液相色譜-質譜-質譜聯用儀測定花生油中黃曲霉毒素B1

周 琴，劉新月，李紹仙，張曉花，譚文涵

（普洱市質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南普洱 665000）

花生油含有豐富的不飽和脂肪酸，其中油酸能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而不會破壞高密度脂蛋白，有助于維持血脂平衡，預防心血管疾病[1]。此外，油酸還具有抗炎、預防肥胖、預防衰老、預防動脈硬化和增強自身免疫力的功能[2-3]。然而，在對人體有益的同時，花生油也存在安全隱患。黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是造成花生油污染的主要原因之一[4]，在自然界中其主要以黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2存在，具有強毒性、致癌性、致畸性和致突變性，而黃曲霉毒素B1（AFB1）含量最高[5-6]。何景等[7]2019年在抽檢北京小包裝花生油時，黃曲霉毒素檢出率為26.67%。胡振等[8]在對2016—2017年廣西14個地級市抽檢食用植物油樣品時發(fā)現，花生油中黃曲霉毒素B1檢出率達到8.85%，花生油合格率僅為87.83%。真菌毒素是對人和動物有嚴重慢性毒性的物質[9]，如果大量攝入或長期少量攝入黃曲霉毒素，可能會導致慢性中毒、增加致癌風險。因此，研究花生油中黃曲霉毒素B1的檢測方法具有重要意義。

黃曲霉毒素檢測方法有酶聯免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[10]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11]等，酶聯免疫吸附法簡單、快速、特異性高，但假陽性較多；高效液相色譜法具有良好的準確性和高靈敏度，但需要衍生，檢測周期長，且較浪費溶劑。液相色譜-質譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS）特異性強，定性定量準確，檢出限低，從而被廣泛應用于農殘、獸殘以及真菌毒素類的痕量檢測領域[12-15]。黃曲霉毒素的離子化狀態(tài)可利用電噴霧離子源實現，電噴霧離子源有正、負離子兩種模式，在正離子模式下效果最好[16]，因此，黃曲霉毒素離子化模式為ESI+。黃曲霉毒素凈化小柱包括兩個類型：多功能凈化柱與免疫親和柱。其中，多功能凈化柱采用復合材料，可以吸附蛋白質、色素等[16]。盡管這種方法的凈化速度相對較快，但不能全面有效地消除干擾物質。因此，在實際實驗中，多使用免疫親和柱來凈化樣品。本研究利用液相色譜-質譜-質譜聯用儀對花生油中黃曲霉毒素B1進行定量分析，并對實驗條件進行了探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質譜-質譜聯用儀（3200QTRAP，美國AB Scies）；色譜柱（phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A，100 mm×3.0 mm）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司)；渦旋攪拌混勻器（英國Grant公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒）；IKA HS501振蕩器（德國IKA儀器設備有限公司）；N-EVAP-24氮吹儀（美國Organomation公司)；微量可調移液槍（0.1～1.0 mL，德國Eppendorf公司）。

花生油，購于沃爾瑪超市。黃曲霉毒素B1（100 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；黃曲霉毒素B1內標液（0.5 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國 Merck 公司）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（普瑞邦公司）；質控樣[MRM-AO，質控值范圍為（12.44±1.38）μg·kg-1，普瑞邦]；甲酸（分析純，阿拉丁公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準使用液配制

準確移取1 mL濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，用甲醇定容至10 mL，配制濃度為10 μg·mL-1的標準儲備液，再準確移取1 mL濃度為 10 μg·mL-1的標準儲備液用甲醇定容至10 mL，配制濃度為1 μg·mL-1的標準中間液，分別吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL和20 μL標準中間液于1 mL進樣瓶中，并同時加入40 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內標液，用初始流動相定容至1 mL配制系列標準工作液濃度為1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入20 μL濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標準品和200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內標液，加入20 mL乙腈-水溶液（80+20），渦旋混勻，置于振蕩器振蕩20 min，離心，取上清液備用。準確移取4 mL上清液，加入46 mL 0.1%吐溫-20 PBS溶液混勻，將待凈化液轉移至50 mL注射器筒內，以恒定流速流經已活化的免疫親和柱，20 mL超純水淋洗免疫親和柱，真空泵抽干。2 mL甲醇洗脫黃曲霉毒素B1免疫親和柱，真空泵抽干全部親和柱，在水浴條件下將洗脫液濃縮至近干，初始流動相定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，濾入樣品瓶上機測定。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl-100A色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm），進樣量10.0 μL；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫35 ℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質譜條件：離子化模式ESI+，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；掃描方式多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 結果與分析

2.1 儀器分析參數

將體積濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1和內標單標分別通過質譜儀所配的外置進樣泵進樣，分別尋找其母離子和子離子并優(yōu)化碰撞電壓和去簇電壓。黃曲霉毒素B1及其內標在串聯質譜上的檢測參數見表2，黃曲霉毒素B1及其內標基質標準溶液的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1及其內標基質標準溶液的總離子流色譜圖

表2 黃曲霉毒素B1及其內標的LC-MS/MS檢測參數

2.2 方法線性范圍和檢出限

在1.2.3儀器條件下，根據1.2.1配制的系列標準工作液：1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、6 ng·mL-1、8 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1進樣分析；工作曲線橫坐標為目標物質量濃度C（ng·mL-1）；工作曲線縱坐標為黃曲霉毒素B1峰面積與內標峰面積之比。圖2為黃曲霉毒素B1標準曲線所擬合的線性方程。由圖2可知該檢測方法在1～20 ng·mL-1的質量濃度內線性關系良好，相關系數R2為0.999 3。

圖2 黃曲霉毒素B1標準曲線

2.3 方法的準確度和精密度

在花生油空白基質中分別加入3個水平的黃曲霉毒素B1標準品，混勻1 min，使花生油空白基質與所加入的標準品充分接觸后，加入200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內標液，按1.2.2中的方法充分提取和凈化后檢測。每個進行6次平行實驗，計算其平均回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以考察方法的準確度和精確度，結果見表3。

表3 花生油中黃曲霉毒素B1的加標回收率及其相對標準偏差（n=6）

由表3可知，在不同加標水平下，黃曲霉毒素B1的回收率在94.1%～107.4%，相對偏差（RSD）為5.6%～9.3%，回收率滿足《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）食品理化檢驗中回收率要求即加標量小于0.1 mg·kg-1時回收率為60%～120%，相對標準偏差小于15%。表明該方法的回收率和精密度滿足花生油中黃曲霉毒素B1殘留檢測的要求。

2.4 質控樣測定

將所購質控樣采用該方法進行測定，測定結果為13.12 μg·kg-1，質控樣質控值為（12.44±1.38）μg·kg-1，測定值在質控值范圍內，表明該方法對花生油中黃曲霉毒素B1陽性樣品的測定具有較高的準確性，適用于實驗室中花生油中黃曲霉毒素B1的準確定量分析。

3 結論

本研究建立了花生油中黃曲霉毒素B1的LCMS/MS測定方法，樣品前處理采用免疫親和柱技術，該方法無需進行衍生，簡便快捷、靈敏度高，特異性強、準確度和精密度均滿足定量分析的要求。在1～20 ng·mL-1線性內呈良好線性關系（R2為0.999 3），在2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加標水平下，回收率在94.1%～107.4%，相對標準偏差（n=6）為5.6%～9.3%，采用該方法測定花生油中黃曲霉毒素質控樣，檢測結果在質控樣質控值范圍內。因此，該方法可用于花生油中黃曲霉毒素B1的快速檢測。