水合氯醛有關(guān)物質(zhì)分析方法優(yōu)化與穩(wěn)定性檢測(cè)

宋開(kāi)超，方夏琴，李 鶴，郝玉梅，譚曉川，鄭穩(wěn)生 （北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所, 藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100050）

水合氯醛，又稱(chēng)水合三氯乙醛，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥等作用，臨床上以溶液口服或灌腸方式給藥。但水合氯醛穩(wěn)定性較差，臨床使用制成溶液制劑有效期很短，其主要的雜質(zhì)有三氯甲烷、甲酸、氯乙酸等，其中三氯甲烷是原料生產(chǎn)與儲(chǔ)存過(guò)程中比較重要的降解雜質(zhì)[1]。國(guó)內(nèi)較多數(shù)的文獻(xiàn)對(duì)水合氯醛及其制劑的穩(wěn)定性研究采用滴定法或紫外法[2-3]，此方法準(zhǔn)確度差，專(zhuān)屬性不足，不能準(zhǔn)確評(píng)估水合氯醛及其制劑的質(zhì)量狀況。目前，《中國(guó)藥典》以及國(guó)外各國(guó)藥典收載的水合氯醛及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)的檢查方法專(zhuān)屬性均較低[4-7]。

各國(guó)藥典中鑒別、酸度、熾灼殘?jiān)c溶液澄清度是水合氯醛藥物的基本理化分析項(xiàng)，醇合三氯乙醛則為控制本品合成過(guò)程中產(chǎn)生的一種雜質(zhì)。水合氯醛在生產(chǎn)、運(yùn)輸過(guò)程中可能產(chǎn)生的降解雜質(zhì)有甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等，現(xiàn)有的法定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)此部分降解產(chǎn)物未進(jìn)行控制，有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)存在缺失。本文旨在對(duì)主要降解產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，如甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸進(jìn)行檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)，其中，水合氯醛通過(guò)碳碳鍵斷裂降解成等比例甲酸、三氯甲烷，檢測(cè)甲酸或檢測(cè)三氯甲烷均可。

三氯甲烷主要采用氣相、氣質(zhì)色譜法[8-10]進(jìn)行檢查，氯乙酸等鹵代羧酸可采用液相色譜法和離子色譜法[11-13]分析，水合氯醛專(zhuān)屬性較強(qiáng)的檢測(cè)方法為氣相色譜法[10-14]。因鹵代羧酸具有沸點(diǎn)高、強(qiáng)極性特點(diǎn)，不易氣化，無(wú)法直接進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜分析，需進(jìn)行衍生化處理，故本文將鹵代羧酸檢測(cè)方法與三氯甲烷檢測(cè)方法分別開(kāi)發(fā)建立。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo trace 1300 GC（賽默飛氣相色譜儀）；電子天平 ME-204E（梅特勒科技）；三氯甲烷 （北京通廣試劑公司）；氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸（標(biāo)準(zhǔn)品，CATO）；正庚烷（fisher）；甲醇、硫酸、硫酸鈉；水合氯醛（青島宇龍海藻藥業(yè)，批號(hào)20190403）。

1.2 色譜條件

色譜柱溫：40 ℃保持3 min；以5 ℃/min 的速度升至80 ℃，以20 ℃/min 升至160 ℃，再以30 ℃/min升至250 ℃；進(jìn)樣口溫度：150 ℃；檢測(cè)器：ECD，溫度280 ℃；色譜柱：DB-5.625 30 m×0.25 mm，0.25 μm；進(jìn)樣體積1 μl。

1.3 供試品與對(duì)照品溶液配制

分別確定水合氯醛檢測(cè)三氯甲烷和鹵代羧酸的樣品處理方法，詳見(jiàn)表1。

表1 三氯甲烷與鹵代羧酸檢測(cè)樣品前處理方法

2 結(jié)果與討論

2.1 鹵代羧酸檢測(cè)分析方法驗(yàn)證

2.1.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照?qǐng)D1 方法，配制用于氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸檢測(cè)的對(duì)照品溶液，并按照“1.2 色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果如下。

圖1 衍生化方法GC 色譜圖

對(duì)照品溶液濃度分別為氯乙酸 9.95 μg/ml，二氯乙酸 13.49 μg/ml，三氯乙酸9.45 μg/ml，連續(xù)進(jìn)樣5 針，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的保留時(shí)間分別為4.33、5.89 和7.38 min，各峰面積RSD 分別為0.75%、1.00%、1.00%，滿(mǎn)足系統(tǒng)適用性要求。衍生化轉(zhuǎn)化目標(biāo)物更容易被氣化，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸經(jīng)衍生化后分別以氯乙酸乙酯、二氯乙酸乙酯、三氯乙酸乙酯形式被檢測(cè)。

2.1.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解稀釋制成濃度為10 μg/ml 的儲(chǔ)備液，分別取儲(chǔ)備液適量置具塞試管中，按照表1 衍生化處理后，取正庚烷層，即得各自的工作曲線(xiàn)樣品溶液，按照“1.2 色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)鹵代羧酸濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2，并按照信噪比大于3 和大于10 分別規(guī)定檢測(cè)限和定量限。

表2 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

將上述信噪比滿(mǎn)足定量限的各對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 針，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面積RSD 為別為5.27%、1.94%、1.15%，顯示各目標(biāo)物的定量限濃度下檢測(cè)精密度滿(mǎn)足要求（RSD＜15%）。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按表1 前處理方法進(jìn)行配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，平行取6 份供試品溶液，連續(xù)采集，記錄并計(jì)算各供試品溶液中氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的含量，氯乙酸均未檢出，二氯乙酸含量RSD 為4.43%，三氯乙酸含量結(jié)果RSD 為4.56%，按照本方法進(jìn)行鹵代羧酸含量檢測(cè)，含量結(jié)果RSD 均小于6%。按照《中國(guó)藥典》2020 年版“通則9 101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求[15]，本供試品中鹵代羧酸的含量（10 ppm）重復(fù)性要求RSD 小于6%。本方法重復(fù)性滿(mǎn)足要求。

2.1.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用加樣回收率進(jìn)行方法準(zhǔn)確度考察，精密稱(chēng)取10 mg 水合氯醛原料藥10 份，分別置10 個(gè)50 ml錐形瓶中，編號(hào)1～3 加入混合對(duì)照品溶液1.2 ml，編號(hào)4～6 加入混合對(duì)照品溶液1 ml，編號(hào)7～9 加入混合對(duì)照品溶液0.8 ml，上述混合對(duì)照品溶液中，氯乙酸濃度為 9.95 μg/ml，二氯乙酸 濃度為13.49 μg/ml，三氯乙酸濃度為9.45 μg/ml，第10 份不加混合對(duì)照品溶液，同步取樣混合對(duì)照品1 ml置50 ml 錐形瓶中，得到11 份樣品，按照表2 衍生化處理，取正庚烷層進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果如表3。

表3 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

按照本方法進(jìn)行鹵代羧酸含量檢測(cè)準(zhǔn)確度試驗(yàn)，回收率結(jié)果符合相關(guān)要求。按照《中國(guó)藥典》2020 年版“通則9 101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求，本供試品中鹵代羧酸的含量（10 ppm）回收率限度要求為80%～115%。本方法準(zhǔn)確度滿(mǎn)足要求。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下的各對(duì)照品溶液，分別于24 h內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面積RSD 分別為4.0%、2.1%、1.6%，表明本方法樣品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 三氯甲烷檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性考察

分別按照表1 中兩種前處理方式配制對(duì)照品溶液、供試品溶液。前處理1 測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖2，前處理2 測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖3。在上述色譜條件下，兩種前處理使用的正己烷和甲醇均不干擾三氯甲烷的測(cè)定，三氯甲烷保留時(shí)間約為2.5 min。

圖2 三氯甲烷檢測(cè)色譜圖(前處理1)

圖3 三氯甲烷檢測(cè)色譜圖(前處理2)

2.2.2 重復(fù)性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別按照前處理1 和前處理2 方法制備6 份供試品；另取三氯甲烷對(duì)照品適量，分別用甲醇溶解稀釋至60 μg/ml；用正己烷溶解稀釋至2 μg/ml。將以上供試品與對(duì)照品，按照“1.2 色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 三氯甲烷檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)

因水合氯醛對(duì)熱不穩(wěn)定，熔點(diǎn)低57 ℃，在高溫條件下碳碳鍵斷裂產(chǎn)生三氯甲烷和甲酸，直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣均可導(dǎo)致水合氯醛降解而使檢測(cè)結(jié)果偏高，不能反映其實(shí)際三氯甲烷含量。而且依據(jù)ICH Q3C（R6）殘留溶劑指導(dǎo)原則，三氯甲烷屬于藥品生產(chǎn)中應(yīng)限制使用的溶劑（二類(lèi)溶劑），其限度要求是60 ppm（即殘留上限0.006%），結(jié)合本品原料藥檢測(cè)結(jié)果與重復(fù)性結(jié)果，前處理方法2 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確真實(shí)。

連續(xù)進(jìn)樣5 針正己烷配制的三氯甲烷對(duì)照品溶液，峰面積RSD 為2.45%，表明本法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果良好。

2.2.3 線(xiàn)性與范圍

精密稱(chēng)取三氯甲烷對(duì)照品，用正己烷溶解稀釋至20 μg/ml，分別取其中0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 ml置10 ml 量瓶，用正己烷稀釋至刻度即得工作曲線(xiàn)樣品，按照“1.2 色譜條件”進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性方程Y=0.109 4X+0.022 2,r=0.999 8，表明三氯甲烷在濃度0.240 8～3.011 μg/ml 范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。將三氯甲烷對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)?.02、0.001 μg/ml 進(jìn)樣分析，信噪比分別為14 和4，分別為定量限和檢測(cè)限。

2.2.4 三氯甲烷檢測(cè)準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取水合氯醛原料藥，按表2 中前處理方法2 配制，平行9 份，編號(hào)1～3 加入0.6 ml 對(duì)照品溶液，編號(hào)4～6 加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 ml，編號(hào)7～9 加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.6 ml，分別置10 ml 離心管中，加入飽和氯化鈉0.5 ml，氯化鈉0.5 g，4.4 ml 正己烷，振搖溶解，靜置30 min，分別取正己烷層進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。

按照本方法進(jìn)行三氯甲烷含量檢測(cè)的準(zhǔn)確度試驗(yàn)，回收率符合《中國(guó)藥典》相關(guān)要求。

2.2.5 三氯甲烷檢測(cè)溶液穩(wěn)定性

取三氯甲烷對(duì)照品、水合氯醛原料藥，按表2中前處理方法2 進(jìn)行配制對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“1.2 色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，考察24 h 內(nèi)不同時(shí)間樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示供試品與對(duì)照品穩(wěn)定性均小于5.0%，穩(wěn)定性良好。

2.3 水合氯醛穩(wěn)定性試驗(yàn)

水合氯醛具有較強(qiáng)的揮發(fā)性與引濕性，在高溫條件下?lián)]發(fā)與降解性能均增強(qiáng)，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020 年版藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)技術(shù)要求，對(duì)本品進(jìn)行影響因素試驗(yàn)與加速試驗(yàn)考察。將水合氯醛置樣品瓶（封口）中，分別置溫度25 ℃/濕度75%，溫度40 ℃/濕度75%，溫度60 ℃/濕度60%以及溫度25 ℃/濕度60%、光照強(qiáng)度4 500 lx 條件下考察，并于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)雜質(zhì)含量變化，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 水合氯醛穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

以上數(shù)據(jù)顯示，水合氯醛原料受溫度和光照影響較大，主要的降解產(chǎn)物為碳碳鍵斷裂的水解產(chǎn)物三氯甲烷，鹵代羧酸未有明顯的改變。三氯甲烷是主要的降解產(chǎn)物，其中三氯甲烷為二類(lèi)毒性溶劑，但目前水合氯醛的國(guó)內(nèi)外法定標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)三氯甲烷的含量檢測(cè)和限度要求，且水合氯醛本身具有較大的毒性，則其降解產(chǎn)物的限度仍需結(jié)合長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果和臨床使用的安全性、有效性進(jìn)行綜合評(píng)估。另本次試驗(yàn)采用稱(chēng)量瓶封口存放，密封性不佳，會(huì)加速水合氯醛的揮發(fā)水解，本品應(yīng)室溫避光密封保存；在制劑研發(fā)和存儲(chǔ)運(yùn)輸過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制溫度與光照影響。

3 結(jié)論

本文建立了氣相色譜法測(cè)定水合氯醛原料藥中雜質(zhì)三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。利用檢測(cè)目標(biāo)物的理化性質(zhì)，采用不同前處理方法進(jìn)行三氯甲烷、鹵代羧酸的檢測(cè)，色譜峰形良好，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性良好，可避免水合氯醛檢測(cè)過(guò)程中的自身降解，準(zhǔn)確高效的檢測(cè)藥物中雜質(zhì)含量，滿(mǎn)足目前市售原料及其制劑的檢測(cè)需求。

本法中，三氯甲烷檢測(cè)限濃度為供試品濃度的萬(wàn)分之0.005（0.5 ppm）；氯乙酸檢測(cè)限濃度為供試品濃度的萬(wàn)分之0.1（10 ppm）；二氯乙酸檢測(cè)限濃度為供試品濃度的萬(wàn)分之0.2（20 ppm）；三氯乙酸檢測(cè)限濃度為供試品濃度的萬(wàn)分之0.04（4 ppm）。本品多次檢測(cè)以及穩(wěn)定性試驗(yàn)中均未出現(xiàn)氯乙酸，說(shuō)明本品中確無(wú)高于檢出限的殘留，也不易降解產(chǎn)生。

通過(guò)水合氯醛的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本品在溫度、光照條件下均會(huì)發(fā)生降解，三氯甲烷為主要的降解產(chǎn)物，故進(jìn)行本品相關(guān)制劑的研發(fā)、檢測(cè)、生產(chǎn)和運(yùn)輸過(guò)程中需要嚴(yán)格控制生產(chǎn)工藝與儲(chǔ)存條件，保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定，保障用藥安全性。