85525例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測發(fā)現(xiàn)罕見常染色體三體結(jié)果分析

張苗苗 方玉琴 李景然 王朝紅 孫玉秀 朱健生

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院（合肥 230000）

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）自問世以來，以分析孕婦外周血中的胎兒游離DNA（cell-free foetal DNA，cffDNA）為基礎(chǔ)，在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域迅速推廣［1］。由于NIPT 方法的全基因組性質(zhì)，已經(jīng)擴(kuò)大了篩查范圍，不可避免地會(huì)發(fā)現(xiàn)罕見常染色體三體（rare autosomal trisomies，RATs），定義為21、18 或13 號(hào)染色體以外的常染色體三體，但是對于RATs 的研究較少，其應(yīng)用價(jià)值尚存爭議，還需要更多的驗(yàn)證證據(jù)［2-3］。其次，RATs 并不罕見，在產(chǎn)科人群中檢測到RATs 的頻率為0.18%左右，NIPT 對RATs 的陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）較低（4%～6%）［4］，假陽性高的主要原因?yàn)橄拗菩蕴ケP嵌合（confined placental mosaicism，CPM）的存在，導(dǎo)致RATs 高風(fēng)險(xiǎn)通常與胎兒-胎盤疾病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［5］，但是，關(guān)于RATs 的發(fā)病率和妊娠結(jié)局的報(bào)道仍然有限，出于這個(gè)原因，這種意外的發(fā)現(xiàn)通常會(huì)使遺傳咨詢變得困難，了解RATs 臨床意義的必要性已經(jīng)變得迫切。因此，本研究納入了目前國內(nèi)最大的樣本量，旨在探討NIPT 在篩查RATs 的準(zhǔn)確性以及RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦是否會(huì)發(fā)生不良妊娠結(jié)局，首次對RATs 進(jìn)行各條染色體的詳細(xì)分析，評(píng)估不同染色體之間存在的差異，以期幫助改善妊娠管理。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2018年1月1日至2022年6月1 日在安徽省婦幼保健院接受NIPT 的85 525 例孕婦（年齡：18～35 歲），納入標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）孕周12+0～26+5；（2）單胎妊娠；（3）孕婦血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)值（1/1 000 ≤T21＜1/270，1/1 000 ≤T18＜1/350），孕婦血清學(xué)篩查高危值（T21 ≥1/270，T18 ≥1/350）；（4）B 超提示胎兒單項(xiàng)軟指標(biāo)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）胎齡＜12 周；（2）雙胎或者多胎妊娠；（3）B 超顯示胎兒結(jié)構(gòu)畸形；（4）配偶其中一方明確染色體異常；（5）1年以內(nèi)接受過異體輸血、干細(xì)胞治療、移植手術(shù)或免疫治療的孕婦；（6）患有惡性腫瘤的孕婦；（7）因嚴(yán)重溶血、凝血、游離DNA 含量低等原因復(fù)檢不合格的樣本。本研究得到了安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者在檢測前進(jìn)行臨床遺傳學(xué)家的咨詢，并在采血前簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 NIPT 檢測NIPT 使用無菌EDTA 抗凝管采集每位孕婦外周血5 mL，在安徽省婦幼保健院遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行兩步離心法，分離血漿，使用QIAAMP 循環(huán)核酸試劑盒（QIAGEN）磁珠吸附提取法提取DNA，隨后用末端修復(fù)酶進(jìn)行末端修復(fù)，標(biāo)記接頭并用連接酶連接接頭，最后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將DNA 擴(kuò)增到所需的濃度完成文庫構(gòu)建；利用NextSeqCN500 測序儀進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，并與人類基因組參考序列圖進(jìn)行比較，NIPT 結(jié)果以Z 值風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分表示：評(píng)分≥3或≤-3 被認(rèn)為是高風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)分-3～3 被認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 侵入性產(chǎn)前診斷

1.2.2.1 染色體核型分析在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊水穿刺術(shù)，抽取20～30 mL 羊水，進(jìn)行接種、培養(yǎng)、G 顯帶，使用GSL-120 型自動(dòng)核型掃描儀進(jìn)行核型掃描。根據(jù)《國際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)，ISCN2020》指南進(jìn)行核型描述。

1.2.2.2 染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）同上采集羊水細(xì)胞后，進(jìn)行離心沉淀，提取DNA，根據(jù)AffymetrixCytoScan 750K 芯片操作規(guī)程，進(jìn)行SNP 芯片檢測，收集數(shù)據(jù)，參考公共數(shù)據(jù)庫（Clingen、Decpher、ClinVar、OMIM、DGV、ISCA、NCBI、UCSC）中的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析。

1.2.3 隨訪所有孕婦均通過電話或電子病歷系統(tǒng)進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容包括分娩記錄、實(shí)驗(yàn)室篩查、胎兒超聲檢查、細(xì)胞遺傳學(xué)測試和新生兒體檢報(bào)告。結(jié)果衡量標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)出生孕周，新生兒分為足月兒（≥37 周）、早產(chǎn)兒（preterm birth，PTB）（32～37 周）和極早產(chǎn)兒（＜32 周）；胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)新生兒出生體重低于同孕齡正常體重的第10 百分位數(shù)［5-6］。

2 結(jié)果

2.1 RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的NIPT 結(jié)果85 525 例孕婦中篩查出182 例RATs 高風(fēng)險(xiǎn)，頻率為0.21%（182/85 525），按降序排列，T7（7 號(hào)染色體三體）、T8、T16和T20 較常見（≥15 例）；T10、T9、T3、T2、T11、T15、和T22 中等頻率（5～15 例）；T14、T17、T1、T5、T6和T12 相對少見（＜5 例）；未檢測出T4 和T19。見圖1。

圖1 NIPT 檢出RATs 在不同染色體上的分布Fig.1 The distribution of RATs on different chromosomes by NIPT

2.2 RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)前診斷結(jié)果182 例孕婦經(jīng)過詳細(xì)的遺傳咨詢，46 例拒絕侵入性產(chǎn)前診斷，其余136 例進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，行羊水核型分析或CMA 檢測，檢測出7 例真陽性（PPV：5.15%），分別為兩例T2、1 例T9、1 例T7、1 例T15 和2 例T16。PPV 分別為50.0%（2/4）、3.13%（1/32）、12.5%（1/8）、33.3%（1/3）和12.5%（2/16），其他染色體的PPV 均為0.00%，總PPV 為5.15%。見表1。

表1 孕婦行NIPT 及侵入性產(chǎn)前診斷的結(jié)果Tab.1 Results of NIPT and invasive prenatal diagnosis in pregnant women 例

行CMA 檢測的孕婦中發(fā)現(xiàn)了5 例雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），1 例LOH（6），CMA 結(jié)果為6p25.3p22.3 區(qū)域15.57 Mb 及6q24.3q27 區(qū)域22.15 Mb 雜合性缺失，進(jìn)一步家系驗(yàn)證為母源性單親二倍體（uniparentaldisomy，UPD）；1 例LOH（10），CMA 結(jié)果為10 號(hào)染色體雜合性缺失；2 例LOH（16），CMA 結(jié)果分別為16q21q24.3 區(qū)域24.45 Mb和16p13.3 區(qū)域5.91 Mb 雜合性缺失；1 例LOH（20），芯片結(jié)果為20P12.3P11.1 區(qū)域20.91 Mb 及20q11.21q13.33 區(qū)域29.06 Mb 雜合性缺失，進(jìn)一步家系驗(yàn)證，結(jié)果為父源性UPD。

2.3 RATs 高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的妊娠結(jié)局在182 例RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中獲得121 例詳細(xì)隨訪信息，在不考慮單個(gè)染色體的情況下，121 例孕婦中有46 例（38.02%）發(fā)生不良妊娠，主要表現(xiàn)在FGR 和PTB，發(fā)生率分別為25.62%（31/121）和20.66%（25/121），明顯高于以往報(bào)道（6.39%和7.1%）［6-7］。值得關(guān)注的是，我們發(fā)現(xiàn)不良妊娠的發(fā)生率在不同染色體之間存在差異，例如在1、2、3、6、15、16、22 號(hào)染色體上較高（≥50%），而5、14、17 號(hào)染色體沒有發(fā)生。其次，16 號(hào)染色體的病例數(shù)較多且不良妊娠特征較為明顯，發(fā)生率高達(dá)89.5%（17/19），19例孕婦中9 例（47.4%）出現(xiàn)早產(chǎn)，12 例（63.2%）出現(xiàn)FGR，見表2、3。

表2 121 例RATs 高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的妊娠結(jié)局Tab.2 Pregnancy outcomes of 121 pregnant women at high risk of RATs 例

表3 孕婦的妊娠結(jié)局在不同染色體上的分布Tab.3 Distribution of pregnant women＇s pregnancy outcomes on different chromosomes 例

3 討論

與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比，NIPT 以其無創(chuàng)性、高準(zhǔn)確性和妊娠范圍廣等優(yōu)勢快速成為一種常見的產(chǎn)前篩查方式［8］，對21、18 和13 號(hào)染色體非整倍體的篩查具有較高的敏感性和特異性［9-10］，然而針對RATs 的數(shù)據(jù)量很少，臨床處理需要更多的數(shù)據(jù)支持。VAN 等［11］發(fā)現(xiàn)RATs 作為一個(gè)群體比T13 更常見，幾乎和T18 一樣常見，但是NIPT 檢測RATs 的準(zhǔn)確性以及RATs 高風(fēng)險(xiǎn)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性具有不明確性［12］，孕婦需要在侵入性產(chǎn)前診斷的已知風(fēng)險(xiǎn)和妊娠結(jié)局的未知影響之間進(jìn)行權(quán)衡，導(dǎo)致遺傳咨詢充滿挑戰(zhàn)。因此，我們對此類數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，有助于改善妊娠管理。

本研究發(fā)現(xiàn)，NIPT 樣本中RATs 的頻率為0.21%，最常見是T7、T8、T16 和T20，這與BENNP等［13］的觀察相似，PPV 分別為3.13%、0.00%、12.5%和0.00%，總PPV 僅為5.15%。PPV 較低的原因：（1）染色體異常僅發(fā)生在胎盤而不發(fā)生在胎兒，稱為CPM［14］。在細(xì)胞發(fā)育過程中，由于有絲分裂或者減數(shù)分裂發(fā)生錯(cuò)誤導(dǎo)致合子形成染色體三體，這在懷孕早期是致命的，只有合子發(fā)生“三體挽救”形成CPM，大部分胎兒才能繼續(xù)存活［15-16］。QI 等［17-18］發(fā)現(xiàn)，T7、T8 病例伴隨正常的羊膜腔穿刺術(shù)幾乎可以肯定地解釋為CPM。（2）合子發(fā)生三體挽救時(shí)，3 條染色體中的每一條都有同樣的丟失機(jī)會(huì)，如果剩下的兩條染色體來自同一個(gè)親本，就會(huì)產(chǎn)生UPD，UPD 不涉及染色體劑量的增加，NIPT 很難檢測到，但是6、7、11、14、15 或20 號(hào)染色體上的印記基因會(huì)產(chǎn)生不良臨床后果［19-20］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)了2 例UPD，1 例母源性UPD（6），尚無明確印跡疾病，孕婦選擇繼續(xù)妊娠；1 例父源性UPD（20），與假性甲狀旁腺功能減退癥相關(guān)［21］，孕婦選擇引產(chǎn)。UPD 的檢出率分別為50%（1/2）和9.09%（1/11），見表4。由此可見，NIPT 檢測到的RATs 很可能是假陽性的，但是RATs 高風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致患UPD 的風(fēng)險(xiǎn)增加，盡管沒有超聲異常，印跡基因的不利影響仍存在。因此，NIPT 提示6、7、11、14、15 或20 號(hào)染色體三體時(shí)，建議孕婦進(jìn)行侵入性檢測，另一方面，如果不涉及印跡基因，應(yīng)該謹(jǐn)慎使用侵入性手術(shù)，但考慮到TFM 的存在需要增強(qiáng)超聲隨訪。

表4 羊水細(xì)胞中UPD 的檢出率及臨床表現(xiàn)Tab.4 Detection rate of UPD in amniotic fluid cells and clinical manifestation 例

其次，NIPT 檢測的cffDNA 來源于絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞，在產(chǎn)前階段，“胎兒游離DNA”被稱為“胎盤游離DNA”或許更加準(zhǔn)確［22］，cffDNA 作為一種新的生物標(biāo)志物，可以預(yù)測胎盤的健康與疾病，RATs 高風(fēng)險(xiǎn)可能與胎兒宮內(nèi)死亡、FGR 和胎兒畸形等妊娠結(jié)局相關(guān)［13，23］。在本研究中，121 例RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中有46 例（38.02%）發(fā)生不良妊娠，但是，大部分孕婦獲得了活產(chǎn)（95.87%），不良妊娠主要體現(xiàn)在FGR（25.62%）和PTB（20.66%）。此外，在后續(xù)的妊娠管理中對于不同的染色體很可能不同，1、2、3、6、15、16 和22 號(hào)染色體的不良妊娠發(fā)生率較高（＞50%），尤其是16 號(hào)染色體FGR 和PTB 顯著高于總體組。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是：NIPT 篩查發(fā)現(xiàn)的RATs 通常局限于胎盤，根據(jù)受累組織的分布，CPM 分為CPM 1、2、3 型。由于cffDNA 來源于滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此，只有CPM 1和3 型可以被NIPT 識(shí)別。CPM 1 型主要導(dǎo)致自然流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)死亡，CPM 3 型容易引起FGR、PTB 等不良結(jié)局。15 和16 號(hào)染色體主要在CPM 3 型中檢測到，因此出現(xiàn)了圍產(chǎn)期高比例的不良妊娠結(jié)局，對于與RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦妊娠期間的管理應(yīng)基于具體染色體［4，15，24-25］。由此可見，對于NIPT 篩查RATs 高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，盡管大部分獲得了活產(chǎn)，核型和CMA 結(jié)果也可能正常，但是患FGR 和PTB 的風(fēng)險(xiǎn)增加，需要進(jìn)行連續(xù)地超聲檢查以監(jiān)測胎兒的生長發(fā)育。

我們將85 525 例數(shù)據(jù)匯集在一起，以確定在RATs 中哪些染色體最常見，并回顧了妊娠結(jié)局，評(píng)估了受累染色體、真陽性和UPD 的存在。本研究的優(yōu)勢：（1）數(shù)據(jù)量較大，分析了RATs 在各條染色體上的差異。我們發(fā)現(xiàn)不同染色體對妊娠管理的好處是不同的，比如16 號(hào)染色體和涉及印記基因的染色體。（2）獲得了較完整的產(chǎn)婦信息包括新生兒的發(fā)育情況，以便分析RATs 與妊娠結(jié)局的相關(guān)性，目前國內(nèi)的文章因缺乏后續(xù)的隨訪或者樣本量較少而沒有這方面的研究，導(dǎo)致過度診斷，眾所周知，羊水穿刺術(shù)是存在流產(chǎn)和感染的風(fēng)險(xiǎn)，我們探討了是否需要進(jìn)行這項(xiàng)檢查，幫助緩解孕婦的焦慮。本研究的局限：（1）無法獲得胎盤的遺傳學(xué)檢測。（2）個(gè)別染色體的病例數(shù)仍然較少，可能無法得出關(guān)于異常風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)論，但是通過數(shù)據(jù)的不斷積累有助于之后的研究。

綜上所述，NIPT 篩查RATs 的PPV 較低，應(yīng)謹(jǐn)慎使用侵入性檢測，但是如果涉及印跡基因，則建議進(jìn)行侵入性手術(shù)。另一方面，RATs 高風(fēng)險(xiǎn)具有重要的臨床意義，它提示孕婦患FGR 和PTB 的風(fēng)險(xiǎn)增加，尤其是16 號(hào)染色體，需要增強(qiáng)超聲檢查以監(jiān)測胎兒的生長發(fā)育。