜 王正義 童麗靈 (?？谑腥嗣襻t(yī)院內(nèi)科，海南 ?？?571100)

糖尿病腎病是常見的慢性腎臟疾病之一，會(huì)逐漸導(dǎo)致腎功能障礙〔1〕。糖尿病腎病常見特征是腎小球?yàn)V過屏障受損導(dǎo)致持續(xù)蛋白尿。臨床上糖尿病腎病患者會(huì)逐漸出現(xiàn)蛋白尿，進(jìn)而出現(xiàn)腎功損傷，最終導(dǎo)致腎衰竭〔2，3〕。糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病,以往一直認(rèn)為糖尿病患者多尿癥狀是由高血糖引起的滲透性利尿，而新近研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白(AQPs)也在其尿液濃縮過程及水代謝失調(diào)中發(fā)揮重要作用〔4〕。本研究旨在探討培哚普利和螺內(nèi)酯對(duì)糖尿病腎病AQP表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠72只，體重(200±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，室溫18～22℃，濕度50%～70%，自由飲水；培哚普利片購自施維雅天津制藥有限公司，螺內(nèi)酯片購自張家口云峰藥業(yè)有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，尿蛋白定量試劑盒購自上海通蔚生物科技有限公司，肌酐試劑盒購自海通蔚生物科技有限公司，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4多克隆抗體購自上海超研生物科技有限公司。血糖儀購自美國LifeScan，酶標(biāo)儀購自美國BioRad。

1.2糖尿病腎病模型制備 高脂飼料(脂肪40%、蔗糖20%、蛋白質(zhì)3%與大鼠普通粉料混合)喂養(yǎng)4 w后，給予STZ 50 mg/kg(用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.1 mol/L配制一次性腹腔注射)。正常組注射等體積的檸檬酸緩沖液。于注射STZ 72 h后斷尾取血測(cè)定血糖值，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功。再喂養(yǎng)4 w，收集24 h尿液24 h尿蛋白≥30 h則說明糖尿病腎病模型制備成功。將造模成功的48只大鼠隨機(jī)分為模型組、培哚普利組、螺內(nèi)酯組、培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組各12只，正常組12只。模型組和正常組等劑量生理鹽水灌胃；培哚普利組給予2 mg/(kg·d)培哚普利灌胃；螺內(nèi)酯組給予50 mg/(kg·d)螺內(nèi)酯灌胃；培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組給予2 mg/(kg·d)培哚普利+50 mg/(kg·d)螺內(nèi)酯灌胃。連續(xù)8 w。

1.3方法 于結(jié)束前1 d，采取且計(jì)算24 h尿量；腹腔主動(dòng)脈取血，離心，1 500 r/min，分離血清標(biāo)本，置于-20℃下保存待測(cè)。取上述血清標(biāo)本測(cè)定空腹血糖(FPG)。采用酶法測(cè)定血肌酐含量；取上述尿液標(biāo)本，離心，去除沉渣，采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽法測(cè)定24 h尿蛋白量。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量。Western印跡測(cè)定AQP1、AQP2、AQP3、AQP4蛋白表達(dá)：給予大鼠50 mg/kg 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取腎臟髓質(zhì)，于-70℃下保存待測(cè)。用蛋白裂解液提取組織總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后將其轉(zhuǎn)移蛋白到硝酸纖維素膜上。采用5%脫脂奶粉封閉，加入AQP1、AQP2、AQP3、AQP4多克隆抗體(1∶200)孵育，放置于4℃下過夜。再加入二抗(1∶2 000)孵育2 h。以電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影，圖像掃描后，再以Quantitiy one圖像分析軟件分析條帶灰度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組FPG比較 模型組FPG水平〔(26.52±4.32)mmol/L〕、培哚普利組〔(14.39±2.12)mmol/L〕、螺內(nèi)酯組〔(13.98±1.97)mmol/L〕和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組〔(11.41±1.38)mmol/L〕顯著高于正常組〔(9.32±1.20)mmol/L，P<0.05〕；培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組FPG顯著低于模型組(P<0.05)；培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組FPG顯著低于培哚普利組、螺內(nèi)酯組(P<0.05)。

2.2各組血肌酐和24 h尿蛋白量比較 模型組、培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組血肌酐和24 h尿蛋白量顯著高于正常組(P<0.05)；培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組血肌酐和24 h尿蛋白量顯著低于模型組(P<0.05)；培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組血肌酐和24 h尿蛋白量顯著低于培哚普利組、螺內(nèi)酯組(P<0.05)。見表1。

表1 各組血肌酐和24 h尿蛋白量比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與培哚普利組和螺內(nèi)酯組比較:3)P<0.05;下表同

2.3各組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量比較 模型組、培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量顯著高于正常組(均P<0.05)；培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量顯著低于模型組(均P<0.05)；培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量顯著低于培哚普利組、螺內(nèi)酯組(均P<0.05)。見表2。

組別AQP1AQP2AQP3AQP4正常組14.38±2.2917.92±1.9723.14±4.5612.31±2.04模型組41.32±6.781)38.63±3.251)51.32±6.981)29.42±3.871)培哚普利組27.81±4.251)2)26.14±2.081)2)37.82±5.491)2)20.19±3.251)2)螺內(nèi)酯組28.19±5.101)2)25.43±3.291)2)36.90±5.211)2)20.56±3.011)2)培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組19.15±2.571)2)3)20.19±1.421)2)3)29.37±3.261)2)3)15.42±2.311)2)3)

2.4各組腎組織AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達(dá)比較 模型組、培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達(dá)灰度值顯著高于正常組(均P<0.05)；培哚普利組、螺內(nèi)酯組和培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達(dá)灰度值顯著低于模型組(均P<0.05)；培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達(dá)灰度值顯著低于培哚普利組、螺內(nèi)酯組(均P<0.05)。見表3。

組別AQP1AQP2AQP3AQP4正常組0.17±0.030.25±0.040.19±0.020.13±0.03模型組0.61±0.141)0.56±0.081)0.51±0.101)0.53±0.121)培哚普利組0.37±0.071)2)0.40±0.051)2)0.35±0.061)2)0.31±0.061)2)螺內(nèi)酯組0.38±0.091)2)0.39±0.081)2)0.36±0.081)2)0.32±0.071)2)培哚普利聯(lián)合螺內(nèi)酯組0.25±0.051)2)3)0.31±0.031)2)3)0.25±0.031)2)3)0.21±0.091)2)3)

3 討 論

隨著近年來人們飲食結(jié)構(gòu)和生活水平的不斷改善，糖尿病發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量〔5,6〕。糖尿病腎病是糖尿病重要的一種并發(fā)癥，且導(dǎo)致糖尿病死亡的主要原因之一〔7〕。但目前對(duì)糖尿病腎病具體發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。培哚普利和螺內(nèi)酯分別作為腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和醛固酮抑制劑，前者主要通過阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)使醛固酮分泌減少，增加鈉的排出，同時(shí)降低腎小球內(nèi)壓增加腎血流量，使尿量增加〔8～10〕。而后者螺內(nèi)脂主要是通過直接抑制醛固酮，使腎小管對(duì)鈉重吸收減少，排鈉增加，也使尿量增加，二者對(duì)糖尿病腎病水調(diào)節(jié)代謝機(jī)制有相似之處，即通過抑制醛固酮機(jī)制〔11～13〕。本研究提示培哚普利和螺內(nèi)酯可降低FPG、血肌酐和24 h尿蛋白量含量。

但培哚普利和螺內(nèi)酯是否還存在對(duì)AQP的調(diào)節(jié)作用目前仍未完全闡明。近年來，位于細(xì)胞膜上的特異性水轉(zhuǎn)運(yùn)孔道——AQP家族的發(fā)現(xiàn)為研究細(xì)胞膜水通透性的分子機(jī)制提供了新的視角。研究發(fā)現(xiàn)AQP的表達(dá)及功能改變將會(huì)影響特定細(xì)胞膜的水轉(zhuǎn)運(yùn)，而各種各樣的多尿癥及不同形式水腫的病理生理過程均與AQP有關(guān)，同時(shí)AQP還為疾病治療與水平衡調(diào)節(jié)的研究提供了理論基礎(chǔ)〔14,15〕。本研究提示培哚普利和螺內(nèi)酯可降低尿液及腎組織AQP含量。

綜上，培哚普利和螺內(nèi)酯對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟具有一定保護(hù)作用，且機(jī)制可能與降低尿液AQP水平及抑制腎組織AQP表達(dá)有關(guān)。