培哚普利對(duì)肥胖大鼠腸道微生態(tài)的影響

郭艷東，洪汝丹，汪艷蛟，張騰，馮月梅，張霓裳，錢映，楊早改，米飛，殷建忠1,

（1）保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 保山 678000;2）昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500）

肥胖是多種慢性病的重要致病因素，已成為全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題[1]。WHO 數(shù)據(jù)顯示，1975 年以來，全世界的肥胖人數(shù)幾乎增加了3倍，現(xiàn)在全球18 歲以上的人有超過6.5 億肥胖和19億超重，其中男性超重、肥胖率均低于女性[2]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)近日公布《中國(guó)肥胖預(yù)防與控制藍(lán)皮書》，我國(guó)約有4.4 億成年人超重，其中近1.3億人肥胖。有研究提示中國(guó)成人腹型肥胖率為31.5%，肥胖患病率為14%[3]。最新研究預(yù)測(cè)，至2030年，中國(guó)成人（≥18歲）超重/肥胖合并患病率將達(dá)到65.3%[4]。目前，肥胖病因未明，可能與腸道菌群紊亂等多種因素有關(guān)[5]。近年來，很多研究指出腸道菌群紊亂與肥胖等代謝性疾病相關(guān)[6-8]。本課題組前期研究結(jié)果提示云南高原偏寒地區(qū)漢族肥胖率為4.99%[9]，明顯低于全國(guó)水平，本研究推測(cè)肥胖發(fā)病率低的原因可能是因?yàn)楦咴h(huán)境改變了機(jī)體腸道菌群。培哚普利是第3 代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensinconverting-enzyme inhibitor，ACEI），ACEI 是一種抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性的化合物，ACE 參與脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能，ACE 催化血管緊張素I 生成血管緊張素II（AngII），AngII 可增加脂肪細(xì)胞中脂類合成和儲(chǔ)存[10]。大量的研究證實(shí)ACE 的表達(dá)和活性與肥胖有關(guān)[11-12]。有研究表明ACEI 治療可減輕體重[13-14]，但其對(duì)于肥胖的具體機(jī)制和對(duì)健康的影響還未明確。本課題主要是研究培哚普利干預(yù)肥胖發(fā)生的過程中腸道微生態(tài)的變化，探討培哚普利對(duì)肥胖的可能作用機(jī)制，以期為培哚普利的高效臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4 周齡SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠；培哚普利叔丁胺片；普通飼料17 kcal% Fat；高脂飼料45kcal%FatD12451；DNA抽提試劑盒E.Z.N.A.?SoilDNAKit；瓊脂糖；FastPfu Polymerase；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit；建庫試劑盒；測(cè)序試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥將44 只SPF 級(jí)Wistar 大鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成正常組（10只）及高脂飲食組（34只），正常組（B）大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組以高脂飼料喂養(yǎng)5 周造模，[（造模組大鼠體質(zhì)量-正常大鼠體質(zhì)量）/正常大鼠體質(zhì)量]×100%＞20%，判斷為肥胖模型制備成功。其中10 只造模失敗，予以剔除，將余下24 只按每組8 只隨機(jī)分為模型組（C）、培哚普利低（D）、高劑量組（E），藥物組連續(xù)給藥3周，每天1次，其他組給同容量的生理鹽水。培哚普利低、高劑量組給予培哚普利叔丁胺片0.4、2 mg/kg。給藥3周，每周稱體質(zhì)量1 次。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定每周測(cè)大鼠體重及計(jì)算 Lee's指數(shù)，8 周后采血，低溫離心取血清保存于-20 ℃冰箱，TC（酶法）、TG（酶法）、HDL-C（直接法）、LDL-C（直接法）、UA（尿酶紫外速率法）、GLU（己糖激酶法）含量測(cè)定則通過ISO15189 國(guó)際認(rèn)可的第3 方醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室昆明金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司檢測(cè)并出具報(bào)告。

1.2.3 糞便收集8 周后，收集大鼠糞便34份，快速置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。所取樣本送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA v3-v4 區(qū)域測(cè)序分析。

測(cè)序分析過程如下：對(duì)送檢樣本分別進(jìn)行總DNA 提取和檢測(cè)，然后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物鑒定、純化、定量、文庫制備及庫檢，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit構(gòu)建Miseq文庫，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，使用UPARSE 軟件和RDP classifier 軟件對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類和物種分類注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 培哚普利對(duì)大鼠體重及生化指標(biāo)的影響

2.1.1 培哚普利對(duì)高脂飲食大鼠體重增重和Lee's指數(shù)的影響由表1 可知，終體重、體重增重、Lee's 指數(shù)在不同組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Scheffe 法兩兩比較結(jié)果提示，與正常組比較，模型組大鼠終體重、體重增重、Lee's 指數(shù)升高（P＜0.01），說明模型建立成功；與模型組比較，其余各組大鼠終體重、體重增重均降低（P＜0.01，P＜0.05），與培哚普利低劑量組比較，培哚普利高劑量組大鼠終體重、體重增重均降低（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 培哚普利對(duì)高脂飲食大鼠體重和Lee's 指數(shù)的影響（）Tab.1 Effects of perindopril on body weight and Lee's index in high-fat diet rats（）

表1 培哚普利對(duì)高脂飲食大鼠體重和Lee's 指數(shù)的影響（）Tab.1 Effects of perindopril on body weight and Lee's index in high-fat diet rats（）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與培哚普利低劑量組比較，@P＜0.05，@@P＜0.01。

2.1.2 培哚普利對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響由表2 可知，TC 和HDL-C 在不同組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Scheffe 法兩兩比較結(jié)果提示，與正常組比較，模型組TC 水平降低（P＜0.05），模型組、培哚普利低劑量組、培哚普利高劑量組HDL-C 水平降低（P＜0.05，0.01）。

表2 培哚普利對(duì)對(duì)高脂飲食大鼠血生化指標(biāo)的影響[（），mmol/L]Tab.2 Effects of perindopril on blood biochemical indexes in high-fat diet rats [（），mmol/L）

表2 培哚普利對(duì)對(duì)高脂飲食大鼠血生化指標(biāo)的影響[（），mmol/L]Tab.2 Effects of perindopril on blood biochemical indexes in high-fat diet rats [（），mmol/L）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 培哚普利對(duì)大鼠腸道菌群多樣性的影響

Alpha 多樣性分析（表3），各組中的Coverage平均值為0.99，說明數(shù)據(jù)代表了樣品中99.00%以上的細(xì)菌類型，測(cè)序的深度和廣度都符合要求。與正常組比較，培哚普利低劑量組的Ace 指數(shù)和Chaol 指數(shù)升高，與模型組比較，培哚普利低劑量組的Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chaol 指數(shù)均有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示低劑量的培哚普利可能有提高大鼠腸道菌群物種豐富度的趨勢(shì)。

表3 培哚普利對(duì)大鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析（）Tab.3 Analysis of Alpha diversity of rat intestinal flora by perindopril（）

表3 培哚普利對(duì)大鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析（）Tab.3 Analysis of Alpha diversity of rat intestinal flora by perindopril（）

與正常組比較，#P＜0.05。

如圖1A 所示，通過分類操作單元（OTUs）韋恩圖，研究了不同組之間的OTU 組成的相似性和重疊性。全部樣本共689 個(gè)OTU，正常組、模型組、培哚普利低劑量組、培哚普利高劑量組的OTU 總數(shù)分別為561、592、619 和592，獨(dú)有的OTU 為22、9、14 和4。與正常組相比，模型組OTU 總數(shù)增加了5.53%（正常組：561；模型組：592），培哚普利低劑量組OTU 總數(shù)增加了10.34%（正常組：561；培哚普利低劑量組：619），培哚普利高劑量組OTU 總數(shù)增加了5.53%（正常組：561；培哚普利低劑量組：592）；與模型組相比，培哚普利低劑量組OTU 總數(shù)增加了4.56%（模型組：592；培哚普利低劑量組：619），但是，培哚普利高劑量組沒有增加（模型組：592；培哚普利高劑量組：592）。

圖1 培哚普利對(duì)大鼠腸道菌群的多樣性分析Fig.1 Diversity analysis of perindopril on the intestinal flora of rats

Beta-多樣性分析是OTUs 的豐富度信息比較腸道微生物群落之間的相似度程度。如圖1B 所示，正常組與模型組分布距離較遠(yuǎn)，說明群落結(jié)構(gòu)的分布明顯不同。培哚普利低劑量組與模型組沒有重疊，說明2 組的群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異性。

2.3 培哚普利對(duì)大鼠腸道菌群物種組成的影響及差異分析

2.3.1 門水平物種組成及差異分析由圖2A 可知，在所有的大鼠腸道菌群中，優(yōu)勢(shì)物種除了有各組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)物種還有變形菌門（Proteobacteria）。由圖2B 可知，群落柱形圖可解釋各組樣本的優(yōu)勢(shì)物種及其相對(duì)豐度，各組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)物種主要?dú)w屬為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota）和彎曲桿菌門（Campilobacterota）。由表4 可知，各組大鼠腸道菌群在門水平物種組成有顯著差異（P＜0.05）。與模型組比較，正常組厚壁菌門物種組成顯著升高（P＜0.05），脫硫桿菌門和彎曲桿菌門物種組成顯著降低（P＜0.0.），培哚普利低劑量組厚壁菌門物種組成顯著降低（P＜0.01），培哚普利高劑量組放線菌門物種組成顯著升高（P＜0.01）。

表4 各組大鼠糞便在門水平上的相對(duì)豐度（%/，正常組n=10，其余組n=8）Tab.4 Relative abundance of rat feces at phylum level in each group（%/，normal group n=10，other groups n=8）

表4 各組大鼠糞便在門水平上的相對(duì)豐度（%/，正常組n=10，其余組n=8）Tab.4 Relative abundance of rat feces at phylum level in each group（%/，normal group n=10，other groups n=8）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖2 各組大鼠腸道菌群門水平的優(yōu)勢(shì)物種及其相對(duì)豐度Fig.2 Predominant species and their relative abundance at the phylum level of rat gut flora in each group

2.3.2 屬水平物種組成及差異分析如圖3A 所示，所有大鼠腸道菌群在屬水平的優(yōu)勢(shì)物種主要有29 種（以群落相對(duì)豐度≥0.01 為篩選條件），如圖3B 所示，各組大鼠腸道菌群在屬水平的優(yōu)勢(shì)物種主要有18種，如圖3C 所示，各組大鼠的腸道菌群在norank_f__Muribaculaceae、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、Lachnospiraceae_NK4A136_group等15 個(gè)物種組成上具有顯著差異（P＜0.05、0.01）。與模型組比較，正常組擬普雷沃菌屬物種組成顯著升高（P＜0.05），螺桿菌屬物種組成顯著降低（P＜0.01），培哚普利低劑量組擬普雷沃菌屬、NK4A214_group、no_rank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group物種組成顯著升高（P＜0.05、0.01），培哚普利高劑量組norank_f__Erysipelotrichaceae、Enterorhabdus、葡萄球菌屬物種組成顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腸道菌群屬水平組成Fig.3 Level composition of the intestinal flora of rats in each group

2.4 大鼠腸道菌群與Lee's 指數(shù)、血生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過spearman 相關(guān)系數(shù)分析各組大鼠腸道菌群與Lee's index、血生化指標(biāo)相關(guān)性。如圖4 所示，在屬水平上（取屬水平豐度前50），乳酸球菌屬與Lee's index、GLU 呈正相關(guān)（P＜0.05、0.001），與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；屎豆屬菌與HDLC 呈正相關(guān)（P＜0.01），與 Lee's index 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；Erysipelatoclostridium與Lee's index 呈正相關(guān)（P＜0.05）；norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、norank_f__Erysipelotrichaceae與 Lee's index 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05、0.001）；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、Eubacterium xylanophilum-group與TG 呈正相關(guān)（P＜0.05）；考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）與LDL-C 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Allobaculum與TG呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；布勞特氏菌屬（Blautia）、Candidatus_Stoquefichus與UA 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。以上結(jié)果顯示，大鼠腸道菌群變化與Lee's 指數(shù)、血生化指標(biāo)異常存在相關(guān)性。

圖4 大鼠腸道菌群與Lee's 指數(shù)、血生化指標(biāo)Spearman 相關(guān)性分析Fig.4 Spearman correlation analysis of rat intestinal flora with Lee's index and blood biochemical index

3 討論

隨著人們膳食習(xí)慣的變化，高脂飲食逐漸增加，其過量攝入會(huì)導(dǎo)致脂肪蓄積從而形成肥胖[15]。脂肪過多會(huì)增加慢病的患病率和死亡率[16]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)腸道菌群在肥胖的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮舉足輕重的作用[17-18]。本研究表明，即使灌胃期間仍然給予高脂膳食，和模型組相比，培哚普利也顯著抑制大鼠體重增加，這可能是因?yàn)榕噙崞绽ㄟ^改善腸道菌群結(jié)構(gòu)來抑制體重增加。

16S rDNA 基因擴(kuò)增測(cè)序的分析結(jié)果表明，培哚普利低劑量組與模型組的群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異性，與模型組相比，培哚普利低劑量組OTU總數(shù)增加了4.56%，說明培哚普利可能提高了大鼠腸道菌群的多樣性；在門水平上，低劑量的培哚普利能顯著降低厚壁菌門物種組成，有升高擬桿菌門的趨勢(shì)。目前，大量研究證實(shí)，“肥胖菌群”特征是厚壁菌門增，擬桿菌門降[19]，擬桿菌門可發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸，厚壁菌門從食物中獲取能量，并以脂肪組織的形式儲(chǔ)存[20]，培哚普利高劑量組放線菌門物種組成顯著升高，Da Silva等[21]研究結(jié)果提示放線菌門和雙歧桿菌屬與BMI 呈負(fù)相關(guān)；從屬水平來看，低劑量的培哚普利能顯著提高擬普雷沃菌屬、NK4A214_group、no_rank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group的物種組成，有研究指出擬普雷沃菌屬可通過膳食纖維發(fā)酵短鏈脂肪酸[22]。短鏈脂肪酸可促使胰高血糖素樣肽的釋放，從而促進(jìn)胰島素的分泌，提高機(jī)體胰島素敏感性，減少脂肪沉積[23-24]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)培哚普利能夠降低肥胖大鼠體重，這可能與培哚普利改變腸道菌群有關(guān)。經(jīng)過培哚普利干預(yù)后，放線菌門和擬普雷沃菌屬升高，厚壁菌門降低，這可能是培哚普利發(fā)揮抑制肥胖的重要生理基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究存在一定的局限性，培哚普利的濃度只有高、低劑量，后期研究需進(jìn)一步考察不同濃度梯度對(duì)大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。