基于AMPK-ACC信號通路探究miR-543對肺癌細胞放療敏感性的機制研究

儲祥健, 曹海燕, 戴美云

(江蘇省如皋市人民醫(yī)院, 江蘇 如皋 226500)

肺癌是目前第二常見的癌癥,也是癌癥死亡的主要原因(占癌癥死亡總數(shù)的18.0%),2020年預計約有220萬例肺癌新發(fā)病例,180萬人因該疾病去世[1]。非小細胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma ,NSCLC)約占所有肺癌的80～85%,主要分為腺癌(LUAD,約40～50%的病例)和鱗癌(SqCC,約20～30%的病例)[2,3]。肺腺癌作為肺癌的主要亞型,約占所有肺癌患者的40%,盡管在早期診斷和治療方面取得了重大進展,但肺腺癌患者的5年相對生存率仍低于15%[4]。目前,放射治療是用于治療NSCLC的重要方式,它能夠提高腫瘤患者的生存率,但長期接受放射治療會使患者產(chǎn)生抗性,導致治療效果不理想[5]。因此,進一步了解影響NSCLC放療抗性的分子機制,開發(fā)新的NSCLC放射增敏靶點,對提高患者的治療效果至關(guān)重要。miRNAs在癌癥的多種生物和病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA會影響各種類型惡性腫瘤的放射治療抗性。例如,在胃癌中,miR-612與TRPM2-AS結(jié)合,以增加FOXM1的表達,增強胃癌的進展放射治療抵抗[7]。miR-219a-5p通過靶向CD164增強NSCLC細胞的放射敏感性。此外,miR-543被報道是腫瘤進展中的關(guān)鍵調(diào)控分子。miR-543被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌[8,9]中作為抑癌因子。Yu Q等證實miR-543通過靶向TWIST1抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲[10]。由于腫瘤存在異質(zhì)性,miR-543也被發(fā)現(xiàn)在肺癌、胃癌[11]中發(fā)揮促癌基因的作用。如LncRNA-LINC01089通過海綿化miR-543抑制肺腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡。綜上,表明miR-543與腫瘤進展之間存在密切關(guān)系。然而,尚未有關(guān)于miR-543調(diào)控NSCLC放療抗性性的研究報道。揭示了miR-543的表達與腫瘤放療抵抗有關(guān),進一步的細胞實驗發(fā)現(xiàn)沉默miR-543可以誘導G0/G1阻滯并增強NSCLC的放療敏感性。為miR-543p作為一種有前途的放療致敏靶點提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1生信分析:肺腺癌miRNA表達量數(shù)據(jù)(Normal:20,Tumor:512)從TCGA數(shù)據(jù)庫下載得到。‘edgeR’包用于差異分析(|logFC|>2,FDR<0.05),通過文獻引證確定研究的目標miRNA。

1.2細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染:人NSCLC細胞A549、PC-9、H1299,人正常肺上皮細胞BEAS-2B均購自于北納生物。在RPMI 1640培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific,USA)中添加10%胎牛血清用于培養(yǎng)上述所有細胞。細胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃,5%CO2。miR-543 inhibitor、 inhibitor-NC均購自于GenePharma(China)。在轉(zhuǎn)染前24h內(nèi),將處于對數(shù)生長期的A549細胞和PC-9細胞重新貼壁在完全培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。隨后用新鮮的無血清培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基。按照Liposome 2000(Life Technologies,USA)的指導方案進行轉(zhuǎn)染。AMPK/ACC通路抑制劑A-769662(compound C; 20μM)購自Selleck(China)。

1.3qRT-PCR:用于RNA提取和PCR分析的方法按照前人描述的方法進行[12],使用U6 snRNA作為內(nèi)參對細胞中的miRNA進行定量。qPCR檢驗使用StepOnePlus Real-Time PCR system (AB,USA)進行。qPR-PCR檢測的結(jié)果使用2-ΔΔCt法進行相對定量。PCR使用的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.4CCK-8:將細胞以5×103個細胞/孔接種于96孔板中。將細胞過夜孵育后,根據(jù)不同實驗需要處理細胞,然后到規(guī)定時間(處理結(jié)束的第0、1、2、3、4d后)按照CCK8試劑盒(China)制造商的說明進行操作,加入10μLCCK8試劑,然后在37℃培養(yǎng)箱中孵育30min,在450nm波長下測量吸光度。將不同劑量電離輻射(0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、16Gy)處理后的肺腺癌細胞(5×103個細胞/孔)接種到96孔板中,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,,在每個孔中加入10μL CCK8試劑,隨后將96孔板放置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min,室溫振蕩30s,使用酶標儀在450nm波長下測量各孔的吸光度。

1.5集落形成實驗:細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后,在6孔培養(yǎng)板各孔中接種1000個細胞。當培養(yǎng)皿中集落肉眼可見時,將細胞用4%多聚甲醛固定30min,并用0.2%結(jié)晶紫(Beyotime,China)染色以進行可視化和計數(shù)。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡:實驗重復三次。本文所用的一抗:兔抗AMPK/p-AMPK,ACC/p-ACC,β-actin;二抗:羊抗兔IgG (ab205718)均購自Abcam(British)。

1.7流式細胞術(shù):細胞在6孔板中培養(yǎng)一周后用胰蛋白酶分離細胞,隨后加以新鮮培養(yǎng)基中和?；旌衔镌?200r/min的條件下離心10min。離心下來的細胞用PBS洗滌兩次,重新懸浮于PBS(1mL)中,并在4℃下用9mL的70%乙醇固定24h。離心后,將每個細胞樣品重新懸浮在染色液中。染色液包括RNAse(2μL,Thermo Fisher Scientific,USA)、PI(20μL,Thermo Fisher Scientific,USA)、吐溫20(0.5μL)和PBS(477.5μL)。孵育30min后,通過流式細胞儀(Becton Dickinson,USA)對細胞進行分析。用不含EDTA的胰酶消化細胞后,300g,4℃離心5min收集細胞。計數(shù)5×105細胞,用預冷PBS洗滌細胞兩次,每次300g,4℃離心5min。吸棄PBS,加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞。加入5μL Annexin V-FITC和10μLPI Staining Solution,輕輕混勻,避光室溫反應10-15min。加入400μL 1×Binding Buffer,混勻后放置于冰上,樣品在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.8射線處理:將細胞胞暴露于一定劑量的輻射(0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、16Gy)下,使用直線加速器(Varian 2300EX,劑量率為2Gy/min;Varian,中國)。射線處理24h后,按照實際需要進行后續(xù)實驗。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計:實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。本研究使用GraphPad Prism8.0軟件(La Jolla,USA)進行統(tǒng)計分析。兩組比較采用Student’s t檢驗,兩組以上的差異采用單因素方差分析。本實驗所有數(shù)據(jù)均通過三次獨立實驗的多重復孔/視野計算所得。P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-543在NSCLC中高表達:通過生信分析發(fā)現(xiàn),在肺腺癌的腫瘤組織中miR-543的表達顯著上調(diào)(圖1A)。生存分析結(jié)果顯示,miR-543高表達的患者生存質(zhì)量較差(圖1B)。最后,在體外細胞模型中,進一步驗證,結(jié)果表明miR-543在NSCLC細胞系的表達顯著高于正常肺上皮細胞(圖1C)。其中在PC-9和A549細胞中表達相對較高,因此選擇這兩株細胞系用于后續(xù)的實驗檢測。綜上,表明miR-543在NSCLC中高表達。

圖1 miR-543在NSCLC中高表達

2.2沉默miR-543可以抑制NSCLC細胞的惡性表型:為探究miR-543對NSCLC細胞生物學功能的影響,將miR-543 inhibitor轉(zhuǎn)染到不同的NSCLC細胞中,下調(diào)內(nèi)源性miR-543的表達。qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-543 inhibitor的細胞miR-543表達水平顯著降低(圖2 A)。接著,CCK和集落形成實驗結(jié)果顯示,相較于對照組,miR-543 inhibitor顯著抑制了PC-9和A549細胞活力(圖2 B)和集落形成能力(圖2 C)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,沉默miR-543使G0/G1期細胞數(shù)量顯著升高,S期細胞數(shù)量顯著降低(圖2D),細胞凋亡率與對照組相比顯著升高(圖2 E)。綜上表明,miR-543在NSCLC中發(fā)揮促進癌癥惡性進展的作用。

圖2 沉默miR-543可以抑制NSCLC細胞的惡性表型

2.3miR-543通過AMPK/ACC信號通路影響NSCLC細胞增殖、細胞周期進程和細胞凋亡:此前已有諸多研究報道AMPK/ACC信號通路在腫瘤增殖和凋亡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[13]。因此,我們猜測miR-543可能通過AMPK/ACC信號通路影響NSCLC惡性進展。首先,我們研究了miR-543沉默表達后對AMPK/ACC信號通路的影響。結(jié)果顯示miR-543表達的降低明顯增強了NSCLC細胞中p-AMPK和p-ACC的表達,說明沉默miR-543促進了AMPK/ACC信號通路的活化(圖3A)。我們使用AMPK/ACC信號通路抑制劑compound C進行驗證,基于PC-9細胞構(gòu)建了以下細胞分組:inhibitor-NC+DMSO、miR-543 inhibitor+DMSO、miR-543 inhibitor+ compound C。CCK-8和集落形成實驗結(jié)果顯示miR-543 inhibitor顯著抑制了PC-9細胞活力和克隆形成能力;而進一步添加compound C處理可以減弱這種抑制作用(圖3B-C)。細胞周期和凋亡檢測結(jié)果顯示,沉默miR-543使 PC-9細胞中G0/G1期細胞數(shù)量顯著升高,S期細胞數(shù)量顯著降低,細胞凋亡率與對照組相比顯著升高;但進一步添加compound C處理可以逆轉(zhuǎn)miR-543 沉默表達對細胞周期進程和細胞凋亡的影響(圖3D-E)。綜上,這些結(jié)果表明miR-543通過阻斷AMPK/ACC信號通路促進NSCLC惡性進展。

圖3 miR-543通過AMPK/ACC信號通路影響NSCLC增殖、細胞周期進程和細胞凋亡

2.4miR-543通過AMPK/ACC信號通路增強NSCLC放療抗性:放射治療是用于治療NSCLC的重要方式,合理使用放療可以使肺癌患者的五年局部控制率增加8.3%,存活率增加4%[5],但長期放療容易使NSCLC患者產(chǎn)生抗性。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-543是NSCLC進展的促進因子,我們進一步通過實驗來驗證miR-543是否在NSCLC放療敏感性調(diào)節(jié)中發(fā)揮潛在作用。我們通過PC-9細胞系構(gòu)建了以下細胞分組:inhibitor-NC+DMSO、miR-543 inhibitor+DMSO、miR-543 inhibitor+ compound C。對每組細胞分別使用不同劑量輻射處理后。CCK8實驗結(jié)果顯示細胞的存活率均隨著輻射強度的增大而降低,其中miR-543 沉默表達使細胞活力顯著降低,在miR-543 沉默表達的同時添加compound C使得細胞活力恢復至接近正常水平,IC50統(tǒng)計結(jié)果與之相對應(圖4 A)。克隆形成實驗表明,miR-543 沉默表達后細胞集落的顯著減少,對輻射抵抗能力下降,而進一步添加compound C可以逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果(圖4 B)。這說明miR-543通過激活AMPK/ACC信號通路促進NSCLC細胞對產(chǎn)生放療抗性。

圖4 miR-543通過AMPK/ACC信號通路增強NSCLC放療抗性

3 討 論

放射抗性最近成為NSCLC治療的一個關(guān)鍵障礙[14]。迄今為止,許多研究提出了miRNA在NSCLC放射抗性發(fā)生中的作用。例如,新魚腥草素鈉介導的MiR-147a通過抑制STAT3增強NSCLC細胞的放射敏感性[15]。Yue Yuan等[16]證實miR-410通過激活PI3K/mTOR通路誘導NSCLC細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和放射抗性。此外,據(jù)報道,miR-125a-5p通過靶向SIRT7促進細胞凋亡以增加NSCLC細胞的放射敏感性[17]。因此,在NSCLC的抗輻射過程中識別更多的miRNA具有重要價值。

目前,某些研究表明miR-543在某些類型的癌癥中具有促癌作用。據(jù)報道,MiR-543通過Numb/p53調(diào)控軸促進前列腺癌癥細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和干細胞特性[18]。Zhai F等揭示miR-543通過靶向KLF4促進結(jié)直腸癌增殖和轉(zhuǎn)移[19]。此外,miR-543在肺癌中促癌作用也已被證實。在本研究中,我們的結(jié)果進一步證實了先前的報道,表明miR-543沉默表達抑制了NSCLC細胞的增殖,并誘導細胞凋亡。這些結(jié)果提示miR-543可能在促進NSCLC進展中發(fā)揮作用。

放射抵抗是一種復雜的細胞反應,涉及許多信號通路和基因。異?；罨亩喾N癌癥相關(guān)信號通路能夠參與影響癌癥放射治療的效果。Yulan Zeng等發(fā)現(xiàn)CDK5 通過 TAZ 激活 Hippo 信號通路促進肺癌細胞的放療抗性[20]。Shi Z等報道Let-7a 靶向 Rsf-1 通過 Ras-MAPK 通路增強NSCLC細胞的放療敏感性[21]。Xiong L等證實SIRT6通過PI3K/Akt/mTOR信號通路增強NSCLC細胞的放療敏感性,抑制腫瘤進展[22]。本研究通過不同手段檢測輻射對細胞增殖能力的影響情況,發(fā)現(xiàn)miR-543通過抑制AMPK/ACC信號通路增強NSCLC放療抗性。

先前研究報道,AMPK是細胞能量感知和代謝平衡恢復的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[23]。而ACC是AMPK的底物,為脂肪酸的生物合成提供丙二酰CoA底物,該底物通過磷酸化被關(guān)閉,并通過去磷酸化被激活。關(guān)于AMPK/ACC信號通路在腫瘤進展中的作用已被諸多報道,如CPI-613通過AMPK-ACC信號重建脂質(zhì)代謝以增強胰腺癌癥細胞凋亡[13]。Kun Li等證實TRPP2表達的沉默通過抑制PERK/eIF2α信號通路增加了頭頸癌細胞的增殖,而AMPK/ACC信號通路可能被反饋機制激活,以減少增強的細胞增殖。在本研究中,我們的結(jié)果顯示miR-543通過抑制AMPK/AC信號通路的活化促進NSCLC細胞增殖,并誘導細胞凋亡,這與先前的研究結(jié)果相一致。此外,已有不少研究證實激活的AMPK信號通路可以提高腫瘤細胞對放療的敏感性。如AICAR 激活 AMPK 可使前列腺癌細胞對放療敏感。在胰腺癌中,兒茶酚通過誘導 AMPK的磷酸化,同時降低 Hippo 信號通路成分的表達,增強胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性和放射敏感性。總之,本研究的觀察結(jié)果足以初步證明AMPK-ACC信號在NSCLC治療中的作用和重要性。

總之,本結(jié)果證實,miR-543在NSCLC細胞惡性進展和放療抗性的作用。此外,我們的研究首次揭示了miR-543可以通過AMPK/ACC信號通路增強NSCLC細胞放療抗性。但miR-543增強NSCLC放療抗性的機制是在細胞水平上分析的,尚未在體內(nèi)得到驗證在動物層面。同時,也缺乏對下游靶基因的探索,這也是本研究的不足之處。我們將在未來進一步挖掘miR-543調(diào)控NSCLC進展及抗性的相關(guān)分子作用機制?？傊?本課題發(fā)現(xiàn)為NSCLC的放療抵抗機制提供了新的見解,并為miR-543作為有希望的放療增敏靶點提供了理論基礎(chǔ)。