不同來源甘草地上部分黃酮類成分含量研究

劉 穎，薄穎異，張 志，侯冰燕，賈 棲，閆濱濱，王文全,4,5，侯俊玲,4*，彭一峰

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科，天津 301800；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100007；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；5.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；6.新疆全安藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 841000）

甘草為多年生豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat 或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖[1]。作為我國大宗藥材，市場需求量大[2]，其地上部分資源豐富，多種研究表明甘草地上部分中具有多種成分，包括黃酮類、多糖類、生物堿類及氨基酸類等[3-7]。其中，黃酮類成分含量高且具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化、降血糖等[8-14]。甘草主要產(chǎn)區(qū)有甘肅、內(nèi)蒙古、新疆等地[15-16]，甘草地上部分的器官主要有葉、莖、花、種子、果實等。對不同產(chǎn)區(qū)的甘草地上部分及甘草不同器官中黃酮類成分含量差異的研究尚未有報道，為探究不同產(chǎn)地之間甘草地上部分及甘草不同器官中黃酮類成分含量差異情況，本研究對內(nèi)蒙古杭錦旗、新疆阿勒泰、甘肅酒泉、吉林白城、陜西綏德五個產(chǎn)區(qū)的甘草地上部分及甘草地上部分不同器官中黃酮類成分進(jìn)行對比分析，以期為甘草地上部分資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV-6000PC 型紫外-可見分光光度計（上海佑科儀器有限公司）；KH-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；CP224C 型電子天平（奧豪斯上海儀器有限公司）；ACchromS6000 型高效液相色譜儀［華譜科技（香港）有限公司］；Agilent SB-C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）（美國安捷倫科技公司）；RE-5023 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；精宏DZF-6050 型真空干燥箱（上海和呈儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素（批號：Y25D551，純度 ≥ 98%），夏佛塔苷（批號：HA0828XA13，純度 ≥ 98%），異槲皮苷（批號：P25J9F65872，純度 ≥ 98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；氫氧化鉀和乙醇均為分析純。

1.3 藥材

實驗樣品為采收于不同產(chǎn)區(qū)的栽培品，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院王文全教授鑒定為豆科植物甘草G.uralensis的地上部分，經(jīng)自然陰干和磨粉機(jī)粉碎，過 40 目篩，于常溫干燥器內(nèi)貯存，備用。樣品信息見表1。

表1 甘草地上不同樣品信息Tab.1 Information on different samples of G.uralensis

2 方法

2.1 甘草地上部分總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品22.20 mg，以少量甲醇溶解，定容于100 mL 棕色容量瓶中，配制成濃度為0.222 mg/mL的對照品溶液，4℃冰箱冷藏保存。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取甘草地上部分粉末5.000 0 g，置于100 mL 錐形瓶中，提取溫度75℃，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲（功率：500 W）提取30 min，冷卻后70%乙醇補(bǔ)足失重，過濾，藥渣重復(fù)提取一次，合并濾液，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 和1.8 mL 的槲皮素對照品溶液于10 mL 容量瓶中，甲醇補(bǔ)足體積至2.0 mL，加入0.1 g/mL 氫氧化鉀溶液1.0 mL，充分搖勻，靜置5 min，用水定容至刻度，充分搖勻后于400 nm 處測定吸光度值。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，槲皮素溶液濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，用Excel 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]，得回歸方程Y=19.87X- 0.016 9 （r= 0.999 4）。

2.1.4 含量測定 精密吸取供試品溶液100 μL于10 mL 容量瓶中，用甲醇補(bǔ)足體積至2 mL，加入0.1 g/mL 氫氧化鉀溶液1 mL，充分搖勻，靜置5 min，加水定容，充分搖勻后于400 nm 波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中總黃酮含量。

2.2 甘草地上部分黃酮類成分含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取夏佛塔苷、異槲皮苷對照品適量，加70%乙醇制成濃度分別為1.67 mg/mL、1.66 mg/mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取甘草地上部分粉末1.000 0 g，置于10 mL 錐形瓶中，提取溫度75℃，加入70%乙醇溶液10 mL，超聲（功率：500W）提取30 min，70%的乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動相A，5 mL/L 甲酸水溶液為流動相B，按表2 中的梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫，檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL[18-19]。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Mobile phase gradient elution conditions

2.2.4 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系 精密吸取夏佛塔苷、異槲皮苷混合對照品溶液0.5、1、5、10、20 μL 進(jìn)行進(jìn)樣，測定峰面積值。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線：夏佛塔苷為Y= 142 264X+ 66 056（r= 0.999 6）、異槲皮苷為Y= 1371 214.777 8X+ 10 704.677 8（r=0.999 8）。

（2）精密度試驗 取樣品S2，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，夏佛塔苷、異槲皮苷的RSD 分別為1.88%、1.25%，表明該儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗 取樣品S2，按“2.2.1”項下樣品制備方法，平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.3”項下條件進(jìn)樣，記錄峰面積，夏佛塔苷、異槲皮苷的RSD 分別為2.37%、2.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗 取樣品S2，按“2.2.1”樣品制備方法制備供試品溶液，取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項下條件，分別于0、3、6、12、24、48 h 進(jìn)樣，記錄峰面積，夏佛塔苷、異槲皮苷含量的RSD 分別為2.15%、2.32%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（5）加樣回收率試驗 取樣品S2，精密稱定已知含量的甘草地上部分提取物粉末共6 份，分別加入相當(dāng)于樣品成分含量100%的夏佛塔苷和異槲皮苷對照品，按“2.2.1”項下方法制備，依法測定，得到夏佛塔苷和異槲皮苷的平均回收率分別為99.29%、100.13%，RSD 分別為1.18%、1.25%，表明該方法的回收率良好。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地甘草地上部分黃酮成分研究

3.1.1 不同產(chǎn)地黃酮類成分含量 按“2.1.3”項下方法制備供試品并進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。本批次樣本測量結(jié)果中甘肅酒泉樣品黃酮含量最高，達(dá)到42.81 mg/g，內(nèi)蒙古杭錦旗次之，為40.33 mg/g，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），陜西綏德次之，而新疆阿勒泰、吉林白城含量偏低，但也接近30 mg/g。

表3 不同產(chǎn)地甘草地上部分總黃酮含量結(jié)果（±s，n = 3）Tab.3 Results of total flavonoid content of G.uralensis in different planting areas（±s，n = 3）

表3 不同產(chǎn)地甘草地上部分總黃酮含量結(jié)果（±s，n = 3）Tab.3 Results of total flavonoid content of G.uralensis in different planting areas（±s，n = 3）

注：同列小寫字母不同，P ＜0.05。表8 同。

編號產(chǎn)地總黃酮含量/（mg/g）S1新疆阿勒泰27.24 ± 0.42c S2甘肅酒泉42.81 ± 4.75a S3內(nèi)蒙古杭錦旗40.33 ± 2.06a S4陜西綏德34.16 ± 3.03b S5吉林白城29.96 ± 2.16c F 10.747 P 0.001

3.1.2 不同產(chǎn)地HPLC 共有峰分析 取樣品S1 ～S5，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下條件進(jìn)行HPLC 檢測，所得HPLC 圖譜見圖1。繪制夏佛塔苷、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算5 個產(chǎn)地中兩者的含量，所得結(jié)果見表4。其中，不同產(chǎn)地的夏佛塔苷含量差別較大，新疆阿勒泰樣品含量最高為2.53 mg/g，甘肅次之，其余產(chǎn)地含量較低；異槲皮苷含量差別不大，主要穩(wěn)定在1.0 ～ 1.5 mg/g。對其余8個峰峰面積進(jìn)行比較分析見表5。由圖1 可知，新疆阿勒泰樣品峰4、峰5、峰6、峰7、峰9 數(shù)值缺失；甘肅酒泉樣品共有峰數(shù)值整體偏高，峰4、峰5、峰6、峰8、峰9 峰面積為五個產(chǎn)區(qū)中的最高值；內(nèi)蒙古杭錦旗樣品峰10 數(shù)值最高，其余共有峰峰面積均低于甘肅酒泉樣品；陜西綏德樣品峰7 數(shù)值稍高于其余四個產(chǎn)地，其余峰數(shù)值與內(nèi)蒙古杭錦旗樣品接近；吉林白城樣品峰4、峰5、峰6、峰9、峰10 數(shù)值缺失。以上數(shù)據(jù)表明，不同產(chǎn)地甘草地上部分中成分差異較大，其中，甘肅酒泉樣品成分種類較全面且含量較高。

圖1 不同產(chǎn)地甘草地上部分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC fingerprint map plot of the aerial parts of G.uralensis in different planting areas

表4 不同產(chǎn)地甘草地上部分定量物質(zhì)含量分析結(jié)果Tab.4 The quantitative analysis results on the content from the aerial parts of G.uralensis in different planting areas

表5 不同產(chǎn)地甘草地上部分共有峰峰面積分析結(jié)果Tab.5 The results of the peak areas on the aerial parts of G.uralensis in different planting areas

3.1.3 不同產(chǎn)地共有峰峰面積主成分分析 除上述兩個定量成分外，將其余8 個共有峰進(jìn)行主成分分析，所得各成分因子載荷矩陣見表6，主成分碎石圖和載荷圖見圖2。由圖2A 可知前2 個主成分特征值大于1，兩者累計貢獻(xiàn)率達(dá)到86.793%，因此選擇前2 個主成分對甘草地上樣品質(zhì)量進(jìn)行評價[20]。兩個主成分特征值及方差貢獻(xiàn)值依次降低，其中，第一主成分特征值為5.099，方差貢獻(xiàn)值為63.736%；第二主成分特征值為1.845，方差貢獻(xiàn)值為23.057%。由表6 和圖2B 可知，第一主成分中峰4、峰5、峰6及峰9 系數(shù)大，對第一主成分影響大。第二主成分中峰3 是主要決定因子。根據(jù)主成分Z1和Z2的貢獻(xiàn)率，可以得到主成分組合表達(dá)式Z= 0.637 36Z1+ 0.230 57Z2。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)中的 3σ 原則，運用公式Zt=H+Z（本文取H= 3）進(jìn)行坐標(biāo)平移以消除負(fù)數(shù)影響，得到不同產(chǎn)地甘草地上部分樣品各自的綜合評價得分Zt，結(jié)果見表7。由表7 可知，8 個共有峰含量在甘肅酒泉地區(qū)最高，新疆阿勒泰地區(qū)最低。通過對共有峰半定量分析，結(jié)合共有峰的主成分分析數(shù)據(jù)，共同表明甘肅酒泉黃酮類成分種類較全面且含量較高。

圖2 主成分碎石圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 Main component gravel diagram（A）and load diagram（B）

表6 甘草地上部分各成分因子載荷矩陣Tab.6 Component factor load matrix of the aerial parts of G.uralensis

表7 不同產(chǎn)地甘草地上部分樣品的主成分因子及綜合得分Tab.7 Principal component factors and composite scores of samples of aerial parts of G.uralensis from different planting aeras

3.2 不同器官中黃酮類成分的分析

3.2.1 不同器官中總黃酮含量 以S6 ～ S12 號樣品為研究材料，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液并進(jìn)行紫外檢測，所得總黃酮含量結(jié)果見表8。其中，葉和花蕾中黃酮類成分含量高，分別為39.12 mg/g 和36.48 mg/g。除葉和花蕾外，其余器官的總黃酮含量均較低。其中，莖的總黃酮含量最低，為3.96 mg/g，葉子和花蕾的總黃酮含量比其高至9 倍。

表8 甘草地上不同器官總黃酮含量結(jié)果（±s，n = 3）Tab.8 Results of total flavonoid content of different organs of the aerial parts of G.uralensis（±s，n = 3）

表8 甘草地上不同器官總黃酮含量結(jié)果（±s，n = 3）Tab.8 Results of total flavonoid content of different organs of the aerial parts of G.uralensis（±s，n = 3）

編號器官總黃酮含量/（mg/g）S6花蕾 36.48 ± 1.39a S7花 16.38 ± 2.64b S8嫩果 12.42 ± 0.94c S9果實 8.04 ± 0.89d S10種子 6.92 ± 1.07d S11莖 3.96 ± 1.16e S12葉 39.12 ± 2.46a F 226.469 P 0.000

3.2.2 不同器官中HPLC 共有峰成分分析 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.3”項下方法進(jìn)行檢測，所得HPLC 圖譜見圖3。按“2.2.4”項下夏佛塔苷及異槲皮苷的回歸曲線方法計算不同器官中夏佛塔苷及異槲皮苷的含量，結(jié)果見表9，其中甘草葉中夏佛塔苷及異槲皮苷含量均最高，分別為1.95 mg/g 和1.02 mg/g，而花蕾中兩者含量僅次于葉，其余含量均較低。對不同器官8 個共有峰峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果見表10，其中葉中除峰3 稍低于花、峰6稍低于花蕾外，其余峰峰面積均為所有器官中的最高值；在花蕾中，峰6 數(shù)值高于其他器官，峰3 和峰7數(shù)值稍低于花，其余峰數(shù)值均高于花；花中峰3 數(shù)值在所有器官中最高，峰10 缺失；嫩果中10 個峰均低于葉子和花蕾；莖和種子中整體峰數(shù)值較低，莖中只含峰6、峰8、峰9，且含量較低，種子中只含峰6、峰7、峰9，含量也較低。以上數(shù)據(jù)共同表明，在甘草地上部分中，葉所含成分種類及其含量均優(yōu)于其他器官，甘草葉的利用價值高。

圖3 甘草地上不同器官 HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of different organs of the aerial parts of G.uralensis

表9 甘草地上不同器官定量物質(zhì)含量分析結(jié)果Tab.9 The quantitative analysis results on the content from different organs of the aerial parts of G.uralensis

表10 甘草地上不同器官共有峰峰面積結(jié)果Tab.10 The results of the peak areas of different organs of the aerial parts of G.uralensis

4 討論

甘草地上部分含有豐富的黃酮成分，藥效價值高，不同產(chǎn)區(qū)的氣候和土壤環(huán)境影響甘草的生長[21-23]，同時也影響著甘草地上部分中黃酮類成分的積累，但目前不同產(chǎn)區(qū)對甘草地上部分中黃酮含量的影響相關(guān)研究報道較少，本研究通過對不同產(chǎn)地總黃酮含量、指標(biāo)性成分的定量分析及共有峰的半定量分析，結(jié)合共有峰中主成分分析的數(shù)據(jù)共同探究五個產(chǎn)區(qū)甘草地上部分黃酮類成分含量差異。結(jié)果表明，各個產(chǎn)地的黃酮類成分種類及含量存在差異，甘肅酒泉樣品黃酮類成分種類較全面且含量最高，其黃酮類成分累積量多，內(nèi)蒙古杭錦旗次之，結(jié)合兩地的產(chǎn)量，今后可對甘肅酒泉及內(nèi)蒙古杭錦旗兩個產(chǎn)區(qū)甘草地上部分進(jìn)行深入研究；新疆阿勒泰樣品總黃酮含量最低，但其夏佛塔苷含量為五個產(chǎn)區(qū)中含量最高；陜西綏德、吉林白城樣品中異槲皮苷含量高，可作為開發(fā)異槲皮苷系列產(chǎn)品的較佳產(chǎn)地。若對甘草地上部分開發(fā)利用，考慮到資源利用最大化，建議不對產(chǎn)地進(jìn)行限制。

甘草地上部分不同器官中黃酮類化合物含量差別較大，其中，甘草葉中黃酮含量高且種類全面，其所含黃酮成分種類及其含量均較優(yōu)于其他器官，花蕾與之不相上下，但花蕾的采摘對植物留種及后期的生長有著較大的影響，暫不予考慮。由于甘草莖葉為甘草地上部分原材料中主要的組成器官，產(chǎn)量較大，而甘草葉的黃酮含量為莖的9 倍，因此，甘草葉的開發(fā)利用價值更高，為提高甘草地上部分整體黃酮純度，應(yīng)提高所含葉的純度，去除較大的粗莖。

5 結(jié)論

本研究對五個產(chǎn)區(qū)甘草地上部分及其不同器官中黃酮類成分含量進(jìn)行了對比，揭示了不同產(chǎn)區(qū)及不同器官中黃酮類成分含量差異。其中，五個產(chǎn)區(qū)中甘肅酒泉樣品黃酮含量最高且種類全面，研究價值高，新疆阿勒泰可作為開發(fā)利用夏佛塔苷產(chǎn)品的產(chǎn)區(qū)。不同器官中葉的黃酮類成分含量最高，利用價值高。通過明確不同產(chǎn)區(qū)及不同器官中黃酮類成分含量差異，可為進(jìn)一步有針對性的利用甘草地上部分資源提供數(shù)據(jù)支撐，也為后期甘草地上部分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。