姜黃素納米乳的制備和藥動學及藥效學研究

駱錦前，王 婷，尤本明，陳方劍 （海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科, 上海 200433）

高脂血癥是指血液中脂質(zhì)水平異常，通常表現(xiàn)為總膽固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血癥是心腦血管疾病的重要危險因素，可誘發(fā)動脈粥樣硬化，導致冠心病、腦卒中、心肌梗死，增加心腦血管疾病的發(fā)病率和病死率。因此，預防和控制高脂血癥具有重要意義[2]。國內(nèi)外研究和臨床實踐證明，血脂異常是可以預防和控制的。膽固醇水平降低可顯著減少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活質(zhì)量，有效減輕疾病帶來的負擔[3]。據(jù)統(tǒng)計全球每年約有3 000 萬人死于高脂血癥等脂代謝紊亂疾病，且呈逐年增長趨勢[4]。

姜黃素是從姜科植物姜黃的干燥根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)[5]。它被認為是姜黃中最重要一類活性成分，具有一系列藥理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、細胞保護和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黃素對氧化應激、抑制癌癥和炎癥的進展有顯著療效[7]。此外，姜黃素的降脂作用也被廣泛研究。綜上所述，姜黃素可作為一種潛在的候選藥物用于控制高脂血癥所誘導的疾病，如動脈粥樣硬化。眾所周知，他汀類藥物是一種臨床常用的治療高膽固醇血癥和相關(guān)動脈粥樣硬化疾病的處方藥，而目前姜黃素已被證明在降低血漿總膽固醇和甘油三酯方面與他汀類藥物療效相當。然而姜黃素存在溶解度低和滲透差的問題，從而導致其口服給藥時藥物生物利用度低，對于高脂血、動脈粥樣硬化等需要達到一定血藥濃度為療效前提的病癥來說，姜黃素的傳統(tǒng)劑型與市售劑型均無法達到理想的治療效果。

本研究前期成功構(gòu)建了姜黃素納米乳口服給藥系統(tǒng)，改善了姜黃素水溶性差的特性。基于此，本文繼續(xù)探究了姜黃素納米乳在大鼠體內(nèi)的藥動學特性，觀察其對高脂血癥模型大鼠的治療作用，為姜黃素的臨床應用提供更多的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

101A-2 型干燥箱（上海實驗儀器總廠）；AG285十萬分之一電子分析天平（瑞士MettlerToledo 公司）；SB100D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1 100 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；Agilent 6 410 Triple Quad LC/MS（美國Agilent科技有限公司）；全自動生化分析儀Chemray 240（深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素原料藥（批號XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黃素對照品（批號1108135-201412，純度＞99.8 %，中國食品藥品檢定研究院）；1,2-丙二醇（批號20190418，上海凌峰化學試劑有限公司）；Tween-80（批號2018161，上海凌峰化學試劑有限公司）；丙二醇單辛酸酯（Capryol 90，批號18139，上海嘉法獅貿(mào)易有限公司）；高脂飼料（批號20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黃素片（批號20190925，美國自然之寶?股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批號J20190011，舒降之?杭州默沙東制藥公司）；TG 試劑盒（批號2020012）、TC 試劑盒（批號2020006）、HDL-c 試劑盒（批號2020003）、LDL-c 試劑盒（批號2020010，長春匯力生物技術(shù)有限公司）；SOD 試劑盒（批號20200617）；MDA 試劑盒（批號20200720）；肝臟勻漿TG 試劑盒（批號20200810）；肝臟勻漿TC 試劑盒（批號20 200 411，南京建成有限公司）；烏來糖（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA 有限公司）；水為重蒸水。

1.3 實驗動物

雄性SD 大鼠，SPF 級，體重（180±20）g，海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（滬）2019-0004。溫度：20～25 ℃；相對濕度：40 %～70 %；飲用水：高壓滅菌，符合SPF 級動物飲用水標準；光照條件：人工光線，12 h 照射，12 h 黑暗。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素納米乳的制備

姜黃素納米乳的處方如下：油相Capryol 90 在體系中占比為33.10 %，表面活性劑Tween-80 為34.16 %，助表面活性劑1,2-丙二醇為17.21 %，水相占比為15.52 %。制備方法為：精密稱取處方量油相Capryol 90、表面活性劑Tween-80 和助表面活性劑1,2-丙二醇，混合置于錐形瓶中，于45 ℃ 恒溫攪拌至全溶，稱取適量姜黃素原料藥，攪拌至原料藥完全溶解于上述體系中，冷卻至室溫后向體系中緩慢滴加蒸餾水至體系變?yōu)橥该骶鶆虻囊后w，即得姜黃素納米乳，測得載藥量為0.919 mg/g。對姜黃素納米乳進行特性表征，結(jié)果表明所制備的納米乳粒徑分布范圍窄且呈正態(tài)分布，平均粒徑為（123.5±1.2）nm，PDI 為(0.204±0.07)，表明該制劑的粒徑分布及均勻性均符合納米乳制劑要求。最優(yōu)處方制備的納米乳的透射電鏡如圖1 所示。結(jié)果表明，納米乳呈圓整均一的球體或類球體，具明顯層狀結(jié)構(gòu)，粒徑大小約為123.5 nm。

圖1 最優(yōu)處方納米乳的透射電鏡圖

2.2 血漿中姜黃素的LC/MS 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜質(zhì)譜條件[8]

色譜條件：色譜柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；進樣量：5 μl；柱溫：35 ℃。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源，正離子化模式，掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM 模式），干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：10 L/min，霧化壓力：35 psi，裂解電壓145eV，碰撞能量30 eV，定量離子對為m/z=369.3→286.4 和m/z=369.3→177.0。

2.2.2 方法學考察

取7 份大鼠空白血漿，每份600 μl，分別加入各濃度姜黃素標準品溶液 600 μl，渦旋震蕩2 min，再加入1 000 μl 甲醇及2 000 μl 乙腈沉淀蛋白，渦旋震蕩5 min，于4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min。上清液用氮氣吹干，1 000 μl 甲醇復溶，過0.22 μm針式微孔濾膜，所得濾液即加藥血漿樣品。同法處理空白血漿。按2.2.1 項下條件進樣測定，記錄色譜圖及峰面積。方法學考察表明，血漿中姜黃素在2.00～500.00 ng/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y= 411.32X+2 071.88（r= 0.999 9）。專屬性考察結(jié)果表明，血漿內(nèi)源物質(zhì)對姜黃素的含量測定沒有干擾，方法專屬性良好（結(jié)果如圖2）。低、中、高3 個濃度的姜黃素-血漿溶液的日內(nèi)精密度分別為0.54 %、1.21 %、0.93 %，日間精密度分別為0.91 %、0.76 %、0.42 %。3 個濃度血漿中的姜黃素提取回收率分別為72.9.2%、78.3%、80.2%，表明該方法可用于血漿中姜黃素的含量測定。

圖2 姜黃素血漿樣品的專屬性

2.3 姜黃素納米乳的藥動學研究

2.3.1 給藥方案

18 只大鼠隨機分為3 組（姜黃素原料藥組、姜黃素片劑組、姜黃素納米乳組），每組6 只，適應性飼養(yǎng)3 d 后，禁食不禁水12 h。3 組大鼠分別給予姜黃素原料藥混懸液（62.8 mg/kg，以姜黃素含量計算）、姜黃素片劑粉末混懸液（62.8 mg/kg，以姜黃素含量計算）各1 ml，姜黃素納米乳（31.4 mg/kg，以姜黃素含量計算）2 ml。于灌胃給藥后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h 時眼球后靜脈叢取血1 ml，置預肝素化離心管中，上下顛倒混勻后3 000 r/min離心15 min，上清液即為含藥血漿樣品。吸取含藥血漿樣品600 μl，照“2.2.2”項下方法處理，上清液照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。

2.3.2 藥動學參數(shù)計算

藥動學參數(shù)計算通過軟件Kinetica 5.0 對數(shù)據(jù)進行分析處理得到，計算結(jié)果如圖3 及表1 所示。結(jié)果表明，與原料藥相比，片劑的相對生物利用度為112.10 %，納米乳的相對生物利用度為313.47 %。與納米乳組相比，原料藥組的cmax為201.48 %，片劑組的cmax為193.02 %，且平均滯留時間（MRT）比原料藥組及片劑組更高（為原料藥組的183.52 %，是片劑組的154.21 %），表明納米乳組具有延緩藥物吸收的效果，從而在更大程度上發(fā)揮穩(wěn)定血藥濃度，提高藥物生物利用度的作用。

表1 各給藥組姜黃素的藥動學參數(shù)( ±s，n=6)

表1 各給藥組姜黃素的藥動學參數(shù)( ±s，n=6)

原料藥組片劑組納米乳組cmax (ng/ml)116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h)2.00±0.002.00±0.004.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml)1 151.12±125.77 1 341.34±103.59 2 914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1 202.71±115.28 1 348.77±131.39 3 770.15±333.28 t1/2 (t/h)6.66±0.337.52±0.5112.17±0.35 MRT(t/h)9.89±0.5911.77±0.3118.15±0.38

圖3 各給藥組姜黃素的血藥濃度-時間曲線 ( ±s，n=6)

2.4 藥效學研究

2.4.1 動物分組、造模及給藥

取SD 大鼠56 只，進行為期一周的適應性飼養(yǎng)后隨機分為空白對照組（n=8）和模型組（n=48），空白組飼喂正常飼料，模型組飼喂定制高脂飼料（飼料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，膽固醇1.25%，蔗糖12.5 %，膽鹽0.22 %）。整個造模周期為16 d，造模期間每日觀察各組大鼠的精神、活動、食量、排便量變化等。結(jié)束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后靜脈叢取血1 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min，取上層血清檢測各項生化指標（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。

造模成功后將上述模型組大鼠再隨機分為模型組、姜黃素片劑組、陽性藥（SV）組和姜黃素納米乳低、中、高劑量組，每組8 只?？瞻捉M（A 組）及模型組（B 組）給予生理鹽水5 ml/ (kg·d)；陽性藥組（C 組）給與辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量計）；姜黃素片劑組（D 組）給與姜黃素片 62.8 mg/(kg·d)（以姜黃素的含量計）；姜黃素納米乳低（E 組）、中（F 組）、高（G 組）3 組給藥劑量分別為15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黃素的含量計），連續(xù)21 天灌胃給藥。第21 天給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，于第22 天眼球后靜脈叢取血1 ml離心取血清待測。

2.4.2 統(tǒng)計學處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0 統(tǒng)計軟件進行處理，方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析，其中組間比較采用LSD 法，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；若方差不齊，采用非參數(shù)檢驗。實驗結(jié)果均以（±s）表示，P＜0.01 表示具極顯著性差異，P＜0.05 表示具顯著性差異。采用 GraphPad Prism 6 繪制圖表。

2.4.3 肝臟指數(shù)

大鼠頸椎脫臼處死，稱定體重后解剖取肝臟，冰PBS 洗凈血跡，稱定肝臟濕重并記錄，計算肝臟指數(shù)；肝臟指數(shù)=肝臟濕重/體重×100 %。

圖4 為給藥前后各組大鼠的體重變化。結(jié)果表明，給藥3 周后，與空白組相比，各組均存在極顯著性差異（P＜0.001）。給藥的前2 周納米乳組的體重均表現(xiàn)出正向增長趨勢，而模型組、陽性藥組以及姜黃素片劑組體重則呈現(xiàn)負增長情況；給藥第3 周時，僅姜黃素納米乳高劑量組的體重出現(xiàn)正向增長，陽性藥組以及姜黃素納米乳低、中劑量組大鼠體重降低幅度略有縮小但仍呈下降趨勢。

實驗結(jié)束后剖取大鼠肝臟，肉眼觀察到空白組大鼠的肝臟呈現(xiàn)出鮮紅色且有光澤，邊緣清晰銳利，質(zhì)地軟，與周圍組織無明顯黏連；模型組大鼠的肝臟肥大，色澤偏黃，邊緣圓鈍，質(zhì)地稍硬，且表面的白色沉積明顯，與周圍組織黏連明顯。各給藥組大鼠的肝臟比空白組略大，顏色呈不同程度的泛黃白帶紅，其中以姜黃素納米乳中劑量組肝臟的顏色與空白組最為接近。

肝臟濕重：如圖5 所示，除空白組外，各給藥組與模型組間均無顯著差異，但各給藥組肝臟濕重與空白組均具極顯著性差異（P＜0.001）；

圖5 肝臟濕重以及肝臟指數(shù)變化( ±s，n=8)

肝臟指數(shù)：如圖5 所示，除姜黃素納米乳低劑量組外，其他各給藥組與模型組之間均存在顯著性差異，表明肝臟指數(shù)的降低與藥物劑量間存在依賴性。陽性藥組和片劑組肝臟指數(shù)尚未恢復到正常水平，推測原因可能是陽性藥和片劑的給藥周期還不能完全抵消造模導致的肝臟增重所致。

2.4.4 HE 染色、油紅O 染色及病理切片

取肝臟左、右外葉上端分別于多聚甲醛中固定，脫水，切片，染色后置于光鏡下觀察。圖6 為肝臟的HE 染色切片。其中A 組肝細胞排列整齊，呈索狀，內(nèi)壁邊界清晰，無中性粒細胞浸潤，僅有零星小泡性脂肪病變；B 組視野內(nèi)可見明顯的彌漫性大泡性脂肪病變，肝細胞腫脹，胞漿基質(zhì)疏松，淡染，存在嚴重的氣球樣病變，可見Mallory 小體，肝小葉邊界不清，匯管區(qū)腫大，呈現(xiàn)中性粒細胞浸潤，存在重度的肝細胞脂變率；C 組和D 組以中輕度脂肪病變?yōu)橹?，脂肪細胞占比顯著減少；E 組匯管區(qū)細胞排列比C、D 兩組更為整齊，肝細胞整體腫脹程度減輕，大泡性脂肪病變僅存在于Ⅲ帶，炎性浸潤程度減輕，水樣病變減輕；F 組和G 組以小泡性脂變?yōu)橹鳎僖姶笈菪灾儭?/p>

圖6 各組大鼠肝臟病理切片H&E 染色(200×)

圖7 為油紅O 染色切片。A 組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核顏色明顯；B 組肝細胞存在大片鮮艷脂滴，細胞核萎縮、色淺，存在重度脂肪病變；C 組和D 組仍存在大片連續(xù)脂滴，但匯管區(qū)附近脂滴顏色明顯變淡；E 組Ⅲ帶脂滴色淺且小；F 組和G 組視野內(nèi)所見均為淺色小脂滴，細胞核體積趨向空白組細胞核體積。

圖7 各組大鼠肝臟病理切片油紅O 染色(200×)

2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c 的表達水平

第21 天給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22 天眼球后靜脈叢取血1ml，室溫靜置2 h后3 000 r/min 離心15 min 取血清，按試劑盒操作說明檢測血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c 的表達水平。

給藥3 周后，大鼠血清中各生化指標變化如表2 所示。與模型組相比，姜黃素納米乳低、中、高3 個劑量組對TC 降低效果均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），其中，以中劑量組為佳，低劑量組對LDL-c 的改善效果更為明顯。對于血清中TG、TC的改善情況，與陽性藥組相比，納米乳低、中、高3 個劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中、高劑量組TC 與HDL 比值的降低具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明血脂比存在納米乳劑量依賴性。

表2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c 的表達水平及TC/HDL-C 的變化趨勢( ±s，n=8)

表2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c 的表達水平及TC/HDL-C 的變化趨勢( ±s，n=8)

*P＜0.05，**P＜0.001，與空白組比較；#P＜0.05，##P＜0.001，與模型組比較

組別TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-c（mmol/L）LDL-c（mmol/L）TC/HDL空白組1.34±0.092.90±0.440.31±0.101.88±0.179.35±0.41模型組2.88±0.5112.45±0.131.84±0.103.56±0.666.77±1.14陽性藥組1.41±0.25##10.81±0.36##3.03±0.53#2.87±0.20##3.57±0.47姜黃素片劑組1.79±0.22##11.24±1.213.42±0.42#4.08±0.323.29±0.89姜黃素納米乳低劑量組1.29±0.20##8.88±0.73##2.39±0.62##2.85±0.33#3.72±0.57#姜黃素納米乳中劑量組1.44±0.04##7.68±0.34##1.94±0.78##2.57±0.823.96±0.36#姜黃素納米乳高劑量組1.38±0.28##8.89±0.64##1.83±0.34##2.85±0.674.86±0.49##

2.4.6 肝臟中TC、TG、MDA、SOD 的表達水平

將肝臟分為4 份，一份置于-80 ℃冷凍保存，一份按如下步驟處理后待測：冰PBS 沖洗肝組織表面血跡→研磨后制成10 %勻漿→離心→取上清液→測定各生化指標。

給藥3 周后大鼠肝臟勻漿中各生化指標表達水平如表3 所示。結(jié)果表明，模型組肝臟勻漿中TG、TC 表達水平的增幅與空白組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；給藥3 周后，陽性藥組和納米乳低、中劑量組的TG、TC 表達水平與模型組相比均有統(tǒng)計學差異（P＜0.001），姜黃素納米乳低、中、高3 個劑量對大鼠肝臟中TG、TC 表達水平的降低均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中，低劑量組效果最佳，這也與血清中TC 水平變化趨勢相一致。

表3 大鼠肝臟勻漿中TG、TC、SOD 以及MDA 的變化趨勢( ±s，n=8)

表3 大鼠肝臟勻漿中TG、TC、SOD 以及MDA 的變化趨勢( ±s，n=8)

*P＜0.05，**P＜0.001，與空白組比較；#P＜0.05，##P＜0.001，與模型組比較

組別TG（mmol/L）TC（mmol/L）SOD（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）空白組0.42±0.160.11±0.03956.31±142.640.47±0.06模型組0.69±0.05**0.09±0.02**769.26±141.64**##1.98±0.26**陽性藥組0.50±0.11*##0.7±0.01*##988.25±168.90##0.64±0.15*##姜黃素片劑組0.66±0.10**#0.04±0.01*##933.99±103.39#0.79±0.11**姜黃素納米乳低劑量組0.64±0.07**##0.06±0.02*##972.23±142.10##0.80±0.03**#姜黃素納米乳中劑量組0.58±0.05**##0.07±0.02**##916.55±117.32#0.59±0.09##姜黃素納米乳高劑量組0.54±0.13##0.10±0.03**799.81±121.85**0.70±0.23*##

超氧化物歧化酶（SOD）是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反應，保護細胞免受自由基的攻擊，明顯改善肝腎等組織的氧化損傷，能直觀的反映體內(nèi)抗氧化酶的活性[11]。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，反映了自由基的活躍程度，可用于評價機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[12]。因此，選擇SOD 和MDA 作為評價高脂血癥大鼠肝功能損傷程度的指標。

給藥3 周后，與模型組相比，陽性藥組及姜黃素納米乳低劑量組均能夠上調(diào)大鼠肝臟中SOD 的表達水平（P＜0.001），姜黃素納米乳中劑量組對其表達水平也有正向影響（P＜0.05）；此外，實驗中發(fā)現(xiàn)，與姜黃素納米乳低、中劑量組相比，高劑量組對體內(nèi)SOD 的表達呈現(xiàn)出抑制，推測此現(xiàn)象與姜黃素的雙向調(diào)節(jié)機制有關(guān)；對于MDA 的表達水平，與模型組相比，陽性藥組和姜黃素納米乳各劑量組對其表達的抑制作用均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），但效果仍以中劑量組為佳。

3 討論

姜黃素是一種被廣泛研究的中藥多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎和降血脂的藥理活性。已有報道將他汀類與姜黃素對于改善血脂的功效進行了比較。他汀類藥物是治療高膽固醇血癥和高脂血癥的一線藥物。研究表明，姜黃素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀類藥物在降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)方面最有效。姜黃素影響血漿脂質(zhì)改變的途徑與他汀類藥物相似[13]。幾乎所有膽固醇運輸?shù)耐緩蕉紩艿剿幬镏苿┑挠绊懀ㄎ改c道對膳食中膽固醇的吸收、肝細胞對血漿膽固醇的清除、膽固醇逆向運輸?shù)慕橘|(zhì)以及從外周組織中清除膽固醇。此外，姜黃素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂質(zhì)過氧化的風險，而脂質(zhì)過氧化會引發(fā)炎癥反應，導致心血管疾病(CVD)和動脈粥樣硬化[14]。綜上所述，姜黃素或可作為一種安全且耐受性良好的他汀類藥物輔助藥物，更有效控制高脂血癥。