筍殼魚源柱狀黃桿菌的分離鑒定及致病性和藥物敏感性

劉麗娟 王紅莉 王亞軍 任燕 王慶 石存斌 張德鋒

摘要：【目的】明確2022年5月廣東省珠海市某養(yǎng)殖場筍殼魚爛鰓病的病原，為防控筍殼魚相關(guān)病害提供參考依據(jù)?！痉椒ā繌幕疾」S殼魚的腐爛鰓絲、腎臟和體表病灶等部位分離細菌，并純化優(yōu)勢菌落，通過PCR方法擴增分離菌株的16S rRNA序列并進行測序分析，同時構(gòu)建該基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，鑒定患病筍殼魚的病原菌。選取代表菌株Om2202進行毒力基因檢測和斑馬魚人工感染試驗。測定中草藥和消毒劑對分離菌株Om2202的抑菌和殺菌活性，分析菌株Om2202的致病性和藥物敏感性?！窘Y(jié)果】從患病魚鰓部和腎臟分離到的優(yōu)勢菌落呈細長的彎曲或直桿狀，菌體表面未見鞭毛和菌毛，有莢膜，有胞外分泌物；通過特異性PCR檢測和16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，結(jié)合菌落形態(tài)分析結(jié)果，確定分離菌株Om2202為柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）。毒力基因檢測結(jié)果顯示，菌株Om2202攜帶gldD、hly、cslA、ompA和chiA等11種毒力相關(guān)基因。斑馬魚致病性試驗結(jié)果顯示，菌株Om2202對斑馬魚具有較強致病性，其LC50為7.50×106 CFU/mL。藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，Om2202菌株對蘆薈大黃素、大黃素和苯扎溴銨等藥物敏感，對連翹精油、二氧化氯、蛋氨酸碘和過氧化鈣等藥物不敏感?！窘Y(jié)論】引起筍殼魚爛鰓的主要致病菌為柱狀黃桿菌，屬于廣泛流行的基因Ⅱ型菌株，且攜帶大量的毒力相關(guān)基因，對斑馬魚具有較強的致病性，可用蘆薈大黃素、大黃素和苯扎溴銨等藥物進行防控。

關(guān)鍵詞：筍殼魚；柱狀黃桿菌；分離鑒定；致病性；藥物敏感性

中圖分類號：S943? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2023）02-0638-09

Abstract：【Objective】In order to clarify the pathogen of gill rot of Oxyeleotris marmoratus in a farm in Zhuhai City， Guangdong Province in May 2022， and to provide reference for prevention and control of the related diseases of O. marmoratus. 【Method】Bacteria were isolated from the rotten gill， kidneys and surface ulceration of the diseased fish， and the dominant pathogen was purified， and the 16S rRNA gene of the isolate was amplified by PCR， and then was sequenced and analyzed.Furthermore， phylogenetic tree of the 16S rRNA gene was constructed to identify pathogenic bacteria. A representative strain Om2202 was selected for detection of virulence genes and artificial infection test of Danio rerio. In addition， the antibacterial and bactericidal activities of Chinese herbal medicines and disinfectants against the isolate Om2202 were determined， and the pathogenicity and drug susceptibility of strain Om2202 were analyzed. 【Result】The dominant strains isolated from the gill and kidney of the diseased fish were slender curved or straight rod-like， without flagella and fimbriae， with capsules and extracellular secretions. The isolate Om2202 was identified as Flavobacterium columnare based on specific PCR， phylogenetic tree analysis of 16S rRNA gene， and colony morphology analysis. The results of detection of virulence genes showed that the strain Om2202 carried 11 virulence-related genes including gldD，hly， cslA， ompA and chiA. The results of pathogenicity test showed that Om2202 strain had strong pathogenicity to D. rerio， and its LC50 was 7.50×106 CFU/mL. The results of drug susceptibility test showed that strain Om2202 was sensitive to aloe-emodin， emodin and benzalkonium bromide， but not sensitive to Forsythia suspensa essential oil， chlorine dioxide， methionine iodine and calcium peroxide. 【Conclusion】F. columnare is the main pathogenic bacteria causing the gill rot of O. marmoratus， which belongs to the widespread genotype II and carries a large number of virulence-related genes. It has a strong pathogenicity to D. rerio and can be controlled with aloe-emodin， emodin and benzalonium bromide.

Key words：Oxyeleotris marmoratus； Flavobacterium columnare； isolation and identification； pathogenicity； drug susceptibility

Foundation item：China Agriculture Research System-Bulk Freshwater Fish Industry（CARS-45）；Guangdong Provincial Special Fund For Modern Agriculture Industry Technology Innovation Team（2019KJ150）；Guangzhou Science and Technology Plan Project （201904020004）

0 引言

【研究意義】筍殼魚是尖塘鱧屬（Oxyeleotris）魚類的俗稱，包括云斑尖塘鱧（O. marmoratus）、線紋尖塘鱧（O. lineolatus）和尾斑尖塘鱧（O. urophthalmus）等，主要分布在東南亞國家及澳洲大陸地區(qū)（唐邵林等，2018；鄧海燕等，2021）。目前我國人工養(yǎng)殖的主要是云斑尖塘鱧（俗稱泰國筍殼魚）和線紋尖塘鱧（俗稱澳洲筍殼魚），以及由云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧雜交而成的雜交筍殼魚。筍殼魚因肉質(zhì)細嫩、無肌間刺、味道鮮美，已成為一種具有重要經(jīng)濟價值且深受廣大養(yǎng)殖戶和消費者青睞的魚類，市場售價通常在100～300元/kg（鄧海燕等，2021）。筍殼魚在我國廣東和海南地區(qū)已實現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖，且養(yǎng)殖面積逐步擴大，年產(chǎn)量已達10多萬t（樊佳佳等，2022）。柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中淡水魚類常見的病原菌，也是魚類細菌性爛鰓病的主要致病菌，感染的宿主范圍較廣（Farmer，2004；Klesius et al.，2008；Dikesavalu et al.，2015；Patra et al.，2016；Ravindra et al.，2019）。隨著我國筍殼魚養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度不斷提高，包括爛鰓病在內(nèi)的病害也日漸增多，危害程度不斷加劇，制約了筍殼魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，分離和鑒定筍殼魚腐爛鰓病原，分析其致病性，并進行優(yōu)勢菌株Om2202毒力基因檢測和斑馬魚（Danio rerio）人工感染試驗，對筍殼魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】2009年8—10月，廣東省多個水產(chǎn)養(yǎng)殖場曾爆發(fā)云斑尖塘鱧虹彩病毒病，死亡率高達85%（Wang et al.，2011）。國內(nèi)已報道養(yǎng)殖筍殼魚的病原主要有傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）（陳智光等，2018）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophi-la）、溫和氣單胞菌（A. sobria）、維氏氣單胞菌（A. veronii）（宋長江，2019；鄧海燕等，2021）、虹彩病毒（Turbot reddish body irido virus，TRBIV）和錨頭鳋等（王學耕等，2023）。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖工作者為建立一系列筍殼魚病害防治技術(shù)做了大量工作，其中疫苗接種是預防病毒病最有效的手段（麥耀寶等，2018；唐紹林等，2018；陳灼均，2020）。周陽等（2019）從轉(zhuǎn)錄組水平分析傳染性脾腎壞死病毒和彈狀病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）二聯(lián)滅活疫苗誘導的云斑尖塘鱧脾臟差異表達基因，為闡明云斑尖塘鱧免疫應(yīng)答機制提供了依據(jù)，也證實魚類疫苗接種可產(chǎn)生免疫保護作用。Guo等（2020）構(gòu)建的可誘導魚類適應(yīng)性免疫二價滅活疫苗，能降低筍殼魚感染虹彩病毒和彈狀病毒的感染概率。與國內(nèi)一樣，隨著筍殼魚集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，國外筍殼魚寄生蟲?。⊿zékely et al.，2009）、病毒?。≒rasankok et al.，2005）和細菌?。↙am et al.，2008）等疾病的爆發(fā)也日益頻繁。柱狀黃桿菌為革蘭氏陰性菌，是柱狀黃桿菌病（細菌性爛鰓?。┑牟≡˙ader and Starliper，2002；Declercq et al.，2013），具有多種毒力因子（Declercq et al.，2013；李燁等，2015；Bhattacharya et al.，2020）及多個基因型（Ⅰ～Ⅳ型）（Lafrentz et al.，2018；Sebastiao et al.，2021），是一種危害極廣的細菌性疾病病原，可感染多種魚類，并導致柱狀黃桿菌?。╖hou et al.，2015； Ravindra et al.，2019；Chen et al.，2020），造成嚴重的經(jīng)濟損失。【本研究切入點】目前，針對筍殼魚爛鰓病病原菌分離、鑒定及感染柱狀黃桿菌的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對廣東省珠海市某養(yǎng)殖場患爛鰓病的筍殼魚進行疾病診斷，通過細菌分離鑒定及致病性分析，明確其主要病原菌，并選取代表菌株Om2202進行毒力基因檢測和斑馬魚人工感染試驗，同時測定分析菌株Om2202的抑菌和殺菌活性，旨在為筍殼魚爛鰓病的診斷和利用綠色藥物防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病筍殼魚于2022年5月7日采自廣東省珠海市某筍殼魚養(yǎng)殖場，人工感染試驗所用健康斑馬魚由中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所水生實驗動物研究中心提供。蛋白胨和酵母粉購自美國賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）；牛肉膏購自北京索萊寶科技有限公司；醋酸鈉、氯化鋇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鐵和碳酸氫鈉購自上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。消毒劑二氧化氯購自新鄉(xiāng)市華畜商貿(mào)有限公司；苯扎溴銨溶液、戊二醛苯扎溴銨購自江蘇漁醫(yī)生水產(chǎn)科技有限公司；濫申停購自南京漁豐生物科技有限公司；蛋氨酸碘購自廣州先得生物技術(shù)有限公司；過氧化鈣購自廣東省湛江市永昂生物科技有限公司。連翹精油購自四川省維克奇生物科技有限公司；大黃素和黃連素購自北京華越洋生物科技有限公司；蘆薈大黃素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 藥物、培養(yǎng)基及菌液制備 中草藥溶液制備：連翹精油以無水乙醇稀釋至1024.0 μg/mL，0.22 μm濾膜過濾除菌后備用；黃連素、大黃素和蘆薈大黃素以DMSO溶解至51.2 mg/mL，以無菌水稀釋50倍至1024.0 μg/mL備用。消毒劑溶液制備：將6種消毒劑分別用無菌水稀釋至8192.0 mg/L，通過0.22 μm濾膜分別過濾除菌。培養(yǎng)基制備：①參考黃錦爐等（2010）的方法制備Shieh液體培養(yǎng)基，稱取蛋白胨5.0 g、酵母提取物0.5 g、硫酸鎂0.3 g、牛肉膏0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、氯化鋇0.01 g、醋酸鈉0.01 g、碳酸氫鈉0.05 g、磷酸二氫鉀0.05 g、氯化鈣0.0067 g和硫酸鐵0.001 g加入1000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2，121 ℃下滅菌25 min；②在Shieh營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基原配方基礎(chǔ)上配置Shieh固體純化培養(yǎng)基，加入1.5%瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH至7.2，121 ℃下滅菌25 min。分離菌培養(yǎng)及菌懸液制備：將純化后的分離菌接種于Shieh固體培養(yǎng)基進行活化，28 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，接種于Shieh液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取新鮮菌液離心獲得菌體，使用無菌PBS重懸，調(diào)整菌液濃度。

1. 2. 2 樣品采集和細菌分離培養(yǎng) 選取具有典型爛鰓或體表潰爛癥狀的筍殼魚，在無菌操作條件下取其鰓絲、體表病灶和腎臟組織劃線接種于Shieh平板，28 ℃培養(yǎng)48 h，并挑取平板上優(yōu)勢形態(tài)的單菌落繼續(xù)分離劃線3次直至獲得純化的單克隆，收集菌體并以培養(yǎng)基重懸后加入終體積為15%的甘油，保藏于-80 ℃冰箱備用。

1. 2. 3 分離菌株鑒定 形態(tài)學方法：將分離菌株接種于Shieh平板上28 ℃培養(yǎng)48 h，然后挑取單克隆菌落接種至Shieh液體培養(yǎng)基，置于28 ℃搖床培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)12 h（200 r/min）；將菌液按1∶4（v/v）比例與無菌生理鹽水混合均勻，浸泡30 min，若膜外分泌物較多，則將浸泡時間酌情延長；制備電鏡負染標本：吸取約20.0 μL菌液滴于錫箔紙上，用尖頭鑷子夾取銅網(wǎng)邊緣，將支持膜面覆扣于菌液滴上停留2 min，用濾紙從銅網(wǎng)的邊沿吸去剩余菌液，滴加約20.0 μL的0.5%磷鎢酸染液于錫箔紙上，將銅網(wǎng)帶菌樣品面（即碳膜面）朝下覆扣于染液上，各染色30～45 s，以濾紙從銅網(wǎng)邊沿吸去剩余染液，自然晾干后進行透射電鏡觀察，并采集圖片。

分子生物學方法：將純化的分離菌株接種至Shieh液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，收集菌體，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過PCR擴增其16S rRNA序列。分離菌株的16S rRNA序列PCR擴增引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（戚建華等，2020），PCR產(chǎn)物預期大小約1500 bp。對陽性PCR擴增產(chǎn)物進行測序分析，并根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。通過柱狀黃桿菌特異性PCR引物（F：5'-CG GCTGGATCACCTCCTTTCTAG-3'和R：5'-TAAAGTG TTCTTTCTACTTGTTTG-3'）（Welker et al.，2005），對所有分離菌株進行特異PCR擴增。根據(jù)柱狀黃桿菌特異性PCR檢測和16S rRNA序列分析結(jié)果，對分離菌株進行種屬鑒定。

1. 2. 4 主要毒力基因檢測 通過PCR擴增檢測病原菌的主要毒力基因，包括gldD、gldG、gldJ、gldK、gldN、sprF、hly、cslA、ompA、chiA和col，其引物序列和擴增條件見表1。將與預期片段大小一致的PCR擴增產(chǎn)物片段進行測序驗證。

1. 2. 5 致病性試驗 參考Guz等（2014）的方法，選用成年斑馬魚（平均體質(zhì)量0.21±0.02 g）作為感染動物模型用于人工感染試驗。分離菌株活化后接種于Shieh液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心去除培養(yǎng)基后以無菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整濃度為1.20×108 CFU/mL，并依次稀釋2、4、8、16、32、64和128倍等7個濃度梯度，分別設(shè)為試驗1～7組，其對應(yīng)濃度依次為6.00×107、3.00×107、1.50×107、7.50×106、3.75×106、1.88×106和9.38×105 CFU/mL。以無菌生理鹽水為對照組，每組20尾斑馬魚，采用腹腔注射感染方式。試驗組每尾各注射10.0 μL菌液，對照組注射等體積無菌PBS。試驗期間持續(xù)增氧，水溫為（30±1）℃，連續(xù)觀察7 d，每天記錄各組斑馬魚的死亡情況，根據(jù)寇氏法（李翠萍等，2012）判定其半數(shù)致死濃度（LC50），觀察病癥并剖檢死亡個體，再次對人工感染后具有典型癥狀的病魚進行病原菌分離和鑒定。

1. 2. 6 藥物敏感性測定 參考陶莎等（2022）的方法測定中草藥和消毒劑對分離菌株的最小抑菌濃度（MIC），以確定抑菌效果。先將新鮮培養(yǎng)的菌株調(diào)整菌液濃度為2×106 CFU/mL備用，在96孔板中每孔加入50.0 ?L Shieh液體培養(yǎng)基后，再在首列孔中分別加入中草藥和消毒劑，以二倍稀釋法進行系列梯度稀釋，最后加入50.0 ?L菌液，此時每孔中的菌液濃度均為5.00×105 CFU/mL。陽性對照組僅加菌液不加藥物，陰性對照組僅加藥物不加菌液。28 ℃靜置培養(yǎng)36 h后，觀察藥敏結(jié)果，重復3次。分離菌株的培養(yǎng)液不易通過肉眼觀察判斷是否明顯變渾濁，因此以酶標儀測定其OD600是否有顯著變化，用于確定每種藥物對應(yīng)的MIC。

分別測定中草藥和消毒劑對分離菌株的最小殺菌濃度（MBC），以確定各藥物的殺菌效果。根據(jù)上述MIC試驗結(jié)果，選取MIC對應(yīng)小孔前的5個孔，分別吸取孔中的培養(yǎng)液100.0 ?L，均勻涂布于Shieh固體養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，觀察是否有菌落生長。在Shieh固體平板上無菌落生長則對應(yīng)的藥物濃度即為該藥對分離菌株的MBC。

2 結(jié)果與分析

2. 1 筍殼魚爛鰓病的細菌分離

患爛鰓病筍殼魚的體表有輕微腐爛，尤其是鰭條，病變嚴重的部位是鰓部，肉眼可見鰓絲末端腐爛并有少量淤泥附著（圖1）。使用Shieh培養(yǎng)基從筍殼魚爛鰓的病灶處可分離到大量淺黃色菌落，菌落扁平、類根狀、邊緣不規(guī)則和黏附性強（圖2）。從患病嚴重的筍殼魚腎臟組織中可分離到上述相似的菌落。根據(jù)分離菌株的菌落形態(tài)特征，選取從鰓絲分離純化的代表菌株Om2202進行后續(xù)試驗。對Om2202菌株進行電鏡負染觀察，結(jié)果顯示該菌呈細長的彎曲或直桿狀，菌體表面未見鞭毛和菌毛，有莢膜，有胞外分泌物（圖3）。

2. 2 筍殼魚爛鰓病細菌的鑒定

根據(jù)細菌的分離培養(yǎng)特性和形態(tài)特征可初步判斷分離菌株Om2202疑似為柱狀黃桿菌。以分離菌株的基因組DNA，通過PCR擴增其16S rRNA序列，通過BLAST比對分析可知，Om2202菌株16S rRNA序列與柱狀黃桿菌的相似性均達100.0%。構(gòu)建Om2202菌株16S rRNA序列與相近物種的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，發(fā)現(xiàn)該菌株與柱狀黃桿菌聚為一支，且屬于基因群Ⅱ型（圖4）。進行特異性PCR擴增，發(fā)現(xiàn)該菌株的PCR擴增片段大小與陽性參考菌株相同。綜合菌落形態(tài)和分子生物學鑒定結(jié)果，判定分離菌株Om2202為柱狀黃桿菌。

2. 3 分離菌株Om2202的毒力相關(guān)基因

以分離菌株Om2202的基因組DNA為模板，通過PCR檢測其攜帶毒力基因的情況。從圖5可看出，菌株Om2202的gldD、gldG、gldJ、gldK、gldN、sprF、hly、cslA、ompA、chiA和col毒力基因的PCR擴增結(jié)果均為陽性，目的條帶大小均符合預期，擴增產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對分析，與已知的以上11種基因序列相似性均在98.0%以上。說明菌株Om2202攜帶以上11種相關(guān)毒力基因，具有較強的致病性。

2. 4 分離菌株Om2202的致病性分析

斑馬魚作為模式動物，常用于開展水產(chǎn)動物病原菌感染試驗。以分離菌株Om2202不同濃度梯度菌懸液分別對健康斑馬魚進行腹腔注射感染，結(jié)果（表2）顯示，試驗組7的7 d累計死亡率為0；隨著菌液濃度的增加，試驗組斑馬魚的累計死亡率呈上升趨勢；試驗組1的斑馬魚腹腔注射后12 h內(nèi)即出現(xiàn)急性死亡現(xiàn)象，2 d內(nèi)的累計死亡率達100.0%；而試驗組7與對照組均未出現(xiàn)任何臨床癥狀及死亡現(xiàn)象。根據(jù)寇氏法計算，分離菌株Om2202的LC50為7.50×106 CFU/mL。人工感染Om2202菌株后患病斑馬魚的臨床癥狀主要表現(xiàn)為游動緩慢、反應(yīng)遲緩和攝食減少，胸腹部出現(xiàn)不同程度出血（圖6）。對人工感染發(fā)病的斑馬魚再次進行病原菌分離，經(jīng)16S rRNA序列PCR擴增鑒定為柱狀黃桿菌，因此，判定Om2202菌株是引起斑馬魚死亡的致病菌。

2. 5 菌株Om2202的藥物敏感性分析

由表3可知，不同中草藥對菌株Om2202的MIC和MBC存在差異。其中，蘆薈大黃素和大黃素對柱狀黃桿菌的MIC分別為1.0和2.0 μg/mL，MBC分別為64.0和32.0 μg/mL；黃連素對柱狀黃桿菌的MIC為8.0 μg/mL，MBC為64.0 μg/mL；連翹精油對柱狀黃桿菌的MIC為32.0 μg/mL，MBC為256.0 μg/mL。說明菌株Om2202對蘆薈大黃素和大黃素較敏感，對黃連素次之，對連翹精油不敏感。

由表4可知，同種消毒劑對Om2202的MIC和MBC基本一致。其中，苯扎溴銨對菌株Om2202的殺菌效果最好，其MIC和MBC均為4.0 mg/L；其次為戊二醛—苯扎溴銨和濫申停（主要成分為戊二醛-苯扎溴銨），其MIC和MBC均為32.0 mg/L；二氧化氯、蛋氨酸碘和過氧化鈣對柱狀黃桿菌的抑菌效果一般，其MIC分別為128.0和256.0 mg/L?？梢?，菌株Om2202對消毒劑苯扎溴銨最敏感，對二氧化氯、蛋氨酸碘和過氧化鈣不敏感。

3 討論

柱狀黃桿菌隸屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）黃桿菌綱（Flavobacteria）黃桿菌目（Flavobacteriales）黃桿菌科（Flavobacteriaceae）黃桿菌屬（Flavobacte-rium），為革蘭氏陰性菌，是柱狀黃桿菌?。毦誀€鰓?。┑牟≡˙ader and Starliper，2002；Declercq et al.，2013），具有滑動能力和團聚性，廣泛分布于世界各地的淡水環(huán)境和土壤中，是一種危害極廣的細菌性疾病病原。柱狀黃桿菌還能感染斑點叉尾鮰（Ictalurus Sertatus）（Dikesavalu et al.，2015）、鱖魚（Siniperca chuatsi）（Zhou et al.，2015）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）（Patra et al.，2016）、鯉（Cyprinus carpio）（Ravindra et al.，2019）、大西洋鮭（Salmo salar）（Chen et al.，2020）和草魚（Ctenopharyngodon idella）（Chen et al.，2020）等多種魚類，并導致魚類柱狀黃桿菌病。本研究綜合從患爛鰓病筍殼魚鰓絲分離獲得優(yōu)勢菌株Om2202的形態(tài)特征和分子生物學鑒定結(jié)果，確定其為柱狀黃桿菌，該菌對斑馬魚具有較強的致病性。此外，患爛鰓病筍殼魚內(nèi)臟組織中并未檢測到ISKNV病毒（結(jié)果未顯示）。因此，確定引起本研究中筍殼魚爛鰓和死亡的主要病原菌為柱狀黃桿菌。已有研究表明，柱狀黃桿菌具有多個基因型（Ⅰ～Ⅳ型），世界范圍內(nèi)流行的柱狀黃桿菌主要為基因Ⅰ型和Ⅱ型，而菌株Om2202屬于優(yōu)勢基因型Ⅱ型（Lafrentz et al.，2018；Sebastiao et al.，2021），表明該基因型柱狀黃桿菌的宿主范圍較廣。

硫酸軟骨素AC裂解酶是柱狀黃桿菌產(chǎn)生的一種降解酶類，可有效降解宿主組織細胞外基質(zhì)中的酸性多糖，有效促進柱狀黃桿菌對宿主的感染，因此學術(shù)界普遍認為硫酸軟骨素AC裂解酶是柱狀黃桿菌的毒力因子之一（Stringer-roth et al.，2002；Declercq et al.，2013）。溶血素作為細菌的一種重要毒力因子，在該細菌的致病機制中發(fā)揮著重要作用（Wiles and Mulvey，2013；李燁等，2015）。張曉林（2016）研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下幾丁質(zhì)酶基因突變株對草魚的侵染能力明顯弱于野生株，表明幾丁質(zhì)酶可能與柱狀黃桿菌的毒力有關(guān)。謝海俠（2005）研究發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，gldH基因缺失的菌株滑動能力喪失，分解幾丁質(zhì)能力下降，對魚體鰓部組織的粘附能力減弱。Li等（2017）研究表明，野生型柱狀黃桿菌缺失GldN時，其對斑馬魚、斑點叉尾鮰和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的毒力降低，表明滑動基因與柱狀黃桿菌的致病力密切相關(guān)。Laanto等（2014）、Bhattacharya等（2020）研究表明，柱狀黃桿菌的外膜蛋白（OMPs）在疾病傳播中起著關(guān)鍵作用，外膜蛋白可能是柱狀黃桿菌的毒力因子?？梢姡鶢铧S桿菌的致病性與其攜帶的相關(guān)毒力基因密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，菌株Om2202攜帶gldD、gldG、gldJ、gldK、gldN、sprF、hly、cslA、ompA、chiA和col等多種與幾丁質(zhì)酶、膠原酶、滑動性、溶血素、硫酸軟骨素和外膜蛋白等相關(guān)的毒力基因，且與強毒株的毒力基因型相同或相近（Barony et al.，2015），暗示該菌株具有較強的致病性；斑馬魚人工感染試驗結(jié)果顯示，菌株Om2202對斑馬魚具有較強的致病力，在高劑量感染條件下造成的死亡率達100.0%，可能與該菌株攜帶較多的毒力相關(guān)基因有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃素和消毒劑苯扎溴銨對柱狀黃桿菌的抑菌殺菌效果最佳。中草藥在防治細菌感染引起的疾病方面具有悠久歷史及良好的效果（Zhong et al.，2012；顧艷麗等，2022），在抗生素濫用導致細菌耐藥性日益嚴重的背景下，本研究推薦具有綠色、安全及無耐藥性等特點的蘆薈大黃素和大黃素作為防控柱狀黃桿菌的綠色候選藥物，以期在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中能更合理、更廣泛地利用中草藥。在水體消毒方面，本研究發(fā)現(xiàn)苯扎溴銨在體外對柱狀黃桿菌具有較好的抑菌效果，與劉麗娟等（2021）的研究結(jié)果相似，可作為水體消毒劑的候選藥物用于魚類柱狀黃桿菌病防控。

4 結(jié)論

柱狀黃桿菌是引起本次筍殼魚爛鰓的主要致病菌，該菌屬于廣泛流行的基因Ⅱ型菌株，且攜帶大量的毒力相關(guān)基因，對斑馬魚具有較強的致病性，藥敏試驗結(jié)果表明蘆薈大黃素、大黃素和苯扎溴銨等藥物可作為防控該病原菌的候選藥物。

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（責任編輯 思利華）