分散液相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法快速檢測(cè)水體中17種芳香胺

楊超，尹明明，戴維，徐穎

（江蘇省南京環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，南京 210013）

芳香胺是一類含有—NH2、—NH或其它含氮基團(tuán)的胺類化合物，其結(jié)構(gòu)中通常含有一個(gè)或多個(gè)苯環(huán)，按照取代基的種類、數(shù)目和位置的不同形成多種異構(gòu)體。這類化合物大多是高沸點(diǎn)的液體或低熔點(diǎn)的固體，在水中的溶解度小，易溶于有機(jī)溶劑，在空氣中易氧化變色。芳香胺普遍具有特殊的氣味，可通過呼吸道或消化道攝入人體，也能夠被皮膚快速吸收[1]，其生物毒性較大。環(huán)境中的芳香胺主要來(lái)源于橡膠、印染、制藥、塑料、合成樹脂等生產(chǎn)過程，苯胺是芳香胺類最有代表性的物質(zhì)，而聯(lián)苯胺及其衍生物則來(lái)源于各種染料及有機(jī)顏料，是染料工業(yè)的重要中間體[2?3]。苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物污染對(duì)水源環(huán)境及人們的生產(chǎn)生活易造成嚴(yán)重影響，因此需要建立健全苯胺類和聯(lián)苯胺類污染的監(jiān)測(cè)技術(shù)。

目前對(duì)于水體中芳香胺檢測(cè)的研究日益增多，主要分析方法有分光光度法[4?5]、氣相色譜法[6?7]、液相色譜法[8?9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10?11]、液相色譜-質(zhì)譜法[12?13]、毛細(xì)管電泳法[14?15]、電化學(xué)法[16]等。分析有機(jī)污染物常用的樣品處理方式有固相萃取法、液液萃取法，但是這兩種傳統(tǒng)方法普遍存在操作繁瑣、耗時(shí)、有機(jī)溶劑用量大的缺點(diǎn)。分散液相微萃取是Rezaee等人[17]在2006年提出的一種新型萃取技術(shù)，僅用極少的有機(jī)溶劑作為萃取劑，能夠集樣品萃取和富集過程于一體，省略了濃縮步驟，具有操作簡(jiǎn)便快速、富集效率高、萃取溶劑用量少和成本低等優(yōu)點(diǎn)，在液體樣品痕量污染物分析中具有較大的優(yōu)勢(shì)，逐漸應(yīng)用于環(huán)境樣本中芳香胺的富集與測(cè)定[18?22]，但這些方法均存在測(cè)定的芳香胺種類偏少[19?20]、定量方式多選用外標(biāo)法[21]、檢出限偏高[22]等缺陷。

筆者通過優(yōu)化分散液相微萃取過程中的各種影響因素，建立了以內(nèi)標(biāo)法定量的高通量檢測(cè)方法，成功將其應(yīng)用于水體中17種芳香胺類物質(zhì)的測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、檢出限低，為今后水體中芳香胺的快速定性定量分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀：Agilent 7890A-7000B型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

電子天平：BSA822型，感量為0.01 g，賽多利斯科技儀器(中國(guó))有限公司。

渦旋混勻儀：XW-80A型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

離心機(jī)：TGL16M型，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

12種芳香胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：含有苯胺、2-甲基苯胺、3-甲基苯胺、4-甲基苯胺、2，4-二甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、2-甲氧基苯胺、3-氯胺、4-氯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、3，3′-二氯聯(lián)苯胺，各組分質(zhì)量濃度均為10.000 g/L，溶劑為甲醇，批號(hào)為33347 TM (F0057292)，北京曼哈格生物科技有限公司。

1-萘胺、2-萘胺、2-硝基苯胺、4-氨基聯(lián)苯：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為98.8%、98.1%、98.5%、98.7%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer股份有限公司。

2-氯胺：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98.3%，北京曼哈格生物科技有限公司。

苯胺-d5標(biāo)準(zhǔn)溶液：2.000 g/L，溶劑為二氯甲烷，北京曼哈格生物科技有限公司。

苊-d10 標(biāo)準(zhǔn)溶液：4.000 g/L，溶劑為二氯甲烷，美國(guó)Accu Standard公司。

4-氯胺-d2：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98.6%，加拿大C/D/N ISOTopes公司。

4-甲基苯胺-d9、3-硝基苯胺-d4：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為98.5%、97.7%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 股份有限公司。

三氯甲烷、四氯化碳、N，N-二甲基甲酰胺、甲基叔丁基醚、硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇：均為色譜純，德國(guó)默克EMD Millipore公司。

高純氦氣：純度(體積分?jǐn)?shù))為99.999%，句容康泰特種氣體有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)制得的超純水。

1.2 溶液配制

3 種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：各組分質(zhì)量濃度均為5.000 g/L，分別準(zhǔn)確稱取4-氯胺-d2、4-甲基苯胺-d9、3-硝基苯胺-d4 各5 mg 于1 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。

5 種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：各組分質(zhì)量濃度均為100 mg/L，分別移取3 種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL、苯胺-d5 標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL 和苊-d10 標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μL于1 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。

5 種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：各組分質(zhì)量濃度均為2 mg/L，移取5種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 μL至1 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。

5 種苯胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：各組分質(zhì)量濃度均為5.000 g/L，分別準(zhǔn)確稱取1-萘胺、2-萘胺、2-氯胺、2-硝基苯胺、4-氨基聯(lián)苯各5 mg 于1 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。

17種芳香胺類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：各組分質(zhì)量濃度均為100 mg/L，分別移取12種芳香胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL 和5 種苯胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL 至1 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。

17種芳香胺類混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：各組分質(zhì)量濃度均為1 mg/L，移取17種芳香胺類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 μL至1 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，混勻。

17種芳香胺類系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取17 種芳香胺類混合標(biāo)準(zhǔn)使用液5.0、10.0、50.0、100、200 μL，置于盛有適量三氯甲烷的1.0 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至標(biāo)線，再分別向各容量瓶中加入5種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液20.0 μL，配制成目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度均分別為5.0、10.0、50.0、100、200 μg/L，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度均為40.0 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色譜柱：DB-35 MS 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為5∶1；進(jìn)樣體積：1.0 μL；柱溫：程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至130 ℃，然后以30 ℃/min 升溫至300 ℃，保持4 min；載氣：高純氦氣；柱流量：1.0 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子源：電子轟擊源(EI 源)；離子源溫度：300 ℃；離子化能量：70 eV；接口溫度：300 ℃；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min；數(shù)據(jù)采集方式：SIM模式；17種芳香胺的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 17種芳香胺的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品處理

采集水樣后，調(diào)節(jié)其pH 值約為11，移取10 mL水樣于15 mL離心試管中，加入0.10 g亞硫酸鈉，振搖使其完全溶解，用注射器分別將0.8 mL 乙腈和100 μL三氯甲烷迅速注入水樣中形成乳濁樣，渦旋混合60 s 后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，然后用微量注射器伸入試管底部準(zhǔn)確吸取50.0 μL 有機(jī)相，再加入5 種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 μL，混勻后上機(jī)分析。

1.5 測(cè)定方法

按照1.3 儀器工作條件，測(cè)定17 種芳香胺類系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)溶液上機(jī)分析，計(jì)算目標(biāo)物含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

選擇常用的兩種極性的石英毛細(xì)管色譜柱對(duì)17 種目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。第一種為弱極性的HP?5MS 柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，固定相為5%苯基-甲基聚硅氧烷；第二種為中等極性的DB-35MS 柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，固定相為35%苯基-甲基聚硅氧烷。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HP?5MS柱對(duì)同分異構(gòu)體的分離效果較差，尤其是2-甲基苯胺和4-甲基苯胺、2，4-二甲基苯胺和2，6-二甲基苯胺這兩對(duì)異構(gòu)體，無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，并且其余組分的色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，影響定量分析的準(zhǔn)確性；而DB-35MS柱則可以將17種目標(biāo)組分分離，并且色譜峰形更加對(duì)稱和尖銳，因此選用中等極性的DB-35MS 色譜柱。17 種芳香胺類和5 種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白地表水樣品及加標(biāo)地表水樣品總離子流圖如圖1所示。

圖1 17種芳香胺類和5種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白地表水樣品及加標(biāo)地表水樣品的總離子流圖

2.2 分散液相微萃取條件優(yōu)化

2.2.1 萃取劑種類及用量

萃取劑是影響萃取效率及回收率的重要因素，由于苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物屬于半揮發(fā)性極性物質(zhì)，因此萃取劑應(yīng)在中等極性的有機(jī)溶劑中選擇。實(shí)驗(yàn)考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚和乙酸乙酯5種溶劑對(duì)17種芳香胺類的萃取效果，結(jié)果表明：三氯甲烷、四氯化碳作為萃取劑離心后有機(jī)相的量較大，在水中損失較少；二氯甲烷因密度比三氯甲烷小，經(jīng)萃取、離心后有機(jī)相的量較小，損失較大并且不方便移取，操作誤差大；乙酸乙酯與甲基叔丁基醚因?yàn)槊芏容^水小，所以有機(jī)相在上層，同時(shí)由于有機(jī)相體積小，導(dǎo)致離心后上層有機(jī)相移取難度大。對(duì)比三氯甲烷和四氯化碳的萃取效率，使用三氯甲烷作為萃取劑，苯胺類回收率普遍較高，故選擇三氯甲烷為萃取劑。

分別以30、50、100、150、200 μL 三氯甲烷為萃取劑，考察目標(biāo)化合物的萃取效率。結(jié)果表明，當(dāng)萃取劑用量為30 μL 時(shí)，離心后試管底部幾乎沒有有機(jī)相，無(wú)法移??；當(dāng)萃取劑用量由50 μL 增加到100μL 時(shí)，17 種芳香胺類回收率有所增大；當(dāng)繼續(xù)增加萃取劑用量時(shí)，17 種芳香胺類回收率無(wú)明顯變化。萃取劑的體積與富集倍數(shù)成反比，體積越少可以獲得更高的富集倍數(shù)和更低的檢出限，故選擇萃取劑三氯甲烷用量為100 μL。

2.2.2 分散劑種類及用量

分散劑的作用是提高萃取劑與目標(biāo)物的接觸面積，形成較好的乳濁液體系，從而提高萃取效率。分別選取甲醇、乙腈、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、異丙醇作為分散劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用乙腈作為分散劑能夠與三氯甲烷形成良好的乳濁液，萃取效果最好，故選擇乙腈為分散劑。

固定萃取劑體積為100 μL，分別以0.2、0.4、0.8、1.0、2.0 mL 乙腈為分散劑，考察目標(biāo)化合物的萃取效率，結(jié)果表明，隨著分散劑乙腈用量的增大，各目標(biāo)物的萃取效率逐漸增大，當(dāng)乙腈用量為0.8 mL時(shí)，萃取效率達(dá)到最大。繼續(xù)增大乙腈用量時(shí)，萃取效率反而有所下降，原因是當(dāng)乙腈用量較少時(shí)，三氯甲烷未能在水中分散成細(xì)小液滴，導(dǎo)致與水接觸不完全，提取效率偏低；乙腈用量過大反而增加三氯甲烷在水中的損失，使得萃取劑體積變小，萃取效率下降，因此選擇0.8 mL乙腈作為分散劑。

2.2.3 還原劑種類及用量

苯胺類和聯(lián)苯胺類容易氧化，尤其是3，3′-二氯聯(lián)苯胺和萘胺受氧化作用較明顯，因此在萃取體系中加入還原劑來(lái)抑制氧化作用。分別選取硫代硫酸鈉、硫酸鈉、亞硫酸鈉作為還原劑，比較目標(biāo)化合物的回收率。結(jié)果表明，3 種還原劑中亞硫酸鈉對(duì)3，3′-二氯聯(lián)苯胺和萘胺均有較好的抑制氧化效果，能夠顯著提高萃取率，故選擇亞硫酸鈉為還原劑。

分別以0.00、0.05、0.10、0.30、0.50 g亞硫酸鈉為還原劑，比較目標(biāo)物的回收率，結(jié)果表明，當(dāng)亞硫酸鈉用量逐漸增大時(shí)，17種芳香胺類萃取效率總體趨勢(shì)為先增大后減小，在亞硫酸鈉加入質(zhì)量為0.10 g時(shí)，目標(biāo)物回收率達(dá)到峰值，繼續(xù)增加亞硫酸鈉用量，回收率輕微下降?？紤]到亞硫酸鈉的溶解度受溫度影響較大，固體加入越多溶解越困難，所以最終確定亞硫酸鈉加入質(zhì)量為0.10 g。

2.2.4 溶液pH值

芳香胺由于結(jié)構(gòu)中的氮原子存在孤對(duì)電子，因此易與酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的胺鹽，水溶性增強(qiáng)，用有機(jī)溶劑萃取時(shí)萃取效率較低。合適的pH 條件能夠使苯胺類物質(zhì)以分子形態(tài)轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，提高萃取效率。實(shí)驗(yàn)考查pH值分別為2、4、7、9、11條件下對(duì)目標(biāo)化合物的回收率，結(jié)果表明，當(dāng)溶液呈酸性(pH值小于7)時(shí)，大部分目標(biāo)化合物回收率低于10%，證明了酸性條件下無(wú)法有效提取絕大部分目標(biāo)化合物；當(dāng)溶液呈弱堿性時(shí)，除了3，3′-二氯聯(lián)苯胺外，其余組分回收率均在70%以上，當(dāng)溶液pH值為11時(shí)，目標(biāo)化合物整體回收率達(dá)到90%以上，表明目標(biāo)化合物在堿性條件下萃取效率高，因此萃取時(shí)需將水樣pH值調(diào)至11。

2.2.5 萃取時(shí)間

萃取時(shí)間是指將萃取劑/分散劑體系注入到樣品溶液中至離心的時(shí)間。萃取溶劑體系進(jìn)入樣品溶液中后，采用渦旋方式可使萃取劑快速在水相中形成大量微小液滴，以增大比表面積，從而使目標(biāo)物快速遷移至萃取溶劑中。分別設(shè)定渦旋振蕩時(shí)間為30、60、90、120、150 s，考察17種芳香胺的回收率，結(jié)果表明，當(dāng)渦旋振蕩時(shí)間超過60 s后，萃取效率不再有明顯增大趨勢(shì)，因此渦旋振蕩60 s 后即可直接進(jìn)行離心。

2.2.6 內(nèi)標(biāo)物選擇

本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)化合物種類較多，如果實(shí)驗(yàn)過程中使用的同位素內(nèi)標(biāo)物種類過多，會(huì)增加操作難度，同時(shí)成本也較高，對(duì)環(huán)境危害較大。考慮到目標(biāo)組分與同位素內(nèi)標(biāo)物最大程度的一一對(duì)應(yīng)，采用有代表性的5種同位素內(nèi)標(biāo)定量，具體定量?jī)?nèi)標(biāo)見表2。

表2 目標(biāo)化合物與定量?jī)?nèi)標(biāo)

2.3 線性方程與檢出限

按1.3儀器工作條件對(duì)17種芳香胺系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，以最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。采用空白低濃度加標(biāo)的方式計(jì)算方法檢出限，分別對(duì)0.12、0.20 μg/L的加標(biāo)樣品進(jìn)行萃取，對(duì)萃取液平行測(cè)定7次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照HJ 168—2020[23]計(jì)算各組分的方法檢出限，以4 倍檢出限作為定量限。17 種芳香胺質(zhì)量濃度范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限結(jié)果見表3。

表3 17種芳香胺質(zhì)量濃度范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限

2.4 準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)

對(duì)實(shí)際水樣分別添加低、中、高三個(gè)濃度水平的17種芳香胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見表4。由表4可知，3個(gè)添加水平下17種芳香胺的加標(biāo)回收率為77.2%～114%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～16.5%，表明該方法在不同添加水平下均有良好的重復(fù)性和回收率，方法的精密度和準(zhǔn)確度能夠滿足測(cè)試要求。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 方法比對(duì)

目前對(duì)水中苯胺類物質(zhì)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有HJ 822—2017《水質(zhì) 苯胺類化合物的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》和HJ 1048—2019《水質(zhì) 17種苯胺類化合物的測(cè)定 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法》，由于實(shí)驗(yàn)采用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，將該方法與HJ 822—2017標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行方法比對(duì)，驗(yàn)證該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法有無(wú)顯著性差異。按照兩種樣品處理方式分別對(duì)地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水進(jìn)行檢測(cè)，分別在4種類型水體中添加17種芳香胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)質(zhì)量濃度均為20 μg/L，采用t檢驗(yàn)比較方法的差異性[24]。對(duì)樣品質(zhì)量濃度增加量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算配對(duì)差值均值、標(biāo)準(zhǔn)差Sd和t值，結(jié)果見表5和表6。

表5 地表水和地下水中17種芳香胺測(cè)定方法比對(duì)結(jié)果(n=8)

表6 生活污水和工業(yè)廢水中17種芳香胺測(cè)定方法比對(duì)結(jié)果(n=8)

根據(jù)表5 和表6 匯總的結(jié)果，所有類型水體中17 種組分計(jì)算得到的t絕對(duì)值均小于2.365，即雙側(cè)檢驗(yàn)P＞0.05，因此對(duì)于檢測(cè)地表水、地下水、生活污水、廢水4種類型水體中的17種芳香胺，兩種方法無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了分散液相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水體中17種芳香胺類物質(zhì)的分析方法，采用三氯甲烷作為萃取劑、乙腈作為分散劑，在堿性條件下快速提取水中的芳香胺，對(duì)分散液相微萃取過程中影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得到較為滿意的檢出限、正確度、精密度，并將該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，采用t檢驗(yàn)驗(yàn)證，兩種方法沒有顯著性差異。該方法相比于標(biāo)準(zhǔn)方法，具有耗時(shí)短，試劑用量少，靈敏度高，回收率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于水體中芳香胺的快速檢測(cè)。