臍帶間充質(zhì)干細胞改善自身免疫性肝炎免疫微環(huán)境的機制

余麗娜 閻升光 謝丹 高升 葉政 陳姿任 王梓樺 歐陽石

1華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（河北唐山 063210）；廣東高校生物靶向診治與康復(fù)重點實驗室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院2感染科，3中醫(yī)科，4超聲科，5急診科（廣州 510700）

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是T 細胞介導(dǎo)的慢性免疫炎癥性疾病，女性多發(fā)，表現(xiàn)為高丙種球蛋白血癥、血清抗核抗體和/或抗平滑肌抗體的存在，以及界面性肝炎［1］。肝臟移植是AIH 發(fā)展為肝硬化不可避免的治療選擇，但因其來源難且復(fù)發(fā)率高已嚴重危害患者生命［2］。因此，開發(fā)安全有效的藥物以提供有效的治療方案是至關(guān)重要的。

臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSCs）因其具有針對先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的免疫細胞的免疫調(diào)節(jié)特性，同時因其來源廣、免疫原性低等優(yōu)勢已成為自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用的最佳選擇［3］。研究發(fā)現(xiàn)，UCMSCs 可通過對CD4+T 細胞分化的免疫調(diào)節(jié)，糾正Th17/Treg 的不平衡［4］。Th17/Tregs 免疫平衡在免疫介導(dǎo)的AIH 發(fā)病中至關(guān)重要。Tregs 作為CD4+T 細胞的一個亞群，通過釋放抗炎因子如TGF-β1 來執(zhí)行免疫抑制功能。當(dāng)AIH 疾病活動時，Treg 的數(shù)量明顯減少，血清中IL-17 和IL-6 以及肝臟內(nèi)Th17 細胞的頻率明顯增加［5］。因此，以Treg/Th17 免疫平衡為目標可能為治療AIH 提供一種有效的方法。然而，UCMSCs 調(diào)節(jié)AIH 免疫微環(huán)境中Th17/Treg 平衡的影響和分子機制的基礎(chǔ)和臨床研究卻很少。

因此，本實驗首先用PBMCs 模擬肝臟免疫微環(huán)境，觀察UCMSCs 治療對T 淋巴細胞分化的影響。由于Th17/Treg 分化受到復(fù)雜的細胞和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，進一步通過轉(zhuǎn)錄譜明確主要的差異基因，為進一步的臨床研究提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 UCMSCs 獲得在獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準（倫理批號：KY01-2021-09-09）及患者的知情同意的情況下，臍帶取自健康足月孕婦，并在2 h 內(nèi)于本院前沿醫(yī)學(xué)交叉中心實驗室進行UCMSCs 制備。

1.2 人外周血單個核（PBMCs）獲得在嚴格遵守相關(guān)倫理原則的前提下，收集處于血清氨基轉(zhuǎn)移酶和IgG 水平升高和/或肝組織學(xué)炎癥活動的AIH患者外周血樣本。所有研究對象均符合國際自身免疫性肝炎小組（IAIHG）規(guī)定的標準和2010 年美國肝病研究學(xué)會自身免疫性肝炎診斷與治療指南及評分診斷標準。排除標準：合并PBC 或PSC 的重疊綜合征；2 個月內(nèi)使用過血液制品；1 個月內(nèi)接受過糖皮質(zhì)激素治療或其他免疫抑制治療。

1.3 主要實驗試劑及材料人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基（天津灝洋生物）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco）；Transwell 小室（PC 膜，孔徑0.4 μm）（Corning 公司）；流式抗體CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD31、CD45、HLA-DR、CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE、CD3-FITC、CD8α-PerCP-Cy5.5、IL17A-PE（eBioscience 公司）；TGF-1、IL-17 和IL-6 檢測試劑盒（MultiSciences 公司）；RORγt（ab113434）（Abcam 公司）；Foxp3（#12632）、SMAD3（#9523）、p-SMAD3（#9520）、STAT3（#9139）、p-STAT3（#9145）（Cell Signaling Technology 公司）；ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液（美侖生物）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB Green series 試劑盒（日本Takara 公司）。

1.4 實驗儀器Western 電泳槽、轉(zhuǎn)模槽及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司）；流式細胞儀（美國BD Biosciences 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR 儀（美國羅氏生物公司）；Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent）；儀器HiSeq X Ten 系統(tǒng)測序平臺（美國illumina 公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 UCMSCs 的制備分離出Wharton 膠并切成1 mm3的泥塊，均勻地鋪在T75 培養(yǎng)瓶中，在無血清培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)7 d。達到80%匯合度后，對MSC 樣細胞進行傳代。本實驗使用第3 ～6 代UCMSCs。

1.5.2 UCMSCs 的鑒定通過光鏡顯微鏡觀察UCMSCs 的形態(tài)特征。在流式細胞儀中使用CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD31、CD45 和DR 抗體對UCMSCs 進行免疫表型鑒定。

1.5.3 PBMCs 的制備采用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法從AIH 患者外周血中分離PBMCs。在單個核細胞分離液液面加入用PBS 稀釋的新鮮肝素抗凝全血，水平離心（800g，20 min，升降3）?？梢娧獫{層與分離液層之間有一層薄較致密白膜為PBMCs，小心吸取白膜到含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基中，離心去上清，洗滌兩次，制成懸液。

1.5.4 構(gòu)建UCMSCs/PBMCs 共培養(yǎng)系統(tǒng)將UCMSCs 接種于Transwell 小室上腔，PBMCs 細胞接種于下腔，細胞穩(wěn)定后將UCMSCs 與PBMCs 共培養(yǎng)。UCMSCs/PBMCs 共培養(yǎng)系統(tǒng)分為3 組，包括PBMCs組、Co-culture 1 組（PBMCs∶UCMSCs=10∶1）和Coculture 2 組（PBMCs∶UCMSCs=5∶1）。共培養(yǎng)72 h后，收集PBMCs 和上清液進行后續(xù)分析。

1.5.5 流式細胞術(shù)檢測Treg 和Th17 細胞的百分比PBMCs 用熒光偶聯(lián)抗體著色，再用流式細胞儀進行分析。CD25+Foxp3+CD4+Treg 細胞先用CD4-FITC 和CD25 - APC 標記，F(xiàn)oxp3 抗原透化。CD3+CD8-IL-17A+Th17 細胞通過CD3-FITC 和CD8α-PerCP-Cy5.5 識別CD4+T 細胞，固定透化后用IL17A-PE 染色。

1.5.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測相關(guān)細胞因子使用ELISA 試劑盒測定TGF-β1、IL-17 和IL-6 水平。在酶標儀測量450、630 nm 處的光學(xué)吸光度。

1.5.7 RNA 測序分析用TRIzol 對PBMCs 進行RNA 提取。Oligo（dT）磁珠富集mRNA。用mRNA的短片段作為模板，合成cDNA。經(jīng)過純化、末端修復(fù)和添加A-tail 后，進行PCR。使用Agilent 2100 分析儀對構(gòu)建的文庫進行了質(zhì)量檢查。使用HiSeq X Ten 系統(tǒng)對RNA 進行測序。轉(zhuǎn)錄組測序分析及生信富集分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。設(shè)置參數(shù)：表達量倍數(shù)變化比值＞2和＜0.5 富集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FC＞2 or FC＜0.5，P＜0.05）。

1.5.8 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）使用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）分析差異表達基因，最小有效結(jié)合分數(shù)為0.4。PPI 網(wǎng)絡(luò)是用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建的。CytoHubba 插件被用來尋找網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的核心差異基因。

1.5.9 Western blot用含PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 提取PBMCs 總蛋白。SDS-PAGE 分離變性的蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5% BSA 封閉2 h，相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育。在成像系統(tǒng)下使用ECL 對所得印跡進行可視化。

1.5.10 RT-qPCR 檢測轉(zhuǎn)錄基因采用Trizol 法提取細胞總RNA，按Takara 說明書合成cDNA 及PCR 體系，最后結(jié)果以2-ΔΔCt分析。Foxp3、RORγt、SMAD3、STAT3 及GAPDH 的引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法本實驗統(tǒng)計分析用SPSS 26.0處理；GraphPad 9.5 版進行相關(guān)繪圖工作。數(shù)據(jù)以（）表示。多組間的平均值使用單因素方差分析，然后用Dunnet-t檢驗對各Co-culture 組和PBMC組之間進行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs 的形態(tài)和表面分子鑒定UCMSCs形態(tài)在顯微鏡下可見均勻分布，呈現(xiàn)出典型的紡錘形和渦旋狀排列。見圖1。

圖1 UCMSCs 鏡下形態(tài)（50 ×，200 ×）Fig.1 Morphology of UCMSCs under microphone（50×，200×）

流式細胞術(shù)分析UCMSCs 的表面標記，CD29、CD73、CD90 和CD105 為陽性，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR 為陰性，幾乎不表達。符合國際細胞協(xié)會MSC 標準。見圖2。

圖2 UCMSCs 細胞表面標記Fig.2 Facing marker of UCMSCs

2.2 UCMSCs 治療對Th17/Treg 平衡的影響Coculture 組與PBMCs 組相比，Th17 細胞比例、Th17/Treg 值明顯減少（P＜0.05），Co-culture 2 組Th17細胞比例顯著降低（P＜0.001）；Treg 細胞比例在Co-culture 2 組明顯增加（P＜0.01）。見圖3、4及表2。

圖3 CD3+CD8-IL-17A+ Th17 細胞比例Fig.3 Frequency of CD3+CD8-IL-17A+ Th17 cells

圖4 CD25+Foxp3+CD4+ Treg 細胞比例Fig.4 Frequency of CD25+Foxp3+CD4+ Treg cells

表2 不同組間Th17、Treg 及Th17/Treg 值Tab.2 Th17，Treg and Th17/Treg values among different groups ±s

表2 不同組間Th17、Treg 及Th17/Treg 值Tab.2 Th17，Treg and Th17/Treg values among different groups ±s

注：與PBMC 組相比，**P＜0.01，***P＜0.001

組別PBMC 組Co-culture 1 組Co-culture 2 組F 值P 值例數(shù)3 3 3 Th17（%）4.17 ± 0.35 3.05 ± 0.05**2.53 ± 0.25***33.21＜0.001 Treg（%）1.80 ± 0.10 2.13 ± 0.12 3.17 ± 0.51**15.94 0.004 Th17/Treg 2.31 ± 0.07 1.43 ± 0.06***0.81 ± 0.07***383.05＜0.001

2.3 UCMSCs 治療對TGF-β1、IL-17 和IL-6 的影響與單純PBMCs 組上清液相比，Co-culture 2 組促炎因子TGF-β1 顯著升高（P＜0.01），IL-17、IL-6下降（P＜0.05）。見表3。

表3 不同組上清中的TGF-β1、IL-17 及IL-6 的表達水平Tab.3 TGF-β1，IL-17 and IL-6 expression in the supernatants in different groups ±s，pg/mL

表3 不同組上清中的TGF-β1、IL-17 及IL-6 的表達水平Tab.3 TGF-β1，IL-17 and IL-6 expression in the supernatants in different groups ±s，pg/mL

注：與PBMC 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別PBMC 組Co-culture 1 組Co-culture 2 組F 值P 值例數(shù)5 5 5 TGF-β1 3.73 ± 1.73 2.48 ± 1.97 9.84 ± 2.69**16.49＜0.001 IL-17 2.29 ± 1.29 0.78 ± 0.34 0.25 ± 0.18*5.55 0.043 IL-6 1 192.04 ± 65.48 1 029.57 ± 100.72*876.97 ± 82.78***17.49＜0.001

2.4 UCMSCs 治療對RORγt 和Foxp3 的影響Western blot 和RT-PCR 檢測Foxp3 和RORγt 的蛋白和基因表達水平，顯示Foxp3 明顯增加，RORγt明顯下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 UCMSCs 治療對RORγt 和Foxp3 的影響Fig.5 Effect of UCMSCs treatment on RORγt and Foxp3

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析對照組和共培養(yǎng)組PBMCs 中的差異基因表達經(jīng)UCMSCs 治療后，較AIH 患者PBMCs 細胞出現(xiàn)93 個上調(diào)差異mRNA（FC ≥2，P＜0.05）；95 個下調(diào)差異mRNA（FC ≤0.5，P＜0.05），本研究只富集前15 個表達量最高的mRNA 進行后續(xù)分析。見圖6。

圖6 差異基因mRNA 韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential gene mRNA

2.6 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析對照組和共培養(yǎng)組PBMCs 中的差異基因表達通過對UCMSCs 對PBMCs 的前15 組轉(zhuǎn)錄系主要作用通路進行統(tǒng)計學(xué)富集分析。發(fā)現(xiàn)差異mRNA 富集的變化集中在免疫應(yīng)答、淋巴細胞分化/激活以及T 細胞的激活調(diào)整等領(lǐng)域。見圖7。

圖7 共有差異mRNA 富集圖（前15 位）Fig.7 Total differential mRNA enrichment map（top 15）

2.7 PP 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄基因篩選蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）圖顯示Co-culture 組與PBMC 組相比，SMAD3 的表達量增加而STAT3 的表達量減少，并可見其表達占比高。見圖8。

圖8 AIH 差異表達基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig.8 PPI of AIH differentially expressed genes encoding

2.8 UCMSCs 治療促進STAT3 下調(diào)和SMAD3 上調(diào)結(jié)合上述結(jié)果，我們進一步論證SMAD3 和STAT3 的激活，以其磷酸化狀態(tài)為標志。當(dāng)UCMSCs：PBMCs 為1∶5 時，Western blot 結(jié)果顯示STAT3 磷酸化（p-STAT3）明顯下調(diào)（P＜0.01），p-SMAD3 則上調(diào)（P＜0.05）。一致的是，SMAD3 mRNA 水平在Co-culture 2 組中明顯高于PBMC 組（P＜0.001），而STAT3 mRNA 水平減少（P＜0.001）。見圖9。

圖9 UCMSCs 治療對STAT3 和SMAD3 的影響Fig.9 Effect of UCMSCs treatment on STAT3 and SMAD3

3 討論

研究證實，UCMSCs 因其免疫調(diào)節(jié)特性可將適應(yīng)性細胞從以效應(yīng)性T 細胞（Th17 cells）為主的炎癥環(huán)境調(diào)節(jié)到富含Tregs 的微環(huán)境。本研究結(jié)果顯示，UCMSCs 與從AIH 患者外周血提取的PBMCs共培養(yǎng)時，UCMSCs 可促使Th17 細胞分化為Tregs，TGF-β1 釋放增加，Th17/Treg 值下降，IL-17 和IL-6的釋放顯著減少，提示UCMSCs 治療可逆轉(zhuǎn)Th17/Tregs 免疫失衡，改善AIH 免疫微環(huán)境。Th17/Tregs免疫失衡在AIH 的發(fā)展中起著重要作用。臨床研究［8］顯示，AIH 患者的外周血中Th17 細胞的比例高于CD4+T 細胞，與肝損傷呈正相關(guān)關(guān)系。RORγt 是一種促進Th17 細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子［9］。研究［10］表明，當(dāng)?shù)蜐舛鹊腡GF-β1 與IL-6 同時存在時，能夠通過激活STAT3 磷酸化誘導(dǎo)RORγt 表達，從而誘導(dǎo)CD4+T 細胞向Th17 細胞分化。Treg 對免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有明顯的負向調(diào)節(jié)作用，對維持免疫平衡和調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 作為Treg 分化標志物，也是識別CD25+Foxp3+CD4+Treg 細胞的特異性標志物。進一步研究發(fā)現(xiàn)UCMSCs 治療可上調(diào)Foxp3 表達，減少RORγt 表達。

為進一步探索UCMSCs 治療AIH 免疫微環(huán)境的潛在作用機制，采用RNA 測序和生物信息分析研究主要作用通路，其中SMAD3 和STAT3 占據(jù)核心位置。再通過實驗結(jié)果顯示UCMSCs 治療主要通過上調(diào)p-SMAD3，下調(diào)p-STAT3 來介導(dǎo)PBMCs中的Th17/Treg 免疫平衡。機制研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）［11］是維持免疫耐受的真正關(guān)鍵，通過啟動TGF-β 信號通路在Tregs 和Th17 細胞的分化中起著關(guān)鍵作用。TGF-β1 可使下游的SMAD 蛋白磷酸化，誘導(dǎo)SMAD 蛋白在細胞核中聚集，并作為轉(zhuǎn)錄因子進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［12］。

綜上，在大劑量UCMSCs 治療后，可明顯下調(diào)Th17/Treg 值，促進TGF-β1 含量，增強SMAD3 表達，誘導(dǎo)Treg 細胞的分化和增殖；降低STAT3 表達，減少Th17 細胞的分化和生成。為臨床試驗的開展提供數(shù)據(jù)支持。