氣相色譜法測定乙酸阿比特龍中1，1，3，3-四甲基胍

宋小飛，王紅芳，張輝，申曉婷，柴青葉，游蓉麗

（山西振東制藥股份有限公司，山西 長治 046000）

乙酸阿比特龍，化學(xué)名稱為17-(3-吡啶基)-雄甾-5，16-二烯-3β-乙酸酯，是一種口服CYPI7-A1 抑制劑，通過抑制酶活性從而阻止睪酮合成，與潑尼松聯(lián)用，主要用于轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌和轉(zhuǎn)移性高風(fēng)險前列腺癌的治療[1?4]。

1，1，3，3-四甲基胍是一種揮發(fā)性胺類，而揮發(fā)性胺類常用作乙酸阿比特龍合成過程中的催化劑，可以改變反應(yīng)體系的pH 值，控制反應(yīng)速度，提高產(chǎn)品收率[5?6]。由于1，1，3，3-四甲基胍具有一定的毒性[7]，需控制其在藥物中的含量。

胺類主要采用氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行測定[8?11]。胺類具有較強(qiáng)堿性，在進(jìn)樣系統(tǒng)和色譜柱中有較強(qiáng)的表面吸附，從而導(dǎo)致色譜峰拖尾、重復(fù)性差、靈敏度低。解決這一問題的方法主要是采用特殊色譜柱及襯管、衍生化、添加無機(jī)鹽等[12?14]。目前采用氣相色譜法測定1，1，3，3-四甲基胍已有文獻(xiàn)報道[12]，是以乙腈為溶劑溶解樣品。而乙酸阿比特龍原料藥在乙腈中溶解度較低，無法滿足檢測要求，筆者通過優(yōu)化溶劑克服了1，1，3，3-四甲基胍測定過程中色譜峰拖尾和重復(fù)性差的問題[15?17]，建立了氣相色譜法測定乙酸阿比特龍中1，1，3，3-四甲基胍的方法，為化學(xué)原料藥中1，1，3，3-四甲基胍的質(zhì)量控制提供了技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：GC 7890B 型，配有氫火焰離子化(FID)檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：TB-215D 型，感量為0.01 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

乙酸阿比特龍樣品：批號為2109201，山西振東泰盛制藥有限公司。

乙酸乙酯：色譜純，北京百靈威科技有限公司。

N-甲基吡咯烷酮：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

N，N-二甲基甲酰胺：色譜純，北京伊諾凱科技有限公司。

N，N-二甲基乙酰胺：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

苯甲醇：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1，1，3，3-四甲基胍：含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99%，上海麥克林生化科技有限公司。

高純氮?dú)?、高純氫氣：純度均?9.999%(體積分?jǐn)?shù))，山西省長治炬能化工氣體有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：CP-Volamine 型毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.45 μm，美國安捷倫科技有限公司)；載氣：高純氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器：FID；檢測器溫度：300 ℃；柱溫：160 ℃；柱流量：2.0 μL/min；進(jìn)樣方式：溶液直接進(jìn)樣，分流比為10∶1；進(jìn)樣體積：1 μL；定量方法：色譜峰面積外標(biāo)法。

1.3 溶液配制

1，1，3，3-四甲基胍對照品貯備液：1 mg/mL，精密稱取1，1，3，3-四甲基胍0.05 g，置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至標(biāo)線，搖勻。

1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液：0.1 mg/mL，精密量取1，1，3，3-四甲基胍對照品貯備液0.5 mL，置于5 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至標(biāo)線，搖勻。

乙酸阿比特龍樣品溶液：0.1 g/mL，精密稱取乙酸阿比特龍樣品0.5 g，置于5 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

乙酸阿比特龍加標(biāo)樣品溶液：精密稱取乙酸阿比特龍0.5 g，置于5 mL 容量瓶中，加入1，1，3，3-四甲基胍對照品貯備液0.5 mL，用乙酸乙酯溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

將1，1，3，3-四甲基胍溶于乙酸乙酯中，制成0.1 mg/mL 的1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液，采用溶液直接進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜法測定，分別考察不同極性色譜柱(DB-1、DB-5、DB-624、DB-FFAP)對1，1，3，3-四甲基胍定量分析的影響。結(jié)果顯示，在4 種不同極性色譜柱中1，1，3，3-四甲基胍均拖尾嚴(yán)重，無法進(jìn)行定量分析。這是由于1，1，3，3-四甲基胍有較強(qiáng)的堿性，容易吸附于色譜柱而導(dǎo)致拖尾嚴(yán)重[12]。隨后考察了用于胺類分析的CP-Volamine型毛細(xì)管色譜柱，結(jié)果顯示1，1，3，3-四甲基胍色譜峰對稱度較好，拖尾因子小于2.0，故選用CP-Volamine 色譜柱。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于該方法為單成分1，1，3，3-四甲基胍的測定，柱溫程序宜采用等溫分析。將1，1，3，3-四甲基胍溶于乙酸乙酯中，制成0.1 mg/mL 的1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液。分別設(shè)置柱溫為140、150、160 ℃，考察不同柱溫時1，1，3，3-四甲基胍的色譜峰面積、峰高、理論塔板數(shù)及拖尾因子，結(jié)果見表1。由表1可知，隨著柱溫升高，1，1，3，3-四甲基胍色譜峰高增大，靈敏度增加，拖尾因子降低，理論塔板數(shù)增大，柱效增高，有利于1，1，3，3-四甲基胍的分析，由于1，1，3，3-四甲基胍沸點(diǎn)為160 ℃，柱溫不宜過高，故選擇柱溫為160 ℃。

表1 不同柱溫時1，1，3，3-四甲基胍的色譜峰面積、峰高、理論塔板數(shù)及拖尾因子

2.3 溶劑選擇

將1，1，3，3-四甲基胍溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制成0.1 mg/mL 的1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液。取適量的乙酸阿比特龍，溶于N，N-二甲基甲酰胺中，配制成0.1 g/mL 的乙酸阿比特龍樣品溶液。采用溶液直接進(jìn)樣法，按1.2色譜條件考察方法的系統(tǒng)適用性與定量準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，色譜柱中1，1，3，3-四甲基胍會產(chǎn)生殘留，影響后續(xù)樣品測定。依據(jù)中國藥典(四部)9102 藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則[14]，將1，1，3，3-四甲基胍控制限度確定為0.1%。按1，1，3，3-四甲基胍限量的50%、100%、150%制備9 份樣品溶液，并進(jìn)行測定，1，1，3，3-四甲基胍回收率為128.1%～158.7%，表明方法準(zhǔn)確度較差，不適用1，1，3，3-四甲基胍的定量分析，這可能是溶劑N，N-二甲基甲酰胺的基質(zhì)效應(yīng)較大所致。

分別考察N，N-二甲基乙酰胺、苯甲醇、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯作為溶劑對1，1，3，3-四甲基胍測定結(jié)果的影響，分別用上述4 種溶劑稀釋1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液，使其質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL，按1.2 色譜條件進(jìn)行分析，比較其色譜峰面積、峰高、理論塔板數(shù)、拖尾因子和分離度，結(jié)果見表2。

表2 不同種溶劑時1，1，3，3-四甲基胍的色譜峰面積、峰高、理論塔板數(shù)、拖尾因子及分離度

結(jié)果表明，采用苯甲醇作為溶劑時，苯甲醇中雜質(zhì)峰與1，1，3，3-四甲基胍色譜峰保留時間一致，影響1，1，3，3-四甲基胍測定；N-甲基吡咯烷酮中存在與1，1，3，3-四甲基胍色譜峰相鄰的雜質(zhì)峰，分離度為1.4，無法與1，1，3，3-四甲基胍色譜峰有效分離，進(jìn)行方法優(yōu)化的空間較小，不適合作為溶劑；而N，N-二甲基乙酰胺分子結(jié)構(gòu)及物理性質(zhì)與N，N-二甲基甲酰胺相似，且對照品溶液會發(fā)生殘留，影響后續(xù)進(jìn)樣分析，故不適合作為溶劑；采用乙酸乙酯作為溶劑時，1，1，3，3-四甲基胍色譜峰響應(yīng)值較高，理論塔板數(shù)不小于5 000，拖尾因子不大于2.0，分離度不小于1.5，對照品溶液進(jìn)樣后無殘留，故采用乙酸乙酯作為溶劑。

2.4 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

按照1.2 色譜條件，分別對溶劑空白、1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液、乙酸阿比特龍加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行測定，色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明，1，1，3，3-四甲基胍色譜峰理論塔板數(shù)大于5 000，與相鄰色譜峰分離度大于1.5，拖尾因子小于2.0，樣品基質(zhì)不干擾1，1，3，3-四甲基胍測定。

圖1 溶劑空白、對照品溶液和加標(biāo)樣品溶液色譜圖

2.5 線性方程與檢出限

精密量取一定量1，1，3，3-四甲基胍對照品貯備液，用乙酸乙酯稀釋成適宜質(zhì)量濃度的溶液，在1.2色譜條件下分別測定，以信噪比為3 確定方法檢出限，以信噪比為10確定定量限。

以定量限為起始濃度，分別精密量取1，1，3，3-四甲基胍對照品貯備液0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于5 只10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2色譜條件下分別測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算線性方程、相關(guān)系數(shù)。

1，1，3，3-四甲基胍質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果見表3。由表3可知，1，1，3，3-四甲基胍在質(zhì)量濃度為10.22～204.38 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4，方法檢出限為3.07 μg/mL，定量限為10.22 μg/mL。

表3 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗

精密稱取乙酸阿比特龍樣品9 份，分別加入適量的1，1，3，3-四甲基胍對照品貯備液，配制成低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別測定，結(jié)果列于表4。由表4可知，1，1，3，3-四甲基胍的回收率為97.9%～113.3%，平均回收率為107.5%，9 份樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%，表明方法的準(zhǔn)確度、精密度均較高。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗

取1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液、乙酸阿比特龍樣品溶液、乙酸阿比特龍加標(biāo)樣品溶液，分別在配制完成后第0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果見表5。由表5可知，1，1，3，3-四甲基胍對照品溶液室溫放置24 h，1，1，3，3-四甲基胍的平均色譜峰面積為63.19，色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%；乙酸阿比特龍樣品溶液放置24 h，均未檢出1，1，3，3-四甲基胍；乙酸阿比特龍加標(biāo)樣品溶液放置24 h，1，1，3，3-四甲基胍的平均色譜峰面積為62.34%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.86%，表明對照品溶液、乙酸阿比特龍樣品溶液、乙酸阿比特龍加標(biāo)樣品溶液室溫放置24 h，穩(wěn)定性良好。

表5 放置不同時間后溶液中1，1，3，3-四甲基胍峰面積測定結(jié)果

3 結(jié)語

建立了氣相色譜法測定乙酸阿比特龍中1，1，3，3-四甲基胍的分析方法，該方法操作簡單，專屬性好，準(zhǔn)確度高，為乙酸阿比特龍中1，1，3，3-四甲基胍的質(zhì)量控制提供了一定依據(jù)。