菜薹抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間QTL定位及候選基因分析

李桂花，符梅，羅文龍，駱善偉，郭巨先

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

菜心(Brassica rapassp.parachinensis)是起源于中國(guó)華南地區(qū)的特色葉菜，僅廣東省年種植面積就有20萬(wàn)hm2（包括復(fù)種），紫菜薹(Brassica rapassp.chinensisvar.purpurea)是起源于中國(guó)長(zhǎng)江流域的葉菜，具有悠久的栽培歷史和優(yōu)良品質(zhì)及獨(dú)特的形態(tài)特征[1]。菜心和紫菜薹均為十字花科蕓薹屬小白菜變種AA染色體組(2n=20)，菜薹為其食用的主要部分[2]。兩者在中國(guó)很受歡迎，并銷(xiāo)往亞洲、歐洲和美洲等國(guó)家。在菜薹的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間影響著熟性早晚從而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此開(kāi)展抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間性狀的QTL 定位及候選基因分析具有十分重要的意義。抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀，與其相關(guān)的研究領(lǐng)域涉及的是BrFLC。Tadege 等[3]首先從甘藍(lán)型油菜中分離到了5 個(gè)序列與FLC 相似的基因，這些基因能顯著延遲開(kāi)花時(shí)間。之后又有Schranz 等[4]在白菜中克隆到了與FLC 同源的BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3 和BrFLC5 等基因，分別位于A10、A02 和A03 染色體上。原玉香等[5]利用DH 群體定位到了BrFLC1。鄧杰等[6]利用由小白菜構(gòu)建的DH 群體定位到了BrFLC2。隨著蕓薹屬蔬菜抽薹開(kāi)花時(shí)間研究的不斷深入，很多其他與開(kāi)花相關(guān)的基因也被定位到。陳雪等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在油菜中存在6個(gè)與開(kāi)花時(shí)間同源的基因，其中有4 個(gè)定位于A07 染色體和C06染色體上。而白菜中則發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與開(kāi)花時(shí)間同源的基因，分別為位于A02 染色體及A07 染色體。張學(xué)銘則定位到A07 染色體上一個(gè)開(kāi)花時(shí)間同源基因[8]。本試驗(yàn)以抽薹時(shí)間天數(shù)、開(kāi)花時(shí)間天數(shù)差異大的2個(gè)材料為親本，進(jìn)行雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2群體共150株作為作圖群體，對(duì)菜心的抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行田間調(diào)查，利用北京百邁客生物科技有限公司簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了包含4253 個(gè)標(biāo)記的菜心分子遺傳圖譜[9]，用混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)菜心的抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行QTL 定位和候選基因分析，旨在為分子標(biāo)記輔助選擇不同熟性的品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘湘紅薹1號(hào)’與‘義農(nóng)50天菜心’為雙親，構(gòu)建F2群體150個(gè)單株，于2016年11月16日播種于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地，為減少試驗(yàn)中邊行優(yōu)勢(shì)帶來(lái)的誤差，每畦地種2行，田間種植為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。‘湘紅薹1號(hào)’為晚抽薹開(kāi)花材料，‘義農(nóng)50天菜心’為早抽薹開(kāi)花材料（圖1），雙親間的遺傳距離較大、一般配合力好，適合遺傳圖譜的構(gòu)建及相關(guān)農(nóng)藝性狀的分析。

圖1 作圖親本

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抽薹開(kāi)花性狀的調(diào)查每日觀察并統(tǒng)計(jì)各植株的抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間。抽薹時(shí)間的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為從播種到花蕾肉眼可見(jiàn)所需時(shí)間。開(kāi)花時(shí)間調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為從播種到第一朵花完全開(kāi)放所需時(shí)間。

1.2.2 葉片總DNA 提取與檢測(cè)選取苗期的菜薹鮮嫩葉片，提取雙親及F2單株葉片總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。

1.2.3 分子遺傳連鎖圖譜及構(gòu)圖材料將雙親及F2群體150株的DNA送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq)[9]，在構(gòu)建菜心分子遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，用混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)菜心的抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行QTL定位和候選基因分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜薹高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

基于SLAF 文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序，共獲得353.57 M長(zhǎng)度為100 bp的reads。其GC含量及Q30筆者分別為42.47%和90.21%。母本獲得了10100084個(gè)reads，80935 個(gè)SLAFs，測(cè)序深度為39.4；父本獲得了10181878個(gè)reads，測(cè)序深度為40.75，87833個(gè)SLAFs；在F2群體中，共獲得2221944 條reads，77079 個(gè)SLAFs，平均深度為9.89（表1）[9]。對(duì)低深度SLAFs 標(biāo)簽進(jìn)行過(guò)濾后，共獲得130525 個(gè)高質(zhì)量SLAFs，多態(tài)SLAFs 百分率為20.3%(26557)，其中有10940 個(gè)SNP標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建。一共構(gòu)建了10 個(gè)連鎖群（圖2），圖譜總長(zhǎng)1030.04 cM，共有4253個(gè)標(biāo)記分布在10 個(gè)連鎖群中，包含標(biāo)記數(shù)最多的為L(zhǎng)G2 連鎖群，有677個(gè)標(biāo)記，最少的為L(zhǎng)G5連鎖群，有235個(gè)標(biāo)記；標(biāo)記間的平均距離為0.27 cM，10 個(gè)連鎖群長(zhǎng)度在73.12～140.03 cM之間，其中LG5最長(zhǎng)為140.03 cM，LG8最短為73.12 cM（表2）。圖中標(biāo)記的完整度為99.66%，發(fā)生雙交換的比例為0.02%。

表1 SLAF測(cè)序信息統(tǒng)計(jì)

表2 各連鎖群中標(biāo)記數(shù)及遺傳距離

圖2 菜薹高密度遺傳圖譜

2.2 菜薹抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間次數(shù)分布圖

由表3、圖3可知，雙親性狀差異非常明顯，其中P1的抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間天數(shù)均明顯遲于親本P2。F1抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間天數(shù)在兩親本之間。F2抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間在群體中均發(fā)生明顯分離，表現(xiàn)為連續(xù)變化，單一峰值，屬于數(shù)量性狀。

表3 親本及F1和作圖群體F2的表型d

圖3 F2種群抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間表型分布圖

2.3 菜薹抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間性狀QTL定位

通過(guò)混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法獲得抽薹時(shí)間QTL 為2 個(gè)，表型貢獻(xiàn)率在8.39%～57.55%之間；開(kāi)花時(shí)間QTL 2個(gè)，表型貢獻(xiàn)率在9.76%～56.51%之間。其中，抽薹時(shí)間主效QTL 定位于A07 號(hào)染色體上（表4、圖4A），貢獻(xiàn)率57.55%；微效QTL 則位于A09 號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率8.39%（圖4A）。開(kāi)花時(shí)間主效QTL位于A07 號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率56.51%（表4、圖4B），微效QTL 則位于A09 號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率9.75%（圖4B）?？刂瞥檗窌r(shí)間和開(kāi)花時(shí)間主效QTL 均位于A07 染色體，總間距為0.33 cM，表明抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間這2個(gè)性狀是受基因的多效性或鄰近基因控制的。

表4 菜薹抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間性狀的QTL分析表

圖4 菜薹A07號(hào)染色體上抽薹時(shí)間(A)和開(kāi)花時(shí)間(B)性狀的數(shù)量性狀定位

2.4 候選基因分析

利用白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)主效QTL區(qū)域SNP標(biāo)記的側(cè)翼序列進(jìn)行同源性分析[10]。利用默認(rèn)參數(shù)的Blastn函數(shù)，對(duì)Ensembl植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考基因組和已注釋的白菜基因組進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)候選基因功能進(jìn)行注釋。分析了位于A07 染色體抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間的主效QTL區(qū)域，以期找到參與抽薹時(shí)間與開(kāi)花時(shí)間的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。將獲得的數(shù)據(jù)與白菜的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，優(yōu)先確定了與抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間性狀相關(guān)的12 個(gè)基因。這些候選基因在菜心抽薹、開(kāi)花的過(guò)程中具有不同的調(diào)節(jié)作用。諸如Bra004159、Bra004101 和Bra004125 基因與花的分生組織的營(yíng)養(yǎng)供給有關(guān)。而B(niǎo)ra004116 和Bra004125 在不同的花器官形成中發(fā)揮作用。同樣，基因Bra004101 和Bra004125 也參與到植物激素的生物合成或信號(hào)傳導(dǎo)途徑中。編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因Bra004149 也位于主效基因QTL 區(qū)域，其中一些基因可能與早期開(kāi)花性狀有關(guān)。根據(jù)參考基因組，最終篩選到與抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間相關(guān)的3 個(gè)候選基因（表5、圖5）。其中，Bra004125 通常被稱(chēng)為生長(zhǎng)素應(yīng)答因子8(ARF8)，ARF8 在不同花器官的發(fā)育中起主要作用。第2 個(gè)候選基因Bra004162 是一種轉(zhuǎn)錄因子MYB92，主要調(diào)節(jié)植物的開(kāi)花時(shí)間和次生細(xì)胞壁的形成。而第3個(gè)基因Bra004165則是編碼CML24的鈣結(jié)合蛋白，通過(guò)一氧化二氮(N2O)介導(dǎo)的途徑在開(kāi)花過(guò)程中起作用。

表5 在A07染色體主效QTL區(qū)域篩選到與抽薹、開(kāi)花時(shí)間相關(guān)的選候選基因

圖5 菜薹抽薹時(shí)間(A)和開(kāi)花時(shí)間(B)LOD值和貢獻(xiàn)率分析

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)菜薹F2分離種群的抽薹時(shí)間、開(kāi)花性狀進(jìn)行了田間調(diào)查，利用北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建的包含4253個(gè)標(biāo)記的分子遺傳圖譜，通過(guò)混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法找到與抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間相關(guān)的QTL 4 個(gè)，其中2 個(gè)主效QTL 位于A07 號(hào)染色體的相鄰區(qū)域。試驗(yàn)首次將主效QTL 區(qū)域與白菜參考基因組進(jìn)行比對(duì)，篩選并推測(cè)ARF8、MYB92 和CML24 參與了菜心早期抽薹和開(kāi)花性狀。該結(jié)果將為下一步的基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

4 討論

分子遺傳圖譜是研究植物數(shù)量性狀QTL 定位必要條件。本研究利用抽薹時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間差異大的雙親雜交，獲得F2分離群體，利用150個(gè)單株構(gòu)建了一張菜薹高密度遺傳圖譜。與前人構(gòu)建的白菜類(lèi)遺傳圖譜相比，本圖譜包含更多標(biāo)記，且是利用菜薹變種內(nèi)雜交進(jìn)行群體構(gòu)建，更有利于菜薹農(nóng)藝性狀的定位及候選基因分析。通過(guò)QTL 分析，鑒定篩選出4 個(gè)抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間的QTL，這些QTL定位在A09（微效基因）和A07（主效基因）染色體上（圖4～5）。控制抽薹時(shí)間QTL(QTL1.1)和開(kāi)花時(shí)間QTL(QTL2.1)的主效基因位于A07 染色體上相鄰居位置，總間距為0.33 cM，表明抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間這2個(gè)性狀是受基因的多效性或鄰近基因控制的。參考注釋基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于縮小候選基因的選擇范圍非常重要，這些結(jié)果為基因分離和功能測(cè)試研究提供重要的參考價(jià)值。根據(jù)參考基因組和之前發(fā)表的文獻(xiàn)以及與其他植物相同性狀相關(guān)的同源基因，篩選到3 個(gè)與抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間性狀相關(guān)的候選基因。其中一個(gè)通常被稱(chēng)為生長(zhǎng)素應(yīng)答因子8的候選基因Bra004125，控制著雄蕊和雌蕊的成熟過(guò)程[11-12]。ARF8在花器官中表達(dá)，特別是在花發(fā)育過(guò)程中的花瓣中表達(dá)[13]。該基因的功能喪失會(huì)體現(xiàn)在雄蕊發(fā)育改變和花絲長(zhǎng)度減少[13-14]。ARF8 與轉(zhuǎn)錄因子BIGPETAL 相互作用，控制發(fā)育花瓣中的細(xì)胞分裂和擴(kuò)增[14]。ARF8還會(huì)促進(jìn)茉莉酸的生物合成，并導(dǎo)致花的成熟[11]。第2個(gè)基因Bra004162是一種轉(zhuǎn)錄因子，被稱(chēng)為MYB92。該轉(zhuǎn)錄因子幾乎在花的所有器官中都有表達(dá)[1]。MYB92 在擬南芥中過(guò)表達(dá)促進(jìn)開(kāi)花，并減少了莖纖維。該轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)進(jìn)一步影響了控制擬南芥開(kāi)花過(guò)程的不同基因轉(zhuǎn)錄水平[1]。研究結(jié)果進(jìn)一步暗示了植物中的開(kāi)花過(guò)程也受赤霉素控制，而MYB92可能參與赤霉素介導(dǎo)的開(kāi)花途徑。MYB92在赤霉素信號(hào)傳遞過(guò)程中起主要調(diào)控作用[15]。第3個(gè)候選基因Bra004165 則是編碼為CML24 的鈣結(jié)合蛋白[15]。CML24是潛在的鈣傳感器，可轉(zhuǎn)換鈣信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)一氧化二氮(N2O)的積累[16]。反過(guò)來(lái)說(shuō)，N2O 水平可以通過(guò)光周期和自主調(diào)節(jié)途徑影響開(kāi)花的過(guò)渡期。該蛋白在擬南芥植物中的功能喪失最終表現(xiàn)為開(kāi)花較晚，而恢復(fù)其功能則開(kāi)花較早[15]?？紤]到ARF8、MYB92和CML24在花器官發(fā)育中和調(diào)節(jié)誘導(dǎo)植物開(kāi)花的某些途徑的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的重要性，Bra004125、Bra004162 和Bra004165 都是影響菜心抽薹和開(kāi)花時(shí)間的重要候選基因。