膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)pTERT突變的研究進(jìn)展

蔣谷峰 綜述 周 杰 審校

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的發(fā)病率及惡性程度最高。端粒酶是一種依賴核糖核酸的脫氧核糖核酸聚合酶，主要由兩個(gè)亞基組成，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse tranase，TERT）和RNA。TERT 是端粒酶全酶的核心催化亞基，可通過(guò)從頭合成將TTAGGG 重復(fù)序列添加到端粒上，從而對(duì)抗端粒丟失，最終使細(xì)胞無(wú)限增殖[1]。TERT 在大多數(shù)正常成人細(xì)胞中由TERT 啟動(dòng)子（TERT-promoter，pTERT）的轉(zhuǎn)錄抑制而失活，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中卻普遍活躍，尤其是GBM。pTERT 突變通過(guò)相關(guān)機(jī)制可重新激活TERT，在GBM 發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本文就GBM相關(guān)pTERT突變分子機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并分析其在GBM 中的相關(guān)作用，為pTERT 在GBM 的診斷、預(yù)后判斷及治療上提供參考。

1 pTERT突變的發(fā)病機(jī)制

1.1 C228T和C250T突變TERT基因位于體細(xì)胞的5號(hào)染色體短臂上，由16 個(gè)外顯子和15 個(gè)內(nèi)含子組成，分別為C228T 和C250T。這兩種突變是相互排斥的，任何一種突變均會(huì)增加TERT 的表達(dá)，從而增加端粒酶的活性。它們?cè)谒衼喰偷哪z質(zhì)瘤中發(fā)生率均很高，尤其是原發(fā)性GBM，突變率達(dá)70%。這兩種突變均產(chǎn)生一條完全相同的堿基對(duì)序列，包含ETS 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序，可從ETS 家族招募轉(zhuǎn)錄因子。ETS 家族成員包括ETS1、ETS2、GABPA、GAB?PB、ETV1、ETV4和ETV5，其中GABPA參與TERT的轉(zhuǎn)錄激活。敲除GABPA 的基因表達(dá)顯著降低突變型啟動(dòng)子的活性，卻不影響野生型啟動(dòng)子的活性[2]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也同時(shí)表明，突變型pTERT 需要一個(gè)四聚體形成的β1L 亞型的GABPA 進(jìn)行激活，而野生型pTERT不需要，因此GABPA 是GBM中TERT表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。另外，pTERT 還存在其他更罕見(jiàn)的突變，包括C249T和C228A，但這些突變并不會(huì)產(chǎn)生ETS轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2 pTERT 甲基化大多數(shù)GBM 都存在端粒酶RNA基因（telomerase RNA component，TERC）和TERT 的高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TERC 和TERT 表達(dá)水平升高與兒童非腦干GBM的預(yù)后較差有關(guān)，但與成人GBM相比，兒童GBM 的pTERT 改變卻非常罕見(jiàn)，這可能是由于端粒酶在成年前的干細(xì)胞和祖細(xì)胞中活躍而不需要通過(guò)TERT 突變來(lái)上調(diào)端粒酶活性；此外，pTERT甲基化與兒童腦腫瘤及野生型GBM中TERT表達(dá)增加密切相關(guān)[3]。這表明某些pTERT 野生型GBM 及兒童GBM 的TERT 的上調(diào)可以用pTERT 甲基化來(lái)解釋，但這一發(fā)現(xiàn)與啟動(dòng)子突變的典型作用相反，因?yàn)樵趩?dòng)子甲基化中，甲基化通常會(huì)沉默相關(guān)基因的表達(dá)。

1.3 端粒重復(fù)序列結(jié)合因子（telomeric repeat binding factor，TRF）2-G-四鏈（pTERT）成人GBM存在非端粒的DNA 結(jié)合因子，包括TRF1、TRF2和Ras相關(guān)蛋白1，其中大部分由G-四鏈的非雙鏈結(jié)構(gòu)組成。研究表明，pTERT 突變能破壞TRF2 與GBM 中pTERT的G-四鏈結(jié)合[4]，使TERT抑制解除，當(dāng)加入G-四鏈體穩(wěn)定配體，TRF2 結(jié)合重新獲得，并重新抑制攜帶pTERT突變的端粒酶。

1.4 pTERT 突變的時(shí)間節(jié)點(diǎn)研究表明，C228T 和C250T 突變可以將pTERT 的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)2～4 倍，而且GBM中pTERT mRNA及TERT表達(dá)水平高于正常人腦細(xì)胞，表明GBM 中pTERT 突變導(dǎo)致TERT 表達(dá)上調(diào)。然而，pTERT突變發(fā)生在GBM的早期還是晚期，尚不明確。雖然TERT在GBM中表達(dá)升高，但pTERT突變GBM的端粒比對(duì)照組卻更短，表明這些突變可能發(fā)生在癌變之后。Ackermann 等[5]研究表明突變?cè)谕徊∪瞬煌[瘤病灶中高頻率出現(xiàn)，比較瘤周組織（腦室下區(qū)）、腫瘤組織與匹配的正常組織發(fā)現(xiàn)，瘤周區(qū)域早已有pTERT突變，可能是腫瘤的起源。因此GBM早期可能會(huì)通過(guò)PTEN的基因復(fù)制丟失與TERT突變共同作用進(jìn)展為一種的癌變前體，最終引發(fā)GBM。

2 預(yù)后預(yù)測(cè)

2.1 pTERT單核苷酸多態(tài)性（SNPrs2853669）pTERT的單核苷酸多態(tài)性SNPrs2853669包括純合子C/C突變和野生型T/T等，通過(guò)調(diào)控其他途徑導(dǎo)致與預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)對(duì)126 例GBM 的研究表明，攜帶SN?Prs2853669 的pTERT 突變亞組比SNPrs2853669 非攜帶者的中位生存期更長(zhǎng)；然而，當(dāng)SNPrs2853669發(fā)生C/C 純合子變異時(shí)，尤其是在C228T 或C250T pTERT 突變存在的情況下，生存期顯著縮短[6]。這提示攜帶SNPrs2853669 可能是pTERT 突變相關(guān)GBM 的有利預(yù)后因素，而當(dāng)SNPrs2853669 發(fā)生C/C純合子突變時(shí)，使ETS2 結(jié)合位點(diǎn)的破壞和TERT 表達(dá)降低，最終導(dǎo)致端粒酶活性低于野生型T/T 純合子，因此SNPrs2853669 C/C 純合子基因型可作為pTERT突變病人短期生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。但目前仍缺乏關(guān)于SNPrs2853669 野生型純合子T/T 對(duì)pTERT 突變相關(guān)GBM 病人生存率是否有影響的研究。

2.2 pTERT 突變與其他基因關(guān)聯(lián)pTERT 突變具有獨(dú)立負(fù)性預(yù)后影響。Dono 等[7]同時(shí)觀察異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）和pTERT突變的GBM，發(fā)現(xiàn)即使在沒(méi)有IDH 突變的腫瘤中，GBM 的pTERT 突變也預(yù)示著低存活率，且同時(shí)攜帶pTERT突變型和IDH 野生型腫瘤的總體生存期最差。Bol?lam 等[8]發(fā)現(xiàn)pTERT 突變的存在不是預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素，表現(xiàn)為IDH 突變型和IDH 野生型GBM無(wú)顯著差異。因此，pTERT能否作為預(yù)測(cè)GBM的預(yù)后獨(dú)立因素暫無(wú)定論。

研究表明，pTERT 突變的負(fù)面影響與共同存在的分子和臨床因素有關(guān)，如年齡、IDH-wt 狀態(tài)和未甲基化的O6-甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine- DNA methyltransferase，MGMT）狀態(tài)。研究表明，這些因素未能觀察到與pTERT 突變的存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的獨(dú)立的生存關(guān)聯(lián)。劉千琪等[9]發(fā)現(xiàn)，pTERT 突變的存在與總體生存期無(wú)關(guān)，GBM的pTERT 突變與IDH1/2 突變同時(shí)發(fā)生的頻率較低（11.5%），同時(shí)野生型IDH1/2 聯(lián)合pTERT 突變的GBM 病人總體生存期較IDH1/2 突變聯(lián)合pTERT 突變的GBM低。此外，pTERT突變型與上皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）擴(kuò)增高度相關(guān)（44.1%），且EGFRⅧ在24%～67%的GBM 中表達(dá)，當(dāng)GBM 中EGFR 擴(kuò)增及pTERT 突變同時(shí)存在時(shí)，病人總體生存期明顯下降。在GBM 中，pTERT突變與MGMT 啟動(dòng)子甲基化同時(shí)發(fā)生的概率為43.6%，MGMT 啟動(dòng)子未甲基化較低級(jí)別膠質(zhì)瘤高，表明MGMT 未甲基化與pTERT 突變共存是GBM 的預(yù)后不良因素[10]。

3 輔助診斷技術(shù)

3.1 MRI 的診斷價(jià)值一項(xiàng)對(duì)60 例GBM 的MRI 的研究發(fā)現(xiàn)，GBM 未顯示TERTp-mut 與腫瘤部位相關(guān)；但對(duì)于原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的MRI 分析顯示，TERTp-mut 更常累及胼胝體壓部；此外，聯(lián)合分析IDH1/2 和pTERT 突變狀態(tài)可以區(qū)分膠質(zhì)病變是GBM 還是反應(yīng)性膠質(zhì)增生，反應(yīng)性膠質(zhì)增生樣本不包含pTERT區(qū)域的C228T或C250T突變[11]。

3.2 檢測(cè)pTERT 的新興技術(shù)2016 年WHO 對(duì)GBM的分類仍基于IDH，分為IDH野生型GBM、IDH突變型GBM 和未另行指定的GBM。隨后，TERTp 突變、EGFR突變和MGMTp甲基化可通過(guò)體液活檢腫瘤分子譜整合到臨床診斷中。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）在血液和體液中的釋放取決于腫瘤的位置、大小和腫瘤的血管浸潤(rùn)[12]，因此通過(guò)血液、腦脊液、尿液和其他體液檢測(cè)和分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞和ctDNA，間斷分析ctDNA可提供腫瘤成分、異質(zhì)性、預(yù)后生物標(biāo)記物及其與其他臨床相關(guān)癌癥生物標(biāo)記物的關(guān)系等信息。液體活檢中的ctDNA水平因人而異，通過(guò)間斷的ctDNA監(jiān)測(cè)，同時(shí)利用液滴式數(shù)字PCR 分析檢測(cè)pTERT 突變，可評(píng)估GBM 的進(jìn)展，使pTERT突變作為未來(lái)個(gè)體化診治的生物標(biāo)志物成為可能。

4 靶點(diǎn)治療

4.1 端粒酶抑制劑由于端粒縮短的生理病理機(jī)制，TERT抑制可能在經(jīng)歷多個(gè)細(xì)胞周期后才發(fā)揮作用，因此限制了端粒酶抑制劑的應(yīng)用。目前，這種靶向治療在癌癥中沒(méi)有得到批準(zhǔn)。伊美司他是一種小型的TERT抑制劑，在治療原發(fā)性血小板減少癥方面顯示出明確的療效，同時(shí)在GBM 細(xì)胞系中，長(zhǎng)期伊美司他治療可導(dǎo)致GBM 腫瘤起始細(xì)胞的進(jìn)行性端粒縮短、增殖率降低和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；另外，伊美司他聯(lián)合放療和替莫唑胺化療對(duì)GBM 細(xì)胞存活率有顯著影響[13]。然而，一項(xiàng)針對(duì)兒童難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的臨床試驗(yàn)，因出現(xiàn)治療相關(guān)的血小板減少繼發(fā)的腫瘤內(nèi)出血而過(guò)被迫停止。同時(shí)，另一項(xiàng)臨床前研究表明，治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌中經(jīng)常使用的微管抑制劑燈盞花素作為一種微管抑制劑，也被證明對(duì)依賴TERT-RNA 的RNA 聚合酶具有特異的抑制活性[14]，可以抑制pTERT 突變的GBM 細(xì)胞系的生長(zhǎng)，并顯著延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，但缺乏臨床試驗(yàn)。靶向GABPβ1L而非TERT本身可能是燈盞花素靶向治療TERTP 突變細(xì)胞的一種方向，且同時(shí)保留正常細(xì)胞以避免伊美司他的引起的造血功能障礙。在一項(xiàng)GBM 細(xì)胞系研究中，破壞β1L 亞型可以逆轉(zhuǎn)TERTp 突變的GBM 細(xì)胞的無(wú)限復(fù)制[15]。在小鼠GBM的異種移植模型中，敲除GABPβ1L會(huì)削弱腫瘤的生長(zhǎng)并提高小鼠的存活率。此外，BIBR1532作為一種可破壞β1L 亞型有效的端粒酶抑制劑，可以通過(guò)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)端粒酶活性來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]，但還沒(méi)有可用的臨床數(shù)據(jù)或臨床試驗(yàn)。

4.2 TERT 活性靶向疫苗一項(xiàng)從自體腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)中提純的RNA 轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞的試驗(yàn)表明[17]，所有接受治療的細(xì)胞均出現(xiàn)了免疫反應(yīng)，沒(méi)有明顯的毒性或自身免疫的跡象；接種疫苗的病人的無(wú)進(jìn)展生存期明顯更長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)2年的隨訪，7例中有5例存活。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗（den?tritic cell vaccine，DCV）沒(méi)有顯著改善43 例GBM 病人的總體生存期或無(wú)進(jìn)展生存期，在調(diào)整B7-H4 的表達(dá)后，DCV 改善總體生存期，這是由于B7 分子是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫逃逸介質(zhì)，其中B7-H4 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，可阻斷有效的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，DCV 可作為治療pTERT 突變腫瘤的GBM 的首選疫苗。同時(shí)，UCPVax 作為一種基于端粒酶衍生輔助肽的治療性抗癌疫苗，可誘導(dǎo)Th1CD4T 細(xì)胞的強(qiáng)烈反應(yīng)[18]，盡管Ⅰ期試驗(yàn)結(jié)果尚未公布，但這種這種疫苗被證實(shí)是安全的，未來(lái)將可能替代DCV成為治療GBM的首選活性靶向疫苗。

綜上所述，pTERT 突變作為GBM 發(fā)生、發(fā)展的最重要機(jī)制之一，對(duì)于大部分成年GBM，其可通過(guò)突變后的堿基序列招募GABPA 轉(zhuǎn)錄因子或通過(guò)破壞TRF2 與pTERT 的G-四鏈結(jié)合來(lái)激活TERT 活性，然后通過(guò)PTEN 的基因復(fù)制丟失（雜合子缺失）與TERT 突變共同作用進(jìn)展為一種的癌變前體，最終引發(fā)GBM。而對(duì)于小部分的兒童GBM 及野生型GBM，其機(jī)制可能為pTERT的甲基化。其次，pTERT對(duì)于能否預(yù)測(cè)GBM病人預(yù)后，仍存在爭(zhēng)議。但若同時(shí)攜帶SNPrs2853669的pTERT突變的GBM，比非攜帶者的預(yù)后更好，當(dāng)SNPrs2853669 發(fā)生純合子C/C突變時(shí)，存活率明顯降低。再者，當(dāng)pTERT 突變同時(shí)攜帶IDH 野生型、pTERT 突變、GFR 擴(kuò)增、MGMT未甲基化其中之一者，預(yù)后更差。pTERT 對(duì)于頭顱MRI的意義表現(xiàn)為TERTp-mut原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤病例更常累及胼胝體壓部，聯(lián)合分析IDH1/2狀態(tài)可以區(qū)分膠質(zhì)病變是GBM 與反應(yīng)性膠質(zhì)增生。間斷液體活檢及液滴式數(shù)字PCR分析對(duì)個(gè)體化診療及判斷預(yù)后具有重要的意義。靶向作用于GABPβ1L 可能是燈盞花素靶向治療TERTP 突變細(xì)胞的一種方向，且同時(shí)保留正常細(xì)胞以避免伊美司他的引起的造血功能障礙，已逐漸形成取代伊美司他的趨勢(shì)。此外，BIBR1532可通過(guò)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)端粒酶活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療效果，也將成為研究的熱點(diǎn)。就免疫靶向活疫苗來(lái)說(shuō)，DCV可作為治療B7-H4 分子低表達(dá)的pTERT 突變腫瘤的GBM 的首選方案，而UCPVax 作為一種基于端粒酶衍生輔助肽的治療性抗癌疫苗，亦在未來(lái)有可能取代DCV。