乳腺癌類器官疾病模型的構(gòu)建及其對(duì)化療藥物的敏感性試驗(yàn)

吳銘 初新宇 付陽(yáng) 王雪薇 王歡 肖洋 陳棟 何勁松

1安徽醫(yī)科大學(xué)北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨床學(xué)院（廣東深圳 518036）；2安徽醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院（合肥 230000）；3北京大學(xué)深圳醫(yī)院乳腺甲狀腺外科（廣東深圳 518036）

乳腺癌（breast cancer，BC）是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2019 年發(fā)布的數(shù)據(jù)，乳腺癌占女性新診斷惡性腫瘤的30%，并導(dǎo)致15%的女性死于乳腺癌［1］。目前乳腺癌的治療方法主要包括手術(shù)治療，常規(guī)放化療，內(nèi)分泌治療，以及人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達(dá)時(shí)使用的靶向治療。近年來(lái)，乳腺癌靶向治療取得了較大進(jìn)步，但大部分乳腺癌仍缺乏針對(duì)性治療靶點(diǎn)，影響臨床療效［2］。雖然乳腺癌已經(jīng)被廣泛研究，但我們?nèi)匀黄惹行枰环N新的臨床前疾病研究模型來(lái)指導(dǎo)患者的個(gè)性化治療。

傳統(tǒng)二維（two-dimensional，2D）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤異種移植動(dòng)物模型（patient-derived xenografts，PDX）作為臨床前研究模型被廣泛使用。然而2D 培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞無(wú)法還原患者體內(nèi)腫瘤的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和病理特征，PDX 模型構(gòu)建效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴、存在種屬差異，不適合高通量藥物篩選［3］。近年來(lái)，腫瘤類器官技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，為我們提供了新型的臨床前研究模型。類器官是在體外對(duì)干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化形成的在結(jié)構(gòu)和功能上類似目標(biāo)器官或組織的三維細(xì)胞復(fù)合體，其具有穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征，能夠在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。患者衍生的癌癥類有機(jī)物允許癌細(xì)胞在三維基質(zhì)中生長(zhǎng)，并以及時(shí)且具有成本效益的方式從患者體內(nèi)培養(yǎng)癌癥細(xì)胞的能力取得了重大進(jìn)展［4-7］，不僅概括了原始腫瘤的組織學(xué)和遺傳特征，還允許高通量藥物篩選，并可能促進(jìn)個(gè)性化治療［8］。目前，肺癌［9］、肝癌［10］、胰腺癌［11］、膀胱癌［12］、胃癌［13］、子宮內(nèi)膜癌［14］及鼻咽癌［15］等多種腫瘤類器官模型已成功建立，乳腺癌類器官也已成為一種有用的臨床前模型，本研究擬建立不同分子分型的乳腺癌類器官模型，并進(jìn)行化療藥物篩選，為乳腺癌基礎(chǔ)研究與臨床個(gè)性化治療提供新型的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 乳腺癌組織本研究于2021 年7-12 月采集北京大學(xué)深圳醫(yī)院收治的4 例乳腺癌患者新鮮腫瘤組織標(biāo)本，其中2 例組織學(xué)分型為HER2（+）型乳腺癌，1 例為三陰性乳腺癌（TNBC），1 例為激素受體陽(yáng)性型（LuminalB）乳腺癌。獲取的新鮮腫瘤組織將分成幾部分，分別進(jìn)行類器官培養(yǎng)與病理石蠟切片形態(tài)學(xué)染色。本研究已獲得北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)［北大深醫(yī)倫審（研）［2019］第（062）號(hào)］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑主要包括：AdvancedDMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），Ⅱ型膠原酶（Gibco，美國(guó)），Matrigel（Corning，美國(guó)），Ki67、ER、PR、HER2 免疫組化抗體（Abcam，英國(guó)），濃縮型DAB 試劑盒（MXB，中國(guó)），抗菌劑（Gibco，美國(guó)），HEPES（Gibco，美國(guó)），GlutaMAX（Gibco，美國(guó)），TrypLEExpress（Gibco，美國(guó)），Y-27632 二鹽酸鹽（AbmoleBioscience，美國(guó)），CellTiter-Glo?3DReagent（Promega，美國(guó)），細(xì)胞回收液（康寧，美國(guó)），維生素?zé)燉０罚⊿igmaAldrich，美國(guó)），抑制劑Noggin（Peprotech，美國(guó)），表皮生長(zhǎng)因子（EGF），成纖維細(xì)胞增長(zhǎng)因子10（FGF-10，Peprotech，美國(guó)），激活素受體樣激酶（ALK）抑制劑A83-01（SigmaAldrich，美國(guó)），p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑SB202190（SigmaAldrich，美國(guó)）。

1.3 設(shè)備主要包括：二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛，美國(guó)），生物安全柜（ESCO，美國(guó)），水浴鍋，高壓滅菌鍋，石蠟切片機(jī)（Leica，德國(guó)），全自動(dòng)脫水機(jī)（Epredia，美國(guó)），石蠟包埋機(jī)（賽默飛，美國(guó)），病理組織漂烘儀（郝思琳，中國(guó)），正置顯微鏡（ZEISS，德國(guó)），低速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）。

1.4 方法

1.4.1 乳腺癌類器官培養(yǎng)基的配制AdDMEM/F12+++培養(yǎng)基中加有維生素?zé)燉０罚?0 mmol/L），抑制劑Noggin（100 ng/mL），EGF（50 ng/mL），F(xiàn)GF-10（10 ng/mL），A83-01（500 nmol/L），SB202190（10 μmol/L），Y-27632（10 μmol/L），Wnt-3A 以及Matrigel 膠。

1.4.2 乳腺癌類器官的培養(yǎng)將新鮮標(biāo)本冰上運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室立即處理。使用PBS 清洗標(biāo)本3～5 次，部分組織固定在甲醛中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余組織用來(lái)建立類器官模型。在超凈臺(tái)內(nèi)用眼科剪將乳腺癌組織剪碎，使用Ⅱ型膠原酶，在37 ℃水浴鍋中消化40～60 min 后使用含10% FBS 的AdDMEM/F12+++培養(yǎng)基終止，離心棄上清，洗滌一次后使用70 μm 的細(xì)胞篩過(guò)濾以去除未消化的組織塊，將得到的細(xì)胞懸浮液離心后棄上清，再用移液槍吸取預(yù)冷的Matrigel 膠混合細(xì)胞懸液，以45 μL每個(gè)膠滴接種于37 ℃預(yù)熱的6 孔板中，每孔6 膠滴，置于培養(yǎng)箱20 min 使基質(zhì)凝膠聚合后，每孔加入2.5 mL 乳腺癌類器官培養(yǎng)基，放至37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下觀察類器官的形成和生長(zhǎng)狀態(tài)。每2～3 天換液，視類器官生長(zhǎng)速度每1～3 周以1∶2～1∶4 的稀釋度進(jìn)行傳代。

1.4.3 乳腺癌組織及類器官石蠟切片的制備新鮮的乳腺癌組織置于10%中性甲醛中固定24 h。收集乳腺癌類器官，棄去培養(yǎng)基，向每孔中加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的細(xì)胞回收液解聚基質(zhì)凝膠，收集每個(gè)孔的類器官離心棄上清，加200 μL 液態(tài)的瓊脂糖凝膠，將類器官沉淀從底部吹起，待瓊脂糖凝膠凝固后，置于10%中性甲醛中固定12 h。乳腺癌組織及類器官固定結(jié)束后，按照常規(guī)程序進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片（4 μm）。

1.4.4 HE 及免疫組織化學(xué)染色HE 染色：石蠟切片脫蠟至水后，蘇木素染細(xì)胞核，伊紅溶液染細(xì)胞質(zhì)，脫水透明后中性樹脂封片，干燥后使用正置顯微鏡進(jìn)行拍攝。

免疫組化染色：石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水、過(guò)氧化氫酶阻斷、抗原修復(fù)及血清封閉，將Ki-67、ER、PR和HER-2 抗體按照1∶300 濃度稀釋后，于4 ℃下孵育切片過(guò)夜。次日，用PBS 沖洗3 遍后按照濃縮型DAB 試劑盒說(shuō)明書操作步驟染色，然后使用蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片干燥后使用正置顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.4.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前將CellTiter-Glo?3D 檢測(cè)置于室溫平衡30 min，輕微翻轉(zhuǎn)混勻；使用TrypLE Express消化乳腺癌類器官，用含2%Matrigel的類器官培養(yǎng)基重懸類器官，然后均勻分配到透明的低吸附性的96 孔板中，100 μL/孔；預(yù)培養(yǎng)2 d后，加入100 μL 按5 倍濃度梯度稀釋的化療藥物，再繼續(xù)培養(yǎng)5 d。藥物分別為：紫杉醇、多西他賽、長(zhǎng)春瑞濱、卡巴他賽、多柔比星，順鉑和吉西他濱，藥物濃度分別為：10 μm、2 μm、0.4 μm、8 × 10-2μm、1.6 × 10-2μm、3.2 × 10-3μm；設(shè)置只加DMSO 的孔作為對(duì)照組。藥物孵育結(jié)束后，將孔板室溫平衡30 min 后，吸去上層100 μL 培養(yǎng)基，然后加入100 μL CellTiter-Glo?3D 試劑，避光置于搖床上反應(yīng)30 min。在多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上讀取化學(xué)發(fā)光值，體外試驗(yàn)重復(fù)3 次。使用GraphPad Prism 9分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌類器官模型的建立本研究從接受外科手術(shù)的4 例乳腺癌患者（表1）的手術(shù)標(biāo)本中獲取部分腫瘤組織，經(jīng)過(guò)剪切、消化、過(guò)濾后得到乳腺癌細(xì)胞（圖1），使用Matrigel 膠懸浮后接種在培養(yǎng)皿中，均成功培養(yǎng)成類器官。在Matrigel 膠作為生長(zhǎng)支架和類器官培養(yǎng)基細(xì)胞因子的作用下，乳腺癌細(xì)胞團(tuán)能夠持續(xù)生長(zhǎng)分裂，形成乳腺癌3D 細(xì)胞團(tuán)（圖2）。此乳腺癌類器官可持續(xù)生長(zhǎng)，并可以持續(xù)傳代5 代以上。

圖1 乳腺癌類器官模型的建立Fig.1 Establishment of a breast cancer organoid model

圖2 乳腺癌類器官光鏡圖Fig.2 Photomicrographs of breast cancer organoids

表1 乳腺癌患者臨床信息Tab.1 Clinical information for breast cancer patients

2.2 乳腺癌類器官組織學(xué)特征將乳腺癌類器官脫水包埋制成石蠟切片，與類器官來(lái)源的親本腫瘤組織的切片同批次進(jìn)行HE 染色。見圖3，乳腺癌類器官表現(xiàn)出與其來(lái)源的原發(fā)腫瘤組織相似的組織學(xué)特征。來(lái)自不同患者的乳腺癌類器官的組織學(xué)特征上存在差異。例如，我們觀察到BC-2_O和BC-3_O 表現(xiàn)為由多層細(xì)胞組成的致密球體，而BC-1_O 表現(xiàn)出較為分散的細(xì)胞狀態(tài)。

圖3 乳腺癌組織與對(duì)應(yīng)類器官HE 染色特征對(duì)比Fig.3 Comparison of HE staining characteristics of breast cancer tissues with corresponding organoid

2.3 乳腺癌類器官免疫組織化學(xué)染色ER、PR、HER2 和Ki67 被認(rèn)為是乳腺癌臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的潛在標(biāo)志物。我們?cè)诿庖呓M化染色后使用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)HER2（+）模型乳腺癌組織（BC-2_T、BC-3_T）中HER2 呈陽(yáng)性表達(dá)，與之對(duì)應(yīng)的乳腺癌類器官（BC-2_O、BC-3_O）HER-2 免疫組化呈強(qiáng)陽(yáng)性，提示乳腺癌類器官可能富集了親本腫瘤組織中HER2 的乳腺癌干細(xì)胞（圖4）。ER 與Ki67在激素受體陽(yáng)性乳腺癌組織（BC-4_T）與衍生類器官（BC-4_O）都高度表達(dá)，而PR 在腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的類器官的表達(dá)不完全對(duì)稱。BC 組織類器官對(duì)中，激素受體和HER2 狀態(tài)得以維持。值得注意的是，TNBC 模型乳腺癌組織（BC-1_T）Ki67 熱點(diǎn)區(qū)達(dá)90%，對(duì)應(yīng)類器官（BC-1_O）有輕微表達(dá)?？梢哉J(rèn)為乳腺癌組織類器官對(duì)中，激素受體和HER2 狀態(tài)得以維持。但不可否認(rèn)腫瘤類器官可以概括其原始腫瘤的組織學(xué)特征和標(biāo)記物表達(dá)。

圖4 乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)類器官ER、PR、HER-2 和Ki-67 免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of breast cancer tissue and its corresponding organoid for ER，PR，HER-2 and Ki-67

2.4 乳腺癌類器官藥敏檢測(cè)圖5 展示了入組的4 例乳腺癌類器官在紫杉醇、多西他賽、長(zhǎng)春瑞濱、卡巴他賽、多柔比星、順鉑和吉西他濱作用后隨藥物濃度變化的細(xì)胞活力。不同分子亞型的乳腺癌對(duì)同一種藥物的敏感性不盡相同，同一患者對(duì)不同化療藥物的敏感性也不同。其中，三陰性乳腺癌類器官（BC-1_O）對(duì)紫杉醇和多柔比星呈劑量依賴關(guān)系，但是敏感度欠佳。激素受體陽(yáng)性模型乳腺癌類器官（BC-4_O）對(duì)多柔比星高度敏感，對(duì)其余藥物表現(xiàn)出明顯的抵抗力，尤其是卡巴他賽和順鉑。我們可以發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力未見明顯變化，甚至呈增加的趨勢(shì)。BC-2_O、BC-3_O 類器官系因?yàn)镠ER2 陽(yáng)性，目前臨床上主要使用靶向藥物治療。在本研究中，可以發(fā)現(xiàn)它們都對(duì)多柔比星高度敏感，多柔比星通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞DNA 的復(fù)制從而起抑制腫瘤的作用。隨著藥物濃度的增加，HER2（+）型乳腺癌類器官的細(xì)胞活力呈明顯的下降趨勢(shì)。

圖5 乳腺癌類器官的藥敏結(jié)果Fig.5 Drug sensitivity results of breast cancer organoid

3 討論

腫瘤異質(zhì)性被認(rèn)為是癌癥治療失敗的主要原因。乳腺癌患者對(duì)化療藥物的耐藥性與其具有的高度異質(zhì)性有著密不可分的關(guān)系。耐藥性的表現(xiàn)與癌癥的變化一樣具有多樣性，不管給藥機(jī)制如何（靶向藥物治療、化療或免疫治療），癌癥患者幾乎普遍存在耐藥性且預(yù)后較差。因此建立個(gè)體化的臨床前模型對(duì)于預(yù)測(cè)乳腺癌的藥物反應(yīng)和制定有效的治療策略至關(guān)重要。

類器官是一種復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)和功能上與體內(nèi)器官相似，能夠很大程度上還原親本腫瘤的組織學(xué)特征。與傳統(tǒng)2D 培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系和PDX 模型相比，患者來(lái)源的腫瘤類器官具有個(gè)體化、培養(yǎng)周期短、與來(lái)源組織差異小的優(yōu)勢(shì)，可以快速進(jìn)行高通量篩藥得出藥敏結(jié)果，還可以預(yù)測(cè)患者對(duì)新的治療方案的反應(yīng)，包括化療與靶向藥物的組合或是可添加到患者首輪治療中的多種靶向藥物［16］，可以真正實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。

研究數(shù)據(jù)表明，類器官培養(yǎng)是研究乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)和藥物開發(fā)的寶貴平臺(tái)［8，17］。乳腺癌類器官模型可以從接受新輔助化療和多重耐藥的乳腺癌患者的殘余腫瘤，以及同一患者的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腋窩淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移成功建立［8，18］。然而乳腺癌具有多種分子分型，其治療方法及預(yù)后均有顯著差異。本研究選擇不同分子亞型乳腺癌組織，構(gòu)建乳腺癌類器官模型作為藥物測(cè)試平臺(tái)。對(duì)于三陰性乳腺癌和激素受體陽(yáng)性乳腺癌，我們可以觀察到腫瘤和衍生類器官之間的對(duì)應(yīng)性并不十分強(qiáng)烈，這可能跟腫瘤組織取樣和類器官的培養(yǎng)過(guò)程有關(guān)。除此之外，腫瘤的內(nèi)在特征可能會(huì)影響類器官的生長(zhǎng)效率［19］，導(dǎo)致某些腫瘤亞克隆的丟失，從而導(dǎo)致腫瘤-衍生類器官匹配不良。盡管類器官能夠還原體內(nèi)腫瘤發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵特征，但類器官本質(zhì)是體外模型，缺乏與腫瘤微環(huán)境成分（如基質(zhì)、血管、免疫細(xì)胞、微生物群等）的相互作用，取得的結(jié)果可能并不盡如人意。如果從乳腺癌針刺活檢中產(chǎn)生類器官，藥物試驗(yàn)與相應(yīng)患者臨床治療并行，可以作為乳腺癌患者有效的篩藥平臺(tái)，有望為實(shí)現(xiàn)乳腺癌患者的個(gè)性化精準(zhǔn)治療提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

我們篩選了7 種藥物，發(fā)現(xiàn)類器官對(duì)多柔比星（一種蒽環(huán)類化療藥物）和吉西他濱這兩種藥物的敏感性顯著。研究證實(shí)使用含帕妥珠單抗方案對(duì)HER2 陽(yáng)性乳腺癌患者進(jìn)行新輔助治療有明顯療效，聯(lián)合含蒽環(huán)類藥物有更好獲益可能，且安全性良好［20］。

本研究中入組患者按照指南和病情制定合適臨床化療方案，對(duì)應(yīng)類器官使用同樣的藥物進(jìn)行篩藥，篩藥結(jié)果與患者治療情況基本一致。我們的結(jié)果表明這些藥物在治療乳腺癌方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究開發(fā)了類器官模型作為實(shí)時(shí)平臺(tái)，以指導(dǎo)不同分子亞型乳腺癌的臨床藥物治療，表明使用類器官作為藥物測(cè)試平臺(tái)指導(dǎo)癌癥患者的個(gè)性化治療具有潛在的可行性。下一步需要招募更多的患者進(jìn)行前瞻性臨床研究這對(duì)于乳腺癌的早期篩查及早期治療具有重大意義。