circRNA_MYLK靶向miR-92a-3p調(diào)控急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖及凋亡

饒 琦, 王丹丹, 羅 婷

(四川大學(xué)華西醫(yī)院血液科, 四川 成都 610044)

急性淋巴細(xì)胞白血病是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其主要特征為骨髓造血干細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分化異常且出現(xiàn)惡性增殖,臨床表現(xiàn)為貧血、感染等?；熓悄壳芭R床治療急性淋巴細(xì)胞白血病的主要方式,但部分患者存在耐藥性從而降低治療效果,導(dǎo)致預(yù)后較差[1]。急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,因而探究急性淋巴細(xì)胞白血病的致病機(jī)制有助于尋找該病的治療靶點(diǎn)。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是由反向剪接形成的一種閉合環(huán)狀RNA分子,參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程,在急性淋巴細(xì)胞白血病中已發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的circRNA[2,3]。環(huán)狀RNA輕鏈激酶(circular RNA light chain kinase,circRNA_MYLK)是一種致癌circRNA,據(jù)報(bào)道,circRNA_MYLK在卵巢癌中表達(dá)量升高,可充當(dāng)微小RNA-652(microRNA-652,miR-652)的海綿分子而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖[4]。但circRNA_MYLK在急性淋巴細(xì)胞白血病中的功能和調(diào)控機(jī)制尚不明確。通過在線預(yù)測軟件顯示,circRNA_MYLK與微小RNA-92a-3p(microRNA-92a-3p,miR-92a-3p)存在靶向結(jié)合位點(diǎn),研究表明,miR-92a在急性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)[5]。因此,本研究旨在探討circRNA_MYLK對急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其與miR-92a-3p的靶向調(diào)控關(guān)系,為進(jìn)一步闡釋急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1一般資料:選取2019年2月至2020年6月期間四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的56例急性淋巴細(xì)胞白血病患者為研究組,患者均為B淋巴細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病患者,其中,男36例,女20例,中位年齡10歲(6～14)歲。同時(shí)選取45例健康志愿者為對照組,其中,男25例,女20例,中位年齡11歲(7～16)歲。所有患者臨床資料完整且均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型等診斷確診為急性淋巴細(xì)胞白血病。排除標(biāo)準(zhǔn):接受急性淋巴細(xì)胞白血病治療患者;心臟、肝臟等重要臟器損傷患者;對藥物過敏患者;依從性較差者。人體組織樣本的收集和使用遵循《赫爾辛基宣言》,并獲得本院倫理研究會批準(zhǔn)同意(批號:201901-15002)。

1.2試劑與儀器:人急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系(SUP-B15、NALM-6、BALL-1)均購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自南京森貝伽生物;淋巴細(xì)胞分離液購自廣州鼎國生物;TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、qRT-PCR試劑均購自美國Thermo Fisher;circRNA_MYLK小分子干擾RNA(si-circRNA_MYLK,siRNA#1:5'-TACAGGTATGGCCTCACAAGT-3';siRNA#2:5'-ACTACAGGTATGGCCTCACAA-3')、miR-92a-3p寡核苷酸模擬物/抑制劑(miR-92a-3p mimics/anti-miR-92a-3p)及陰性對照(si-NC/miR-NC/anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物;circRNA_MYLK過表達(dá)載體(pcDNA-circRNA_MYLK)及其對照空載體(pcDNA)均購自美國Invitrogen;CCK-8試劑、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶;兔抗人cleaved-caspase 8、兔抗人cleaved-PARP、兔抗人cleaved-caspase 3抗體與二抗均購自美國CST。cytation 5多功能酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司);ABI Prism?7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國Applied Biosystems公司);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。

1.3單個(gè)核細(xì)胞分離:取兩組研究對象的骨髓液樣本4mL,加入4mL淋巴細(xì)胞分離液,4℃,離心(999×g)20min,吸取離心管中的白霧狀層的單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一無菌無酶的離心管內(nèi),然后加入2倍體積的PBS充分混勻4℃條件下經(jīng)999×g轉(zhuǎn)速離心10min,棄上清后將細(xì)胞團(tuán)置于-20℃保存。另外,將對照組研究對象的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離得到淋巴細(xì)胞混合物,用流式細(xì)胞儀分選B淋巴細(xì)胞。

1.4實(shí)驗(yàn)分組:培養(yǎng)SUP-B15細(xì)胞至對數(shù)生長期,將其濃度調(diào)整為2×104/mL,并接種于96孔板,每孔100μL。為干擾circRNA_MYLK的產(chǎn)生,用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將circRNA_MYLK干擾序列siRNA#1和siRNA#2分別轉(zhuǎn)染至SUP-B15細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞中circRNA_MYLK的改變。將SUP-B15細(xì)胞分為si-NC(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-circRNA_MYLK(轉(zhuǎn)染circRNA_MYLK siRNA#2)、anti-miR-NC(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-92a-3p(轉(zhuǎn)染anti-miR-92a-3p)、miR-NC(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-92a-3p(轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic)、si-circRNA_MYLK+anti-miR-NC(共轉(zhuǎn)染circRNA_MYLK siRNA#2和anti-miR-NC)和si-circRNA_MYLK+anti-miR-92a-3p(共轉(zhuǎn)染circRNA_MYLK siRNA#2和anti-miR-92a-3p)共8組。采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染6h后更換DMEM完全培養(yǎng)液,并繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5qRT-PCR檢測circRNA_MYLK、miR-92a-3p的表達(dá)水平:使用TRIzol試劑從兩組研究對象的單個(gè)核細(xì)胞、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系(SUP-B15、NALM-6、BALL-1)和對照組研究對象的B淋巴細(xì)胞以及各組SUP-B15細(xì)胞中提取總RNA。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH、U6為內(nèi)參,應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測各孔Ct值并采用2-ΔΔCt法計(jì)算circRNA_MYLK、miR-92a-3p的相對表達(dá)量。circRNA_MYLK:上游引物:5'-CAGTGCATGCTGTTTGTTCA-3',下游引物:5'-TCGGAGCTTGACTTCCAG-3';GAPDH:上游引物:5′-ATCCACGGGAGAGCGACAT-3′,下游引物:5′-CAGCTGCTTGTAAAGTGGAC-3′;U6:上游引物:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',下游引物:5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3';miR-92a-3p:上游引物:5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3',下游引物:5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'。

1.6CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖:將各組SUP-B15細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板(3000/孔),48h后每孔加入CCK-8溶液10μL孵育2h。采用酶標(biāo)儀在450nm處測定各孔光密度值(OD值),并根據(jù)公式[存活率=OD值實(shí)驗(yàn)組/OD值對照組×100%]計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7流式細(xì)胞儀檢測SUP-B15細(xì)胞周期:用胰蛋白酶消化各組SUP-B15細(xì)胞(2.5×105/mL)后經(jīng)999×g轉(zhuǎn)速離心5min,加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞后再次加入PBS重懸細(xì)胞,加入70%乙醇3.5mL后置于4℃條件下孵育24h,相同條件下離心后棄上清,收集細(xì)胞沉淀后加入50μL RNaseA,于37℃水浴30min后加入450μL PI染色液染色30min(4℃),應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各孔細(xì)胞周期G0/G1期、S期、G2/M期所占比例。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測SUP-B15細(xì)胞凋亡:轉(zhuǎn)染48h后收集2×105SUP-B15細(xì)胞,用預(yù)冷PBS沖洗。用200μL結(jié)合液重懸細(xì)胞后,加入5μL PI染色液和10μL Annexin V-FITC染色液,充分混勻,避光孵育15min,采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。采用Flowjo V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。

1.9Western blot檢測cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá):用預(yù)冷PBS沖洗SUP-B15,用400μL RIPA裂解液在冰上裂解30min,離心后收集上清液,BCA法測定蛋白濃度。隨后,用SDS-PAGE分離各組蛋白20μg,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下封閉2h,將膜與cleaved-caspase 8(1∶1000)、cleaved-PARP(1∶1000)、cleaved-caspase 3(1∶1000)、GAPDH抗體(1∶2000)在4 ℃孵育過夜,然后用TBST洗滌3次(5min/次)。加入二抗(1∶5000)在室溫下孵育1h,然后用TBST洗滌3次(5min/次)。最后,均勻滴加ECL,將蛋白條帶顯現(xiàn)。以GAPDH作為內(nèi)源性對照,采用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.10雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)circRNA_MYLK與miR-92a-3p的靶向關(guān)系:starBase預(yù)測結(jié)果顯示,circRNA_MYLK和miR-92a-3p之間存在互相作用的核苷酸位點(diǎn),將circRNA_MYLK與miR-92a-3p的互補(bǔ)序列與突變序列分別克隆至pmirGLO載體分別得到野生型載體WT-circRNA_MYLK、突變型載體MUT-circRNA_MYLK,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將WT-circRNA_MYLK、MUT-circRNA_MYLK與miR-92a-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染SUP-B15細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,檢測熒光素酶活性。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pcDNA、pcDNA-circRNA_MYLK、si-NC、si-circRNA_MYLK轉(zhuǎn)染至SUP-B15細(xì)胞,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞并采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-92a-3p表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1各組單個(gè)核細(xì)胞circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達(dá)比較:與對照組比較,研究組患者單個(gè)核細(xì)胞中circRNA_MYLK的表達(dá)量明顯升高(P<0.001),miR-92a-3p的表達(dá)量明顯降低(P<0.001),見表1。Pearson法分析急性淋巴細(xì)胞白血病患者單個(gè)核細(xì)胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達(dá)量的相關(guān)性,結(jié)果顯示,circRNA_MYLK與miR-92a-3p呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9682,圖1a)。分離得到的兩組受試者脊髓中的單個(gè)核細(xì)胞及購買的SUP-B15細(xì)胞形態(tài)見圖1b。與正常B淋巴細(xì)胞比較,人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系SUP-B15、NALM-6和BALL-1細(xì)胞中circRNA_MYLK的表達(dá)量升高(P<0.001),miR-92a-3p的表達(dá)量明顯降低(P<0.001),見表2。其中SUP-B15細(xì)胞中circRNA_MYLK的表達(dá)量明顯高于NALM-6和BALL-1細(xì)胞,而miR-92a-3p的表達(dá)量明顯低于NALM-6和BALL-1細(xì)胞,故選擇SUP-B15細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 單個(gè)核細(xì)胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達(dá)量

表1 急性淋巴細(xì)胞白血病患者單個(gè)核細(xì)胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p的表達(dá)量

表2 circRNA_MYLK和miR-92a-3p在不同細(xì)胞中的表達(dá)

2.2干擾circRNA_MYLK表達(dá)效果:與對照組和si-NC組比較,siRNA#1組和siRNA#2組細(xì)胞中circRNA_MYLK的表達(dá)量降低(P<0.001),其中siRNA#2組circRNA_MYLK的表達(dá)量最低,見表3。因此選擇siRNA#2用于干擾circRNA_MYLK表達(dá)。

表3 干擾circRNA_MYLK表達(dá)效果

2.3干擾circRNA_MYLK表達(dá)對SUP-B15細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響:與si-NC組比較,si-circRNA_MYLK組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例下降,G0/G1期細(xì)胞比例升高(P<0.001),G2/M期細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖2,表4。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期情況

表4 干擾circRNA_MYLK表達(dá)對SUP-B15細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

2.4干擾circRNA_MYLK表達(dá)對SUP-B15細(xì)胞凋亡的影響:與si-NC組比較,si-circRNA_MYLK組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平升高(P<0.001),見圖3,表5。

圖3 干擾circRNA_MYLK表達(dá)對SUP-B15細(xì)胞凋亡的影響

表5 各組SUP-B15細(xì)胞凋亡的比較

2.5CircRNA_MYLK靶向miR-92a-3p:circRNA_MYLK與miR-92a-3p的結(jié)合位點(diǎn)如圖4A所示。miR-92a-3p顯著抑制WT-circRNA_MYLK報(bào)告基因的熒光素酶活性(P<0.001),但未顯著改變MUT-circRNA_MYLK報(bào)告基因的熒光素酶活性(圖4B)。pcDNA-circRNA_MYLK組與pcDNA組比較,miR-92a-3p表達(dá)下降(P<0.001);si-circRNA_MYLK組與si-NC組比較,miR-92a-3p表達(dá)增高(P<0.001),見圖4C。

圖4 circRNA_MYLK與miR-92a-3p靶向關(guān)系驗(yàn)證

2.6MiR-92a-3p對SUP-B15細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響:與anti-miR-NC組比較,anti-miR-92a-3p組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例增高,G0/G1期細(xì)胞比例降低(P<0.001),凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平降低(P<0.001);與miR-NC組比較,miR-92a-3p組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例降低,G0/G1期細(xì)胞比例增高(P<0.001),凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平升高(P<0.05),見圖5,表6。

圖5 miR-92a-3p對SUP-B15細(xì)胞凋亡的影響

表6 miR-92a-3p表達(dá)對SUP-B15細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡的影響

2.7抑制miR-92a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾circRNA_MYLK表達(dá)對SUP-B15細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡的作用:與si-circRNA_MYLK+anti-miR-NC組比較,si-circRNA_MYLK+anti-miR-92a-3p組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例增高,G0/G1期細(xì)胞比例降低(P<0.001),凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平降低(P<0.001),見圖6,表7。

圖6 miR-92a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾對circRNA_MYLK表達(dá)的抑制對SUP-B15細(xì)胞凋亡的影響

表7 各組SUP-B15細(xì)胞增殖細(xì)胞周期和凋亡的比較

3 討 論

急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)率較高且患者5年生存率較低,circRNA可通過調(diào)控miRNA表達(dá)調(diào)節(jié)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生物學(xué)過程,并被認(rèn)為是治療急性淋巴細(xì)胞白血病的潛在靶點(diǎn)。作為一種促癌基因,circRNA_MYLK被報(bào)道可促進(jìn)多種癌細(xì)胞的進(jìn)展。例如circRNA_MYLK可通過miR-513a-5p/VEGFC信號傳導(dǎo)而促進(jìn)腎細(xì)胞癌生長和轉(zhuǎn)移[6]。circRNA_MYLK通過充當(dāng)miR-362-3p的海綿分子而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。circRNA_MYLK通過調(diào)節(jié)miR-195/cyclin D1表達(dá)而促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。circRNA_MYLK通過充當(dāng)miR-195-5p的海綿分子而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞糖酵解和增殖[7]。但目前尚不清楚circRNA_MYLK在急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)情況和可能的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,circRNA_MYLK在急性淋巴細(xì)胞白血病患者單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)量高于對照組,與circRNA_MYLK在癌細(xì)胞中的表達(dá)一致,提示,circRNA_MYLK高表達(dá)可能促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生及發(fā)展;干擾circRNA_MYLK表達(dá)可降低急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞存活率,G0/G1期細(xì)胞比例升高,S期細(xì)胞比例降低,提示,干擾circRNA_MYLK表達(dá)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而抑制急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖。caspase 8級聯(lián)反應(yīng)被激活后可促進(jìn)cleaved-PARP、cleaved-caspase 3表達(dá),誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[8,9]。本研究結(jié)果顯示,干擾circRNA_MYLK表達(dá)后急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平升高,提示,干擾circRNA_MYLK表達(dá)可促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果首次表明circRNA_MYLK在急性淋巴細(xì)胞白血病中起著癌癥促進(jìn)作用。

MiRNA在多種生物過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。miR-92a-3p在多種惡性腫瘤進(jìn)展中的功能目前存在爭議。例如,miR-92a-3p可抑制維爾姆斯氏瘤細(xì)胞的侵襲性進(jìn)展[10]。miR-92a-3p在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)。然而,miR-92a-3p在胃癌組織中表達(dá)增加,并加速胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[11]。本研究發(fā)現(xiàn),急性淋巴細(xì)胞白血病患者單個(gè)核細(xì)胞中miR-92a-3p的表達(dá)量降低,并抑制急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;表明miR-92a-3p在急性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)揮抑癌作用,可以作為潛在的治療靶點(diǎn)。本研究通過Pearson法分析急性淋巴細(xì)胞白血病患者單個(gè)核細(xì)胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達(dá)量的相關(guān)性,結(jié)果顯示,circRNA_MYLK與miR-92a-3p呈負(fù)相關(guān),提示二者可能存在靶向關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR分析證實(shí)circRNA_MYLK可靶向負(fù)調(diào)控miR-92a-3p的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circRNA_MYLK在急性淋巴細(xì)胞白血病中的作用機(jī)制,本研究在干擾circRNA_MYLK表達(dá)的同時(shí)下調(diào)miR-92a-3p表達(dá),結(jié)果顯示,抑制miR-92a-3p表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)干擾circRNA_MYLK表達(dá)對急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖及凋亡的作用。提示,circRNA_MYLK可能通過靶向miR-92a-3p促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病的進(jìn)展。

綜上所述,circRNA_MYLK在急性淋巴細(xì)胞白血病患者單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)量升高,而miR-92a-3p的表達(dá)量降低,二者呈負(fù)相關(guān)且存在靶向調(diào)控作用,干擾circRNA_MYLK表達(dá)可通過靶向上調(diào)miR-92a-3p表達(dá),促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖。本研究有望為急性淋巴細(xì)胞白血病患者提供新的治療靶點(diǎn)。但circRNA_MYLK序列上富含多個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn),circRNA_MYLK是否可通過靶向調(diào)節(jié)其他miRNA表達(dá)而發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步探究。