食品檢驗中微生物檢測技術的應用

劉 軻，張芬鵲，賀 娜

（1.延安市食品質量安全檢驗檢測中心，陜西延安 716000；2.渭南市農產(chǎn)品質量安全檢驗檢測中心，陜西渭南 714000；3.延安市藥品檢驗所，陜西延安 716000）

食品安全是公眾健康和社會穩(wěn)定的重要組成部分，而微生物污染是導致食品相關疾病和食品召回的主要原因之一[1]。因此，準確、高效地檢測食品中的微生物污染至關重要。隨著科學技術的進步，食品檢驗中的微生物檢測技術得到了廣泛的應用和發(fā)展。食品中的微生物污染包括食源性病原菌、腐敗菌、病毒和寄生蟲等，它們可能導致食用者產(chǎn)生食物中毒、食源性感染和其他健康問題[2-3]。為了保障公眾的食品安全，食品行業(yè)和監(jiān)管機構不斷探索和引入新的微生物檢測技術，以便及早發(fā)現(xiàn)和控制潛在的食品安全風險。本論文旨在對食品檢驗中微生物檢測技術的應用進行深入研究，關注各種微生物檢測方法的原理、流程和優(yōu)勢，并探討它們在食品檢驗中的具體應用。通過深入了解微生物檢測技術的應用，為食品行業(yè)和監(jiān)管機構提供有價值的指導和決策支持，以確保食品的質量和安全，保護公眾的健康。

1 食品安全與微生物污染的關系

微生物污染與食品安全密切相關，食品中存在的微生物可以引發(fā)食物中毒和傳染疾病。因此，對食品中的微生物進行檢測和控制非常重要。食品生產(chǎn)和加工過程中的衛(wèi)生管理、適當?shù)募訜岷蛢Υ鏃l件以及微生物檢測技術的應用都是確保食品安全的關鍵因素。以下是威脅食品安全的幾種微生物污染因素。

（1）食源性病原菌。食品中可能存在的病原菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌等，它們主要通過糞便污染食品或經(jīng)不潔的加工環(huán)境進入食物中，攝入食品中的病原菌可導致胃腸道疾病，引起腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀。

（2）腐敗菌和變質標志物。食品腐敗常由細菌引起，如產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗酵母，它們會分解食品中的營養(yǎng)成分，產(chǎn)生惡臭氣味，并產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物。這些細菌和代謝產(chǎn)物可能會導致食品變質，降低食品的質量和營養(yǎng)價值。

（3）致病病毒和寄生蟲。除了細菌外，食品中也可能存在病毒和寄生蟲，如諾如病毒、肝炎病毒和鉤蟲。這些病原體可以通過未經(jīng)充分加熱處理的食品（如生肉、生蔬菜）傳播，攝入被感染的食物后，人體可能出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、黃疸等癥狀。

（4）毒素產(chǎn)生菌。一些細菌可以在食品中產(chǎn)生毒素，如產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的肉毒桿菌。這些毒素通常無法通過加熱殺滅，因此即使食物在烹飪過程中細菌被殺死，毒素仍可能存在，食用后可能導致嚴重的中毒癥狀。

2 微生物檢測技術方法及流程

2.1 微生物檢測技術方法

2.1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是最常用的微生物檢測技術之一。該技術需要將食品樣品在特定培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并利用細菌、真菌和酵母等微生物的生長特性對樣本進行鑒定[4]。這種方法需要較長的培養(yǎng)時間（通常需要24～48 h或更長時間），但具有較高的特異性和可靠性。

2.1.2 分子生物學方法

分子生物學方法利用微生物的DNA或RNA來進行檢測和鑒定。其中，聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是最常用的技術之一，它可以通過擴增微生物的基因片段快速檢測和定量微生物[5]。實時定量PCR是一種改進的PCR技術，可以實時監(jiān)測擴增反應，從而提供更精確的結果。循環(huán)介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種在恒溫條件下進行擴增的方法，具有較高的特異性和較快的檢測速度。

2.1.3 免疫學方法

免疫學方法利用抗體與微生物的抗原結合進行檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種常用的免疫學方法，可以通過測量免疫反應生成的信號來檢測微生物。另外，免疫層析試紙法是一種簡便快速的免疫學方法，通常用于現(xiàn)場快速檢測。

2.1.4 快速檢測技術

快速檢測技術結合了多種方法，旨在更快地提供檢測結果。其中，基于生物傳感器的檢測方法利用生物材料（如細胞、酶）與目標微生物的特定反應來產(chǎn)生電信號或光信號，并通過傳感器檢測確定目標微生物的數(shù)量?；诩{米材料的檢測方法利用納米顆粒的特殊性質，如表面增強拉曼散射（Surface Enhancement of Raman Scattering，SERS）或熒光增強效應，以此來實現(xiàn)微生物的快速檢測。

2.2 微生物檢測流程

（1）進行樣品采集，從目標食品中采集代表性樣品，確保采集樣品時遵循衛(wèi)生規(guī)范，以防止交叉污染。

（2）對采集的食品樣品進行預處理，進行樣品的稀釋、浸泡、離心等，以去除可能存在的干擾物質，如殘留農藥、抑制物質等。

（3）對樣品進行適當?shù)呐囵B(yǎng)處理，以增加微生物的數(shù)量，根據(jù)微生物的形態(tài)學、生理學和生物化學特征，使用適當?shù)蔫b定方法來確定微生物的種類。如果需要更精確的檢測結果，可以使用分子生物學方法進行微生物檢測，包括DNA或RNA提取、PCR擴增、實時定量PCR等，也可以利用抗體與微生物的抗原結合來進行免疫監(jiān)測，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫層析試紙法等。

（4）根據(jù)檢測結果進行數(shù)據(jù)分析及解讀，根據(jù)相關標準或法規(guī)確定微生物數(shù)量是否符合安全要求。

（5）生成詳細的檢測報告，包括樣品信息、檢測方法、檢測結果和解讀以及可能的建議措施。

3 食品檢驗中微生物檢測技術的具體應用

3.1 實時定量PCR檢測食源性病原菌

實時定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）檢測食源性病原菌具有高度敏感性、快速性、特異性、定量能力、自動化和高通量性、可靠性和重復性等優(yōu)勢。它能夠提供早期警示、多重檢測和檢測非活躍狀態(tài)的微生物，適用于各種食品樣品檢測，這使得qPCR成為食品檢驗中微生物檢測的重要工具，有助于確保食品安全，保護公共健康。

在實時定量PCR檢測食源性病原菌的過程中，首先根據(jù)檢測目的和特定要求，選擇要檢測的食源性病原菌。例如，選擇沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7或單核細胞增生李斯特菌等。從食品樣品中采集代表性樣品，并進行必要的預處理，包括樣品的稀釋、攪拌、研磨或其他樣品制備方法，以獲得合適的樣品溶液用于后續(xù)的DNA提取。使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒或其他適用的提取方法，從樣品中提取目標病原菌的DNA，對于RNA病原菌如諾如病毒，則需要進行逆轉錄反應將RNA轉錄成cDNA，以便進行后續(xù)的PCR分析。

準備qPCR反應體系，包括引物（特異性序列）和探針（通常帶有熒光標記），用于擴增和檢測目標病原菌的特定基因片段。確?？刂平M包括正控樣品（含有目標病原菌DNA的樣品）和負控樣品（不含目標病原菌DNA的樣品）。在qPCR儀器中運行反應，并監(jiān)測熒光信號的增加情況，該信號與擴增的目標基因片段的數(shù)量成正比，通過相對定量或絕對定量方法，最終確定樣品中目標病原菌的數(shù)量。

根據(jù)標準曲線或已知濃度的參考樣品，將熒光信號轉化為目標病原菌的數(shù)量；根據(jù)設定的閾值，判斷樣品為陽性或陰性，并計算病原菌的濃度。生成詳細的監(jiān)測結果報告，其中包括樣品信息、檢測方法、檢測結果、病原菌的濃度等。如果檢測結果表明食品中存在食源性病原菌的污染，應通過追溯措施來確定污染源，并采取適當?shù)目刂拼胧?，以確保食品的安全性和質量。

3.2 GC-MS技術檢測食品中的腐敗菌和變質標志物

氣相色譜-質譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術是一種聯(lián)用技術，將氣相色譜（GC）和質譜（MS）兩種分析技術結合在一起，用于分離、鑒定和定量分析復雜混合物中的化合物。GC-MS技術在食品中腐敗菌和變質標志物的檢測中具有高靈敏度、高選擇性、定性定量分析的優(yōu)勢，能夠適應不同類型的食品樣品檢測，提供快速分析結果，為食品安全和質量控制提供了可靠的工具。

使用GC-MS技術檢測食品中的腐敗菌和變質標志物時，首先需要收集食品樣品，如肉類、魚類、奶制品等，并進行適當?shù)奶幚恚ㄇ懈?、研磨或溶解等），以便提取目標化合物。使用溶劑提取、脂肪提取或固相微萃取等技術，將目標化合物從食品樣品中提取出來；將提取得到的樣液注入GC系統(tǒng)中，GC利用樣品中化合物的揮發(fā)性差異將化合物分離出來。常用的氣相色譜柱包括非極性柱、極性柱或選擇性柱，根據(jù)目標化合物的特性進行選擇。通過與GC聯(lián)用的質譜儀，對分離得到的化合物進行檢測和鑒定。將分離的化合物逐個引入質譜儀，分析化合物的質譜圖譜，每種化合物都具有獨特的質譜圖譜，可與數(shù)據(jù)庫中的標準譜進行比對，以鑒定化合物的類別。根據(jù)GC-MS的結果，分析和解釋樣品中存在的化合物，通過比對標準庫中的譜圖確定化合物的身份和含量。

在監(jiān)測食品中的腐敗菌和變質標志物時，GC-MS技術可以檢測和鑒定多種揮發(fā)性有機化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs），如醛類、酮類、醇類、酸類和硫化合物等。這些化合物通常與食品的腐敗和變質過程密切相關，通過分析這些化合物的質譜圖譜可以大致確定食品樣品的腐敗程度和變質狀態(tài)。

3.3 PCR/RT-PCR技術檢測食品中的病毒和寄生蟲

聚合酶鏈反應（PCR）和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）是兩種常用的分子生物學技術，用于檢測和擴增DNA或RNA序列。它們在食品檢測中被廣泛應用，具有高度敏感性、特異性和定量能力，能夠快速、準確地檢測和定量食品中的致病微生物或病原體。這些優(yōu)勢使得PCR/RT-PCR成為食品安全監(jiān)測和控制中不可或缺的工具。

通過PCR/RT-PCR方法檢測食品中的病毒和寄生蟲時，要從食品樣品中提取病毒核酸，并進行樣品處理。對食品樣品進行攪拌、離心和過濾等加工和處理，去除固體顆粒和雜質，并提取病毒核酸。使用商業(yè)化的RNA/DNA提取試劑盒，按照廠家提供的指南進行操作，提取食品樣品中的病毒RNA或DNA，用于后續(xù)的PCR/RT-PCR分析，提取步驟通常包括細胞破碎、核酸結合、洗滌和洗脫等。如果目標病毒是RNA病毒，需要進行反轉錄（RT）步驟將RNA轉錄為相應的cDNA，使用逆轉錄酶（RT酶）和適當?shù)囊镞M行反轉錄反應。使用適當?shù)囊锖蚉CR/RT-PCR反應體系，進行病毒核酸的擴增反應。引物的選擇應基于目標病毒的特定序列，反應體系包括DNA/RNA模板、引物、酶（如聚合酶）、緩沖液和核酸擴增所需的核苷酸。

為了增加PCR/RT-PCR檢測的靈敏度，應采用前處理步驟，包括預擴增或使用嵌合引物，以增加目標基因的拷貝數(shù)或縮小擴增目標的大小。擴增反應完成后通過凝膠電泳或其他檢測方法分析PCR/RTPCR產(chǎn)物，凝膠電泳可用于檢測擴增產(chǎn)物的大小和質量。此外，可以使用DNA探針或比色劑等方法進行陽性結果的特異性確認。通過與已知的陽性對照樣品進行比較，確認食品樣品中是否存在目標病毒；使用定量PCR/RT-PCR方法來確定目標病毒的數(shù)量，從而評估食品樣品中的病毒負載水平。

在PCR/RT-PCR檢測中，質量控制至關重要，包括使用對照樣品進行檢測，以驗證試劑是否無污染，同時評估檢測過程中的假陽性結果。需要注意的是，不同病毒的檢測方法可能會有所不同，因此在實際應用中，需要根據(jù)目標病毒的特性和檢測要求進行相應的優(yōu)化及調整。此外，PCR/RT-PCR方法需要特定的設備和實驗條件，并且對操作者的技術要求較高，需要在實驗室環(huán)境中進行。

4 結語

食品檢驗中微生物檢測技術的應用研究對于確保食品安全至關重要。本文綜述了不同微生物檢測技術在食品檢驗中的應用，重點介紹了實時定量PCR檢測食源性病原菌、GC-MS技術檢測食品中的腐敗菌和變質標志物以及PCR/RT-PCR技術檢測食品中病毒和寄生蟲的原理、流程和優(yōu)勢。隨著技術的不斷發(fā)展和改進，微生物檢測技術在食品檢驗中的應用將更加準確、快速和便捷。未來，期待更多新技術出現(xiàn)，以滿足食品安全監(jiān)管的需求。