黑皮冬瓜果實(shí)生長及糖類物質(zhì)變化規(guī)律

焦加斌，李金隆,2，常靜靜，李靜，陳瀟，宋釗，何裕志，張白鴿

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院國際鎂營養(yǎng)研究所，福州 350002）

0 引言

冬瓜為一年生蔓生草本植物，又稱東瓜、白瓜、白東瓜皮、白冬瓜、白瓜皮、白瓜子、地芝，是葫蘆目葫蘆科蔬菜，原產(chǎn)于中國南部及印度，現(xiàn)在東亞和南亞地區(qū)廣泛栽培，2018年，國內(nèi)的冬瓜年播種面積33.33萬hm2，主要分布在廣東、廣西、湖南、海南、江西等地[1-2]。盡管冬瓜在中國有2000年以上的栽培歷史，其藥用功能方面已有較多研究報(bào)道[3-5]，但由于從事冬瓜研究的人員相對較少，其生長發(fā)育和栽培等相關(guān)研究工作開展較晚，其研究的深度和廣度均落后于番茄、黃瓜等大宗蔬菜作物[6-7]。果實(shí)的生長發(fā)育和碳水化合物的累積轉(zhuǎn)化規(guī)律是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培的理論基礎(chǔ)[8]，但目前在冬瓜上還缺乏相關(guān)研究報(bào)道。

糖類物質(zhì)是生物體內(nèi)的主要碳源，可為生物體提供能量，同時(shí)糖的種類及含量與果實(shí)品質(zhì)密切相關(guān)[9-10]。在蔗糖代謝中，轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶可調(diào)控蔗糖分解與合成反應(yīng)，其活性變化決定了果實(shí)中的糖代謝進(jìn)程和糖組分[11]，這在葫蘆科的黃瓜[12-13]、甜瓜[14-15]、西瓜[16-17]等園藝作物上已有大量研究成果積累，而冬瓜卻未見報(bào)道。因此，開展冬瓜糖代謝規(guī)律研究，對認(rèn)識(shí)冬瓜果實(shí)中糖的來源、代謝進(jìn)程變化特征等具有重要意義。

本研究在總結(jié)黑皮冬瓜果實(shí)生長發(fā)育規(guī)律的基礎(chǔ)上，對不同時(shí)期的主要可溶性糖及相關(guān)酶活性進(jìn)行測定，探究冬瓜果實(shí)品質(zhì)形成和糖代謝動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，旨在為后期根據(jù)果實(shí)發(fā)育規(guī)律特征制定合理的冬瓜田間管理調(diào)控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)和材料

試驗(yàn)于2020—2021 年在廣東省廣州市天河區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基地(23.16°N，113.37°E)進(jìn)行。供試材料為廣東省科農(nóng)蔬菜種業(yè)有限責(zé)任公司提供的‘鐵柱二號(hào)’黑皮冬瓜。待幼苗三葉一心期移栽到田間，種植密度為6750 株/hm2，株距60 cm，行距150 cm。種植期間，化肥用量為N 350 kg/hm2、P2O5180 kg/hm2、K2O 375 kg/hm2、MgO 90 kg/hm2，農(nóng)藝管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理方式。

1.2 指標(biāo)測定方法

1.2.1 果實(shí)橫縱徑測量方法從花后5 d開始，選擇8個(gè)長勢均勻的冬瓜進(jìn)行標(biāo)記，每隔5 d 用皮尺測定果實(shí)上、中、下部位的橫徑、縱徑和果實(shí)質(zhì)量，計(jì)算果形指數(shù)。測量位點(diǎn)如圖1所示，果形指數(shù)計(jì)算方法如式(1)。

圖1 冬瓜果實(shí)發(fā)育橫縱徑動(dòng)態(tài)測量位點(diǎn)

1.2.2 取樣方法分別在花后5 d（幼果期）、15 d（初果期）、25 d（果實(shí)膨大期）和35 d（果實(shí)成熟期）4 個(gè)時(shí)期取樣，每個(gè)時(shí)期取樣8個(gè)果實(shí)。如圖2所示，按照與果柄距離的近遠(yuǎn)將果實(shí)分為上、中、下3 個(gè)部位，每個(gè)部位的縱徑都限制為4 cm。去除果實(shí)內(nèi)的種子，用排水法測定其上、中、下部位的體積以及果實(shí)其他部位的體積，并記錄。將果肉切成小塊，用FAA固定液固定，用于石蠟切片分析。采集的樣品立即用液氮處理后存放于-80℃，用于可溶性糖、糖代謝相關(guān)酶等指標(biāo)測定。

圖2 冬瓜果實(shí)取樣位點(diǎn)

1.2.3 石蠟切片取樣及制作方法將各部位果肉組織切成5 mm×5 mm×2 mm小塊，放入裝有FAA固定液的試管中。將試管內(nèi)的空氣抽盡，使材料沉底，靜置固定24 h后，將組織從固定液中取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)將目的部位組織修平整，然后依次進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片、染色和封片[18]。

用NI/E 智能生物顯微鏡（日本產(chǎn)）對所制切片進(jìn)行觀察并拍照保存。果肉細(xì)胞體積和細(xì)胞數(shù)目的計(jì)算參考田嘉等[19]和王燕等[20]的方法，將果肉細(xì)胞近似看成橢圓體，細(xì)胞體積的計(jì)算如式(2)。細(xì)胞數(shù)目的計(jì)算如式(3)。

式中，a為細(xì)胞長直徑；b為細(xì)胞短直徑；V2是果肉體積，果肉體積采用排水法測定，果肉的總體積等于各部位體積之和；Vc是細(xì)胞體積。

1.2.4 可溶性糖測定稱取0.5 g 樣品置于10 mL 離心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液，80℃水浴30 min，期間混勻2 次，以便充分提取。室溫下4000 r/min 離心10 min，收集上清液。用離心冷凍濃縮儀將溶液蒸干，糖析出，加入1 mL 超純水溶解，反復(fù)沖洗，0.22μm 針式過濾器過濾，HPLC檢測。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD 法）測定，檢測儀器是Aglient液相色譜儀。

1.2.5 酶活性測定冬瓜果肉中α-半乳糖苷酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁不溶性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶分解方向酶活性均利用試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司）進(jìn)行測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan 法檢驗(yàn)不同時(shí)期以及相同時(shí)期不同部位之間差異顯著性(P＜0.05)，使用Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜果實(shí)生長發(fā)育規(guī)律

冬瓜果實(shí)的上部縱徑和下部縱徑均遵循“S”形生長曲線，花后5～10 d冬瓜果實(shí)上部縱徑的生長速率大于下部，此后，果實(shí)的上部縱徑均顯著大于下部縱徑。果實(shí)縱徑生長速率最快的時(shí)期是花后10～25 d，上部縱徑、下部縱徑的生長速率分別為2.05、2.06 cm/d（圖3a）。冬瓜果實(shí)的上部橫徑、中部橫徑和下部橫徑均遵循“S”形生長曲線，上、中、下橫徑生長速率最快的時(shí)期均在花后10～20 d，上、中、下橫徑的生長速率分別為0.94、0.74、0.96 cm/d。中部橫徑與上部和下部相比處于生長的弱勢區(qū)域。花后20～25 d，果實(shí)上部和下部橫徑顯著大于中部橫徑（圖3b）?？傮w來說，冬瓜果實(shí)整個(gè)生育期的果形指數(shù)呈現(xiàn)先上升再下降的變化趨勢，這是由于冬瓜果實(shí)前期主要進(jìn)行縱向生長，后期主要進(jìn)行橫向生長。整個(gè)生育期冬瓜的果形指數(shù)介于4.90～6.30之間（圖3c）。冬瓜果實(shí)單果重也呈現(xiàn)“S”形生長規(guī)律，單果重增長最快的時(shí)期是花后15～30 d，此時(shí)冬瓜的單果重增長速率為0.70 kg/d（圖3d）。

圖3 冬瓜果實(shí)橫縱徑、果形指數(shù)和單果重的變化

2.2 冬瓜果實(shí)細(xì)胞體積和數(shù)量變化規(guī)律

如圖4 所示，從花后5～35 d，在同樣大的面積內(nèi)，冬瓜果實(shí)的上、中、下部位果肉細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞面積逐漸增大?；ê? d 和15 d，冬瓜果肉細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞間隙?。换ê?5 d，細(xì)胞之間存在間隙，細(xì)胞大小不均一。在同樣大的面積內(nèi)，中部的細(xì)胞數(shù)目多于上部和下部，細(xì)胞面積小于上部和下部。花后35 d，冬瓜果肉細(xì)胞變大，且薄壁細(xì)胞之間間隙較大。

圖4 冬瓜果肉細(xì)胞橫切圖

如圖5 所示，冬瓜果實(shí)的細(xì)胞數(shù)量從花后5 d 到15 d增長了2.42倍，花后15 d到25 d增長了1.28倍，花后25 d到35 d增長了1.03倍。另外，在冬瓜果實(shí)整個(gè)發(fā)育期，果肉細(xì)胞體積一直在膨大，并在花后35 d 達(dá)到最大值，與花后5 d 相比細(xì)胞體積擴(kuò)大了7.02 倍。同一時(shí)期果實(shí)不同部位的細(xì)胞數(shù)目沒有差異，而細(xì)胞體積在花后15 d 和25 d 時(shí)存在差異，均表現(xiàn)為上部=下部＞中部。

圖5 冬瓜果實(shí)細(xì)胞數(shù)目和大小的變化

綜上所述，冬瓜果實(shí)生長前期以細(xì)胞分裂為主，后期以細(xì)胞膨大為主。在同一時(shí)期不同部位的細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，細(xì)胞體積在花后15～25 d 在不同部位間存在差異。冬瓜果實(shí)上、中和下部橫徑不同主要是由細(xì)胞體積在空間上存在差異所造成的。

2.3 冬瓜果實(shí)不同部位可溶性總糖、果糖和葡萄糖濃度變化

對整個(gè)生育期冬瓜果實(shí)中多種可溶性糖進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)可溶性糖的濃度表現(xiàn)為果糖＞葡萄糖＞水蘇糖＞棉籽糖，可能由于蔗糖濃度較低，在冬瓜果實(shí)發(fā)育的各時(shí)期均未檢測出蔗糖。隨著果實(shí)的生長發(fā)育，各部位的可溶性總糖、果糖、葡萄糖的濃度逐漸增加，在花后35 d達(dá)到最大值，可溶性總糖、果糖和葡萄糖物質(zhì)在不同部位間無顯著差異（圖6）。

圖6 冬瓜果實(shí)中不同部位可溶性總糖、果糖、葡萄糖濃度變化

2.4 冬瓜果實(shí)內(nèi)糖類物質(zhì)代謝相關(guān)酶活性變化

對冬瓜果實(shí)內(nèi)糖類物質(zhì)代謝相關(guān)酶活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)冬瓜果實(shí)中酶的活性表現(xiàn)為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶＞中性轉(zhuǎn)化酶＞蔗糖磷酸合成酶＞蔗糖合成酶分解方向＞蔗糖合成酶＞細(xì)胞壁不溶性轉(zhuǎn)化酶（圖7）。隨著果實(shí)的生長發(fā)育，α-半乳糖苷酶活性逐漸降低（圖7c），蔗糖合成方向酶的總活性逐漸升高（圖7a），蔗糖分解方向酶的總活性逐漸降低（圖7b），各個(gè)時(shí)期蔗糖分解方向酶的活性均大于蔗糖合成方向。

圖7 冬瓜果實(shí)中糖類代謝相關(guān)酶活性的變化

2.5 冬瓜果實(shí)內(nèi)不同部位α-半乳糖苷酶活性變化

如圖8所示，隨著果實(shí)的生長發(fā)育，冬瓜果實(shí)不同部位的α-半乳糖苷酶活性逐漸降低?；ê?5 d，冬瓜果實(shí)的α-半乳糖苷酶活性在空間上存在差異，表現(xiàn)為上部=中部＞下部，其他時(shí)期的α-半乳糖苷酶活性在不同部位之間無顯著差異。

圖8 冬瓜果實(shí)不同部位的α-半乳糖苷酶活性變化

2.6 冬瓜果實(shí)內(nèi)不同部位蔗糖分解相關(guān)酶活性變化

如圖9所示，隨著果實(shí)的生長發(fā)育，冬瓜果實(shí)中的細(xì)胞壁不溶性轉(zhuǎn)化酶和可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶的活性逐漸降低，中性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶分解方向的活性逐漸增加。細(xì)胞壁不溶性轉(zhuǎn)化酶活性在花后35 d時(shí)存在部位之間的差異，為上部＞中部；中性轉(zhuǎn)化酶活性在花后25和35 d時(shí)均存在部位之間的差異，分別表現(xiàn)為下部＞上部和上部=中部＞下部?？扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶活性在同一時(shí)期各部位之間沒有顯著差異?？紤]到在縱向上不同部位的糖類代謝酶活性無顯著差異，只檢測了果實(shí)中部蔗糖合成酶分解方向的酶活，結(jié)果表明該酶的活性隨著果實(shí)發(fā)育逐漸升高（圖9d）。

圖9 冬瓜果實(shí)不同部位的蔗糖分解類酶活性變化

2.7 冬瓜果實(shí)內(nèi)不同部位蔗糖合成相關(guān)酶活性變化

如圖10 所示，隨著果實(shí)的生長發(fā)育，冬瓜果實(shí)中蔗糖合成酶的活性變化不大，蔗糖磷酸合成酶的活性逐漸增加。蔗糖合成酶的活性在同一時(shí)期不同部位之間沒有顯著差異，蔗糖磷酸合成酶的活性在花后35 d存在差異，表現(xiàn)為上部＝下部＞中部，其他時(shí)期不同部位之間沒有顯著差異。

圖10 冬瓜果實(shí)不同部位的蔗糖合成類酶活性變化

3 結(jié)論

冬瓜果實(shí)的橫、縱徑生長發(fā)育均遵循“S”形生長曲線，果實(shí)上部縱徑的生長速率大于果實(shí)下部縱徑，花后20～25 d時(shí)上部和下部橫徑的生長速率大于中部橫徑，而中部橫徑的生長對其果形品質(zhì)至關(guān)重要，所以花后20～25 d時(shí)應(yīng)加強(qiáng)田間管理。冬瓜果實(shí)發(fā)育前期以細(xì)胞分裂為主，后期以細(xì)胞膨大為主。冬瓜果實(shí)糖類物質(zhì)積累的關(guān)鍵時(shí)期是在花后25～35 d。從冬瓜的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益考慮，建議花后35 d左右及時(shí)采收。

4 討論

果實(shí)的形狀和大小作為最直接的外觀品質(zhì)性狀，是消費(fèi)者選擇瓜果蔬菜的重要因素，也是果蔬市場分類和果實(shí)加工過程中分級(jí)的重要指標(biāo)[21]。果實(shí)的形狀、大小和生長發(fā)育規(guī)律是與外觀品質(zhì)密切相關(guān)的重要數(shù)量性狀[22-25]。葫蘆科擁有許多重要的水果蔬菜（瓜類），如黃瓜、甜瓜、西瓜、冬瓜和南瓜，以及各種葫蘆。瓜類最具特色的是其不同的果實(shí)大小和形狀[26]。早期研究表明，瓜類果實(shí)的大小和形狀很大一部分是在開花前決定的[27]。前人在研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小共同決定果實(shí)的大小和形狀，細(xì)胞數(shù)目是基礎(chǔ)，細(xì)胞大小是關(guān)鍵[28]。本試驗(yàn)通過對冬瓜果實(shí)不同時(shí)期的解剖觀察發(fā)現(xiàn)，冬瓜果實(shí)的細(xì)胞分裂和膨大是冬瓜果實(shí)膨大的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，花后5～15 d即果實(shí)生長發(fā)育的前期是以細(xì)胞分裂為主；花后15～35 d 即果實(shí)發(fā)育中后期細(xì)胞分裂逐步停止，細(xì)胞膨大起主導(dǎo)作用，這和黃瓜、瓠瓜、番茄等果實(shí)發(fā)育的研究結(jié)果一致[29-31]。冬瓜果實(shí)上部和下部的橫徑生長優(yōu)先于中部，冬瓜果實(shí)的中部橫徑對其果實(shí)的外形品質(zhì)十分重要，直接影響其商品價(jià)值，因此，在花后20～25 d要加強(qiáng)對冬瓜的田間管理。

冬瓜等葫蘆科作物是棉子糖家族寡糖運(yùn)轉(zhuǎn)型植物(RFOs)，其光合產(chǎn)物的主要運(yùn)輸形式是水蘇糖，但是，目前鮮有關(guān)于冬瓜果實(shí)內(nèi)水蘇糖合成和分解的研究。黃瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物果實(shí)的RFOs分解途徑已基本明確。水蘇糖經(jīng)過韌皮部長距離運(yùn)輸后卸載的同時(shí)還會(huì)分解轉(zhuǎn)化為果糖、葡萄糖和蔗糖。首先，水蘇糖在α-半乳糖苷酶的催化下脫去一個(gè)半乳糖苷轉(zhuǎn)化為棉籽糖，棉籽糖進(jìn)一步在α-半乳糖苷酶的催化下脫去一個(gè)半乳糖苷轉(zhuǎn)化為蔗糖[32]。進(jìn)入蔗糖代謝途徑后，中性轉(zhuǎn)化酶、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁不溶性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶分解方向催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，蔗糖合成酶催化游離果糖和葡萄糖合成蔗糖，蔗糖磷酸合成酶以果糖-6-磷酸為底物合成蔗糖[33-36]。葫蘆科果實(shí)內(nèi)主要的糖類代謝途徑可用圖11 表示。不同葫蘆科作物果實(shí)中的葡萄糖、果糖和蔗糖的含量及比例存在很大差異，這與果實(shí)發(fā)育中糖分的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和積累密切相關(guān)[37]。成熟期的西瓜中蔗糖、果糖和葡萄糖之間的比例為5:3:2[38]。不同品種的南瓜中蔗糖、果糖和葡萄糖所占的比例也不相同，成熟期的中國南瓜蔗糖含量占總糖的85%，而印度南瓜葡萄糖含量占總糖的75%[39]。成熟期的甜瓜中蔗糖含量占總糖的60%左右[40]?？扇苄蕴墙M分的差異與其代謝相關(guān)酶活密切相關(guān)，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性與蔗糖積累量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[38,41]，而轉(zhuǎn)化酶的活性與蔗糖積累量顯著負(fù)相關(guān)[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬瓜果實(shí)中最主要的糖類物質(zhì)是果糖和葡萄糖，分別占可溶性總糖的51%和48%，蔗糖、水蘇糖和棉籽糖的濃度很低，甚至在某些時(shí)期和部位檢測不出來，這和黃瓜中不同種類可溶性糖所占比例結(jié)果相似[13,43]。隨著果實(shí)的生長發(fā)育冬瓜果實(shí)內(nèi)的果糖和葡萄糖濃度逐漸增加。蔗糖代謝相關(guān)酶的凈活性等于蔗糖合成酶類的總活性減去蔗糖分解方向的總活性，當(dāng)凈活性為負(fù)值時(shí)，蔗糖不積累或者少量積累。本研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖分解方向的總酶活遠(yuǎn)大于合成方向，因此，冬瓜果實(shí)內(nèi)的蔗糖濃度極低，以至于檢測不出來。冬瓜果實(shí)中糖類物質(zhì)積累最快的時(shí)期是花后25～35 d，此時(shí)冬瓜果實(shí)正處于膨果期，應(yīng)注重冬瓜的水肥管理。

圖11 葫蘆科果實(shí)主要糖類物質(zhì)及其相關(guān)酶活代謝關(guān)系

本試驗(yàn)主要聚焦于冬瓜上、中、下部位的糖類物質(zhì)以及相關(guān)酶活的研究上，研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，冬瓜的外層、中層和內(nèi)層的可溶性固形物存在顯著差異，為外層＞中層＞內(nèi)層[44]，但是目前對冬瓜外層、中層和內(nèi)層的糖類物質(zhì)及酶活的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律還不清楚；此外，鮮少有關(guān)于黑皮冬瓜貯藏期品質(zhì)變化的研究，下一步可以從上述2個(gè)方面著手進(jìn)行探究。