高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于稽留流產(chǎn)遺傳因素的分析

張 康 李向利 蔣國(guó)慶

1.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，北京 100016；2.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，北京 100016

稽留流產(chǎn)指胚胎或胎兒死亡后滯留在宮腔未能及時(shí)排除，是自然流產(chǎn)的一種特殊狀態(tài)，其病因復(fù)雜多樣，包括染色體、內(nèi)分泌、免疫、感染、解剖、血栓前狀態(tài)等，并且仍有50%病因不明[1-3]。其中，胚胎的遺傳缺陷是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的重要因素[4]。近年來(lái)，隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，絨毛染色體檢測(cè)開(kāi)始廣泛應(yīng)用于稽留流產(chǎn)原因分析及產(chǎn)前診斷等多個(gè)領(lǐng)域。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)稽留流產(chǎn)患者絨毛組織基因拷貝數(shù)變異情況，評(píng)估該技術(shù)應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年6 月至2020 年6 月清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診確診為稽留流產(chǎn)并且行清宮手術(shù)的91例患者為研究對(duì)象，對(duì)流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行高通量測(cè)序分析。孕婦年齡22～42 歲，平均（31.26±4.10）歲；孕齡6～13周，平均（9.15±1.65）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①尿或血絨毛膜促性腺激素陽(yáng)性；②超聲符合稽留流產(chǎn)指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦自身內(nèi)分泌系統(tǒng)異常、支原體及衣原體感染、生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常；②孕期有毒、有害物質(zhì)接觸史等?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[（2022）倫審研第（57）號(hào)]。

1.2 檢測(cè)方法

清宮術(shù)后，流產(chǎn)組織經(jīng)無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，漂凈后置冰盒保存，送至北京科諾安生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。采用拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KR2000，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司），依托基因測(cè)序儀（型號(hào)NextSeq CN500，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司），進(jìn)行全基因組范圍掃描，包括DNA 提取、純化、建庫(kù)、測(cè)序、信息分析、報(bào)告出具等步驟。同時(shí)取孕婦外周血2 ml 送檢做參考，以排除絨毛染色體是否受到母源性污染。

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織高通量測(cè)序結(jié)果

91 例稽留流產(chǎn)絨毛組織均成功進(jìn)行高通量測(cè)序，成功率為100.00%。21 例（23.92%）染色體正常，70 例（76.08%）染色體異常；有明確致病性50 例（54.94%）；染色體異常樣本中，以染色體數(shù)目異常最為常見(jiàn)，三體最多。見(jiàn)表1。

表1 絨毛染色體拷貝數(shù)變異結(jié)果

2.2 染色體拷貝數(shù)變異樣本分析結(jié)果

26 例染色體拷貝數(shù)變異中，微缺失型6 例、微重復(fù)型14 例、混合型6 例。其中6 例具有明確致病性、2例良性、18 例為臨床意義未明的基因組拷貝數(shù)變異。相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 染色體拷貝數(shù)變異樣本分析結(jié)果

2.3 已知致病性拷貝數(shù)變異樣本分析結(jié)果

6 例具有明確致病性樣本的具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 已知致病性拷貝數(shù)變異樣本分析結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，稽留流產(chǎn)發(fā)病率逐漸升高，給孕婦及其家庭帶來(lái)身體和心理的雙重傷害。稽留流產(chǎn)病因復(fù)雜多樣，包括遺傳、免疫、感染、解剖、環(huán)境、精神等[4-5]。染色體異常是最常見(jiàn)原因[6]。

傳統(tǒng)的G 顯帶核型分析法被作為檢測(cè)染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常的金標(biāo)準(zhǔn)，但其對(duì)標(biāo)本要求高，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，且分辨率低，對(duì)于＜5 Mb 的微小染色體畸變難以檢出[7]。研究顯示，染色體核型分析正常的細(xì)胞中可能存在亞顯微水平的缺失、重復(fù)等拷貝數(shù)變異[8]。如果拷貝數(shù)變異涉及與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要基因片段的缺失、插入或重復(fù)，最終可能會(huì)導(dǎo)致胎兒死亡或流產(chǎn)[9]。熒光原位雜交法雖然檢測(cè)時(shí)間短，但只能對(duì)13、16、18、21、22、X 和Y 染色體進(jìn)行檢測(cè)，不能分析全部染色體和全基因組結(jié)構(gòu)，且有20%漏診的概率[10-11]。本研究應(yīng)用高通量基因測(cè)序技術(shù)拷貝數(shù)異常，不僅能檢測(cè)46 條染色體非整倍體異常，還能檢測(cè)出＞100 kb 片段的微缺失、微重復(fù)，發(fā)現(xiàn)新的染色體變異。該項(xiàng)技術(shù)對(duì)絨毛組織要求低，分辨率高，檢測(cè)速度快，最大的優(yōu)勢(shì)在于可以發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域染色體拷貝數(shù)變異，具有極高的靈敏度和特異度[12]，彌補(bǔ)染色體核型分析和熒光原位雜交法的不足，使得流產(chǎn)的病因?qū)W診斷更全面[13-14]。

本研究采用高通量測(cè)序檢測(cè)絨毛組織的同時(shí)，抽取母親外周血進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，排除母體細(xì)胞污染的影響，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。全部標(biāo)本均成功進(jìn)行染色體檢測(cè)，說(shuō)明該技術(shù)比以往檢測(cè)技術(shù)更加可靠。本研究結(jié)果顯示，91 例樣本中，檢測(cè)出拷貝數(shù)異常的樣本共70例，異常率為76.08%，有明確致病性50 例（54.94%），與既往文獻(xiàn)[13,15-16]報(bào)道的染色體異常率一致。本研究結(jié)果顯示，以染色體數(shù)目異常最為常見(jiàn)，三體最多；非整倍體中，21-三體所占比例最高，有5 例，其次是15-三體、16-三體。與既往研究[17-18]（常染色體三體是染色體異常的主要核型）相符。由此可見(jiàn)，染色體數(shù)目異常是胚胎停育的主要原因[19]。

染色體拷貝數(shù)變異共26 例，其中重復(fù)有14 例、缺失有6 例、混合型6 例；重復(fù)率高于缺失率，與張攀等[20]研究結(jié)果一致，提示染色體的重復(fù)比起缺失可能更容易影響胚胎的發(fā)育。本研究中明確有致病性拷貝數(shù)變異6 例、良性2 例、臨床意義未知18 例。由于目前技術(shù)有限，這些缺失或重復(fù)片段的致病性還沒(méi)有完全明確，由于其結(jié)構(gòu)異常片段相對(duì)較小，容易得到基因補(bǔ)償而無(wú)特殊臨床癥狀表現(xiàn)。染色體微缺失或微重復(fù)是患兒多發(fā)畸形的主要原因[21-22]，但與稽留流產(chǎn)是否相關(guān)還需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

目前，人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法對(duì)全部的結(jié)果進(jìn)行臨床性質(zhì)判斷，所以對(duì)于臨床意義未明的拷貝數(shù)變異無(wú)法明確是否會(huì)導(dǎo)致不良妊娠，還需要更多的研究來(lái)明確。如果檢測(cè)結(jié)果為染色體數(shù)目異常，考慮遺傳之外的因素所致概率較高，如環(huán)境、感染、高齡等因素，導(dǎo)致生殖細(xì)胞或受精卵在早期有絲分裂過(guò)程中出現(xiàn)染色體不分離或者丟失，可基本排除來(lái)自夫妻雙方的遺傳畸變，需要告知夫妻盡可能避免接觸導(dǎo)致染色體異常的不良因素。如果絨毛組織存在拷貝數(shù)變異，則需要進(jìn)一步分析拷貝數(shù)變異是否來(lái)自親代，抑或是新發(fā)突變，建議夫妻雙方均檢測(cè)染色體拷貝數(shù)變異，并輔以家系綜合評(píng)估，確定該缺失或重復(fù)的來(lái)源，分析拷貝數(shù)變異的多態(tài)性影響。無(wú)論為新發(fā)突變還是來(lái)自雙親遺傳，再次妊娠時(shí)都需要進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。任何一項(xiàng)技術(shù)都具有局限性，拷貝數(shù)變異目前無(wú)法檢測(cè)出染色體平衡性結(jié)構(gòu)異常（包括染色體平衡易位及倒位）、多倍體等[23]，還需要結(jié)合染色體核型分析進(jìn)行診斷[24-27]。

綜上所述，染色體異常是早孕期稽留流產(chǎn)的主要原因，其中又以染色體數(shù)目異常為主。在染色體亞顯微水平上，高通量測(cè)序技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以更高效、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)絨毛染色體數(shù)目異常和拷貝數(shù)變異，是對(duì)傳統(tǒng)絨毛核型分析的有效補(bǔ)充，有助于全面明確稽留流產(chǎn)的病因，為夫妻雙方再次生育提供更有意義的優(yōu)生遺傳咨詢和指導(dǎo)。