新加腎元湯對(duì)糖尿病腎病大鼠腎纖維化及Klotho/TGF-β1信號(hào)通路影響

陳 立,阮小風(fēng)

(1. 湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院,湖北 襄陽 441021;2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065)

隨著糖尿病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng),其主要并發(fā)癥糖尿病腎病已成為終末期腎病的首要病因之一[1]。目前尚無確切有效的治療方法能阻止糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病,而由此帶來的終末期腎病常需要血液凈化治療,致死致殘率高,給社會(huì)、家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn),新加腎元湯能降低慢性腎衰竭患者血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建糖尿病腎病模型,觀察新加腎元湯對(duì)模型大鼠腎纖維化及腎臟Klotho/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)信號(hào)通路的影響,旨在進(jìn)一步探討新加腎元湯治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠50只,體重(230±10)g,購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào):SCXK(鄂)2020-0018。大鼠飼養(yǎng)于湖北省食品藥品安全評(píng)價(jià)中心動(dòng)物房,溫度(25±1)℃,相對(duì)濕度(50±10)%。本研究通過襄陽市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批(2020-021)。

1.2藥品與試劑 新加腎元湯,由炙黃芪(批號(hào):2008001S)30 g、淫羊藿(批號(hào):2006001S)20 g、三七粉(批號(hào):2006005S)3 g、酒大黃10 g(批號(hào):2011001S)組成,各味藥由襄陽市中心醫(yī)院中藥房提供;厄貝沙坦,瀚輝制藥有限公司,批號(hào):20097211。 一抗Klotho( Santa公司,批號(hào):sc-515942),一抗Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)、纖連蛋白(Fibronectin)、GAPDH(Abcam公司,批號(hào)分別為ab6586、ab268020、ab181602),一抗TGF-β1(武漢三鷹公司,批號(hào):21898-1-AP),一抗層黏連蛋白(LN,Novusbio公司,批號(hào):NB300-144),多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):80096618),蘇木素(Sigma公司,H9627-25G),SCr和BUN檢測(cè)試劑盒(南京建成公司,批號(hào)分別為C013-2、C011-2),RIPA總蛋白裂解液(ASPEN公司,AS1004),ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(ASPEN公司,AS1059),顯影定影液(ASPEN公司,AS1027)。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(Diatek公司,型號(hào):DR-200Bs),冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器,型號(hào):TGL-16),倒置白光/熒光拍照顯微鏡(OLYMPUS公司,型號(hào):IX51),電泳儀(北京市六一儀器廠,型號(hào):DYY-6C),掃描儀(Canon公司,型號(hào):LiDE110)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組、模型組、新加腎元湯正常劑量組、新加腎元湯高劑量組、厄貝沙坦組,每組10只?？瞻捉M予以普通飼料喂養(yǎng),同時(shí)檸檬酸緩沖液進(jìn)行腹腔注射。模型組及各藥物組大鼠均予以高脂飼料(碳水化合物∶脂肪∶蛋白質(zhì)為5∶3∶2)喂養(yǎng),同時(shí)予以鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射,首次60 mg/kg,隔周減半,連續(xù)造模12周[3]。首次注射STZ 3 d后檢測(cè)各組大鼠空腹血糖(FPG),FPG>16.7 mmol/L代表糖尿病模型構(gòu)建成功。1周后檢測(cè)24 h尿量及尿蛋白,兩者均大于造模前50%代表糖尿病腎病模型構(gòu)建成功。造模同時(shí)各藥物組給予相應(yīng)藥物干預(yù),按臨床用藥劑量經(jīng)動(dòng)物與人體間的等效劑量換算公式計(jì)算灌胃劑量和容量[4],新加腎元湯正常劑量組給予新加腎元湯3 mg/(kg·d)灌胃,新加腎元湯高劑量組給予新加腎元湯6 mg/(kg·d)灌胃,厄貝沙坦組給予厄貝沙坦片混懸液5 mg/(kg·d)灌胃,空白組及模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃12周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1腎功能指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后,腹腔麻醉大鼠,摘眼球取血,離心吸取上清液,置于-80 ℃冰箱中保存,采用生化儀檢測(cè)SCr和BUN水平。

1.5.2腎臟HE染色病理形態(tài) 取血后脫頸處死大鼠,摘取雙側(cè)腎臟,右腎于4%多聚甲醛中固定過夜后,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟浸透包埋,切片,脫蠟,乙醇水化,蘇木素浸泡,自來水沖洗,1%鹽水乙醇分化,自來水沖洗,返藍(lán)后鏡下觀察,1%伊紅浸泡,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,鏡下觀察腎臟形態(tài)。

1.5.3腎組織中Klotho、TGF-β1、Collagen Ⅳ、LN及Fibronectin表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取-80 ℃保存的左腎組織,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度以40 μg/孔上樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用電轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉液室溫下封閉1 h,4 ℃孵育過夜,加入第二抗體室溫孵育1 h,充分洗滌后,用電化學(xué)發(fā)光試劑盒處理PVDF膜并在暗室顯影。以各樣品目的蛋白的光密度值與GADPH的比值計(jì)算各條帶的相對(duì)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清SCr、BUN水平比較 模型組大鼠血清SCr、BUN水平均明顯高于空白組(P均<0.05);新加腎元湯高劑量組和厄貝沙坦組血清SCr、BUN水平均明顯低于模型組(P均<0.05),新加腎元湯正常劑量組血清SCr、BUN水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和糖尿病腎病各組大鼠血清SCr、BUN水平比較

2.2各組大鼠腎臟HE染色表現(xiàn) 空白組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯異常;模型組大鼠系膜基質(zhì)增寬、增多,基底膜彌漫增厚;與模型組比較,各藥物組大鼠以上病理改變均較輕。見圖1。

圖1 空白組和糖尿病腎病各組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.3各組大鼠腎組織中Klotho、TGF-β1、Collagen Ⅳ、LN、Fibronectin蛋白表達(dá)情況比較 與空白組比較,模型組大鼠腎組織中Klotho蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05),TGF-β1、Collagen Ⅳ、LN、Fibronectin蛋白表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05 );與模型組比較,各藥物組大鼠腎組織中Klotho蛋白表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),TGF-β1、Collagen Ⅳ、LN、Fibronectin蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05 );新加腎元湯高劑量組和厄貝沙坦組上述各項(xiàng)指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于新加腎元湯正常劑量組(P均<0.05)。見圖2。

A為空白組;B為模型組;C為新加腎元湯正常劑量組;D為新加腎元湯高劑量組;E為厄貝沙坦組

3 討 論

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治療難度大,目前尚無特效藥。新加腎元湯由4味中藥組成,方中君藥炙黃芪補(bǔ)氣升陽、利水消腫,臣藥淫羊藿溫補(bǔ)脾腎、三七活血化瘀,佐使藥酒大黃通腑泄?jié)?諸藥合用共奏溫補(bǔ)脾腎、通腑泄?jié)嶂?用于治療糖尿病腎病具有整體調(diào)節(jié)、標(biāo)本兼顧、安全、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。

Klotho是一種跨膜全長(zhǎng)蛋白,也是一種主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)的抗衰老蛋白[5],刺激Klotho可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),改善線粒體功能,保護(hù)腎臟[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),Klotho表達(dá)降低與慢性炎癥細(xì)胞浸潤、腎內(nèi)小動(dòng)脈硬化、間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮等有關(guān)[8-9],可看作微觀上的“腎精虧虛”。

TGF-β1是肥胖和胰島素抵抗的關(guān)鍵細(xì)胞因子,也是最強(qiáng)大的纖維化細(xì)胞因子之一,可以刺激細(xì)胞外基質(zhì)積累(包括膠原蛋白、LN和Fibronectin)和纖維化效應(yīng)[10-13],可通過經(jīng)典的Smad信號(hào)通路及非Smad依賴的信號(hào)通路發(fā)揮促纖維化的作用,在糖尿病腎病腎纖維化中扮演著重要的角色[14]。國內(nèi)的一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病患者血清TGF-β1顯著上調(diào),并且血清TGF-β1確實(shí)是糖尿病腎病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[15]。因此,從微觀層次上講,TGF-β1在糖尿病腎病中主要充當(dāng)“實(shí)邪”的角色。

關(guān)于Klotho和TGF-β1的關(guān)系,國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制抑制Klotho的表達(dá),從而導(dǎo)致腎纖維化的進(jìn)展,TGF-β1通過抑制miR-152和miR-30a誘導(dǎo)DNMT1和DNMT3a的異常表達(dá),隨后導(dǎo)致Klotho啟動(dòng)子超甲基化和Klotho蛋白抑制[16]。Klotho水平降低可增強(qiáng)TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo),提示Klotho可通過調(diào)節(jié)TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)與腎纖維化有關(guān)[17]。而外源性Klotho補(bǔ)充劑可通過調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的內(nèi)皮素來減輕腎纖維化,因此外源性Klotho減輕腎纖維化可能與抑制TGF-β1介導(dǎo)的腎內(nèi)膜相關(guān)[18]。 基于Klotho與TGF-β1的拮抗關(guān)系,聯(lián)系到糖尿病腎病的基本病機(jī),推測(cè)在糖尿病腎病的進(jìn)展過程中,Klotho降低,TGF-β1升高,即腎精逐漸虛損,實(shí)邪日益盈長(zhǎng),導(dǎo)致“正虛邪實(shí)”,正虛日久不足以御邪,繼之表現(xiàn)為脾腎陽虛、濁瘀內(nèi)蘊(yùn)等病理變化。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)新加腎元湯可降低糖尿病腎病大鼠SCr和BUN水平,促使增寬、增多的系膜基質(zhì)和彌漫增厚的基底膜逐漸恢復(fù)趨于正常;且可上調(diào)Klotho蛋白表達(dá)(補(bǔ)益腎精),下調(diào)TGF-β1(祛除實(shí)邪)、Collagen Ⅳ、LN、Fibronectin蛋白表達(dá)。表明新加腎元湯可通過調(diào)控Klotho、TGF-β1蛋白表達(dá),改善糖尿病腎病大鼠腎臟功能及腎臟病理組織損傷,延緩糖尿病腎病腎纖維化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)為糖尿病腎病“本虛標(biāo)實(shí)”的病機(jī)提供了分子層面的物質(zhì)基礎(chǔ),也為新加腎元湯臨床治療糖尿病腎病提供了重要的理論支撐。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。